참외추출물이 스코폴라민 유도 기억상실 흰쥐의 인지능 회복에 미치는 효과 Cognition Enhancing Effect of Muskmelon (Cucumis melo) Extracts on Scopolamine-induced Memory Impairment in Mice원문보기
The methanol extract of muskmelon (Cucumis melo) has been investigated for its cognition enhancing effects by evaluation of inhibitory activities on acetylcholinesterase, a degrading enzyme of acetylcholine, a brain neurotransmitter, and ${\beta}$- secretase, which forms the ${\beta}...
The methanol extract of muskmelon (Cucumis melo) has been investigated for its cognition enhancing effects by evaluation of inhibitory activities on acetylcholinesterase, a degrading enzyme of acetylcholine, a brain neurotransmitter, and ${\beta}$- secretase, which forms the ${\beta}$-amyloid toxic protein from its precursor protein. A passive avoidance task, one of the animal model experiments for learning and memory, was also performed. As a result, the melon extract showed 15.8% and 35.3% inhibition on acetylcholinesterase and ${\beta}$-secretase, respectively, with a final concentration of 100 mg/ml. In the animal model test, melon extract significantly (p<0.05) lengthened the step-through latency time by 22.7% compared to the control group, suggesting that melon extract has, indeed, an effect on cognition enhancement.
The methanol extract of muskmelon (Cucumis melo) has been investigated for its cognition enhancing effects by evaluation of inhibitory activities on acetylcholinesterase, a degrading enzyme of acetylcholine, a brain neurotransmitter, and ${\beta}$- secretase, which forms the ${\beta}$-amyloid toxic protein from its precursor protein. A passive avoidance task, one of the animal model experiments for learning and memory, was also performed. As a result, the melon extract showed 15.8% and 35.3% inhibition on acetylcholinesterase and ${\beta}$-secretase, respectively, with a final concentration of 100 mg/ml. In the animal model test, melon extract significantly (p<0.05) lengthened the step-through latency time by 22.7% compared to the control group, suggesting that melon extract has, indeed, an effect on cognition enhancement.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
제안 방법
이러한 방법으로 training trial을 실시하여 120초간 쇼크실로 들어가지 않는 쥐는 실험대상에서 제외시켰다. Retention trial에서는 training을 받은 쥐에 대하여 24시간 후에 반복하여 실험하였으며 이 때는 쇼크실 도달시간(step-through latency time)을 최대 300초(cut-off time)까지만 측정하였다.
컴퓨터로 모니터링이 되는 측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 상자(shuttle box, 53 cmW × 44 cmH × 33 cmD)의 가운데에 guillotine door가 있으며 바닥(grid floor) 전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다. 각 실험군에는 추출물 500 mg/kg을 경구투여하였으며 양성대조약물로는 tacrine 2.5 mg/kg을 7일간 복강주사하였다. 마지막 투여 1시간 후, 기억상실약물인 scopolamine 1.
기질, Ellman 시약 및 시료(10, 20, 50, 100 mg/ml)를 포함한 반응용액을 항온조 내에서 4분간 항온하고 효소액(AChE 10 unit/ 10 µl)을 첨가하여 60초 동안 항온한 다음, 412 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5 mg/kg을 7일간 복강주사하였다. 마지막 투여 1시간 후, 기억상실약물인 scopolamine 1.0 mg/kg을 복강주사하고 30분 후에 실험을 실시하였다. 실험과정은 흰쥐를 1마리씩 한쪽 방에 넣고 15초간 탐색시간을 준 뒤, 위에서 조명과 소음을 가하면 가운데의 guillotine door를 통과하여 조용하고 어두운 옆의 쇼크실로 건너간다.
Scopolamine은 교감신경억제제로서 무스카린 수용체 길항제이며 콜린성 신경전달을 감소시켜 기억을 상실시키는 약물이다[13]. 본 실험에서는 실험의 정확도를 높이기 위하여 실험과정과 data를 컴퓨터로 control할 수 있는 avoidance test 기기를 사용하여 수동회피시험(passive avoidance task)을 실시하였다. 참외추출물을 흰쥐에 일주일간 투여한 후 시험한 결과, 실험군이 대조군에 비해서 쇼크실 이동시간(step-through latency time)이 유의적으로(p<0.
본 연구에서는 여러 가지 기억상실의 원인들 중에서 신경전달물질인 acetylcholine의 감소 및 뇌 독성 단백질의 생성에 초점을 맞추어 참외추출물의 acetylcholinesterase 억제활성을 측정하였고 β-amyloid 생성효소인 β-secretase 저해활성을 조사하였으며 동물모델 실험으로서 scopolamine으로 기억상실이 유도된 흰쥐를 이용한 수동회피시험(passive avoidance task)을 실시하여 참외추출물의 기억증진 효능을 검토하였다.
사육조건은 온도 22±2℃, 습도 50±2%, 그리고 명암은 12시간의 light/dark cycle을 유지하면서 사육하였다.
기질, Ellman 시약 및 시료(10, 20, 50, 100 mg/ml)를 포함한 반응용액을 항온조 내에서 4분간 항온하고 효소액(AChE 10 unit/ 10 µl)을 첨가하여 60초 동안 항온한 다음, 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 효소활성저해 효과는 시료검액 대신 동량의 완충액을 넣은 대조군의 흡광도(C.T.)와 시료검액을 넣어준 실험군의 흡광도(S.T.)를 이용하여 측정하였다. 이상의 실험을 3회 실시한 다음, 효소활성 저해율을 다음 식에 따라 산출하였다.
참외추출물이 in vitro에서의 효소활성도 시험에서 어느 정도의 효과를 나타내었으므로 기억증진효과를 동물모델시험에서 확인하였다. 실험동물을 이용한 학습과 기억증진효과 검색법에는 passive avoidance task [19], active avoidance task [7], water maze task [1], Y-maze task (spontaneous alternation behavior test) [14] 등이 있으며 이들 방법은 scopolamine으로 기억을 상실시킨 후, 약물의 기억증진효과를 보는 방법들이다.
대상 데이터
기억상실제인 scopolamine, 효소활성 측정용 시약인 acetylcholinesterase, DTNB (5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), acetylthiocholine iodide 및 양성대조 약물인 tacrine 등은 Sigma (St. Louis, MO, USA)사 제품을 사용하였으며 β-secretase 측정 kit는 PanVera Co. (Invitrogen, Madison, WI, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
실험동물은 미생물 monitoring에서 모두 음성을 나타낸 건강한 ICR (Institute of Cancer Research) 계 mouse (6주령) 중에서 25±3 g을 선별하여 사용하였으며 (주)대한바이오링크에서 구입하였다.
실험에 사용한 참외는 성주군 성주참외원예농협에서 구입하였으며 참외에서 과육을 분리하고 세절한 다음, l kg에 메탄올 500 ml를 가하고 가열하면서 추출하였다. 추출물을 여과한 여액을 rotary evaporator을 사용하여 농축하였으며 얻어진 조추출물을 동결건조기로 건조시켜 분말로 하여 각종 실험의 시료로 사용하였다.
실험에 사용한 참외는 성주군 성주참외원예농협에서 구입하였으며 참외에서 과육을 분리하고 세절한 다음, l kg에 메탄올 500 ml를 가하고 가열하면서 추출하였다. 추출물을 여과한 여액을 rotary evaporator을 사용하여 농축하였으며 얻어진 조추출물을 동결건조기로 건조시켜 분말로 하여 각종 실험의 시료로 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 data는 mean±S.E.로 표시하였으며 통계적 유의성은 Origin (Version 7.0) 프로그램을 이용하여 처리하였고 Student's t-test로 검정하여 P value로 나타내었다.
이론/모형
기타 유기용매는 모두 국산 특급을 사용하였다. 동물시험의 방법으로 사용한 수동회피시험(passive avoidance task)의 측정기기는 Gemini Avoidance System (San Diego Instruments, USA)을 사용하였고 흡광도는 Optizen 2120UV (Mecasys, Korea)로 측정하였으며 형광분석기(Fluorescence microplate reader)는 Gemini EM(Molecular Devices, USA)을 사용하였다. 실험동물은 미생물 monitoring에서 모두 음성을 나타낸 건강한 ICR (Institute of Cancer Research) 계 mouse (6주령) 중에서 25±3 g을 선별하여 사용하였으며 (주)대한바이오링크에서 구입하였다.
추출물 및 분획의 acetylcholinesterase (AChE) 억제 활성 측정은 Ellman's coupled enzyme assay 방법[3]을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
따라서 참외추출물은 Aβ plaque의 생성을 억제함으로서 Aβ에 의한 기억상실을 어느 정도 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
본 실험에서는 참외 추출물을 농도별로 사용하여 β-secretase 억제효과를 관찰한 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 용량의존적으로 효소활성을 억제함을 확인하였는데 최종 농도가 100 mg/ml일 때 35.3%의 억제활성을 나타내었다.
참외추출물을 흰쥐에 일주일간 투여한 후 시험한 결과, 실험군이 대조군에 비해서 쇼크실 이동시간(step-through latency time)이 유의적으로(p<0.05) 22.7% 늘어나 참외의 기억증진효과를 확인할 수 있었다(Fig. 3).
1). 치매치료제인 tacrine은 88.4%의 억제율을 보였다. Tacrine (9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine)은 AChE 저해제로서 간독성이 알려져 임상에서의 사용이 제한되어 있으나 동물실험에서는 positive control로 널리 사용하고 있다.
후속연구
참외의 주요 성분 중에서 cucurbitacin B와 E는 다양한 효능이 있음이 보고되어 있으나 기억증진과 관련하여 acetylcholinesterase 또는 β-secretase 활성검색이나 avoidance test 또는 maze test와 같은 동물모델실험에 관한 보고는 없다. 따라서 본 연구에서 확인된 참외의 인지기능 증진효과가 이들 성분에 의한 것인지 아니면 또 다른 주요 성분인 flavonoid 류에 있는지에 관해서는 후속 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
참외의 성분으로 어떤 것이 있는가?
참외의 성분으로는 cucurbitacin B와 E [2], 휘발성 향기성분[5], 페놀류[17] 및 flavonoid 류[16] 등이 알려져 있다. 기억은 경험을 유지하고 어떤 방법으로 이것을 재현하는 기능을 말하는데, 기억력을 포함한 인지능력의 저하는 학습저하, 사회활동 위축, 이로 인한 삶의 질 저하 등을 초래하므로 사회적으로도 크게 문제시 되고 있다.
참외추출물의 cucurbitacin 류의 효능은 무엇인가?
참외의 과육에 대해서는 동의보감에 煩熱을 除하며 소변을 利하게 하고 입과 귀의 부스럼을 다스린다고 되어 있다. 한편, 실험적으로 검증된 참외추출물 또는 주효능 성분인 cucurbitacin류의 효능으로는, 급성 간독성[24]이나 만성 간염[8]에 대한 간보호효과, 알코올성 간손상에 의한 황달 치료효과[21], 간암[8]을 비롯한 항암효과[20]와 항돌연변이효과[10], 면역증강효과[9], 이뇨효과[18], 항산화활성 및 항미생물활성[15], tyrosinase 저해활성[16] 및 trypsin 저해활성[6] 등의 다양한 효능이 보고되어 있으나 아직 본 연구와 관련된 기억증진효과에 관한 보고는 없다.
AChE의 in vitro 검정으로 참외 추출물의 AChE의 효소 활성 억제 측정 결과 어떤 효과를 보였는가?
이러한 빠른 효소반응은 생물학적 기질을 이용하여 in vitro에서 실험적으로 측정할 수 없기 때문에, AChE의 in vitro 검정은 상대적으로 반응속도가 매우 느리면서도 효소특이성을 지니고 있는 대체 기질인 acetylthiocholine을 이용하여 10∼20분 정도 반응시키도록 설계되었다. 참외추출물은 AChE의 효소활성을 용량 의존적으로 저해하였는데, 최종 농도 100 mg/ml에서 15.8%의 효소활성억제효과를 나타내었다(Fig. 1).
참고문헌 (25)
Brun, V. H., K. Ytterbo, R. G. Morris, M. B. Moser, and E. I. Moser. 2001. Retrograde amnesia for spatial memory induced by NMDA receptor- mediated long-term potentiation. J. Neurosci. 21, 356-362
Du, Q. Z., X. P. Xiong, and Y. Ito. 1995. Separation of cucurbitacin B and cucurbitacin E from fruit base of Cucumis melo L. by high-speed countercurrent chromatography. ACS Symposium Series, 593 (Modern Countercurrent Chromatography). American Chemical. Society 107-110
Ellman, G. L., K. D. Courtney, V. Andres Jr, and R. M. Featherstone. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95
Froelich, L. and P. Riederer. 1995. Free Radical mechanisms in dementia of Alzheimer type and the potential for antioxidative treatment. Arzneimittel-Forschung 45, 443-446
Kim, S. K., H. B. Park, Y. H. Kim, D. Y. Kim, and M. K. Kim. 1997. Volatile flavor components of oriental melon. Hanguk Wonye Hakhoechi 38, 33-38
Lee, C. F. and J. Y. Lin. 1995. Amino acid sequences of trypsin inhibitors from the melon Cucumis melo. J. Biochem. 118, 18-22
Lim, D. K., Y. H. Oh, and H. S. Kim. 2001. Impairments of learning and memory following intracerebroventricular administration of AF64A in rats. Arch. Pharm. Res. 24, 234-239
Liu, Y. and W. Liu. 1992. Pharmacological and clinical studies on cucurbitacins. Zhongcaoyao 23, 605-608
Liu, Y. and W. Liu. 1993. Immunopotentiating effects of cucurbitacin B in mice. J. Chinese Pharm. Sci. 2, 121-126
Ohara, A. and N. Hiramatsu. 1997. Antimutagenic activity in extracts of plant foods. Nippon Kasei Gakkaishi 48, 637-642
Park, I. H., S. Y. Jeon, H. J. Lee, S. I. Kim, and K. S. Song. 2004. Aβ-secretase(BACE1) inhibitor hispidin from the mycelial culture of Phelinus linteus. Planta Med. 70, 143-146
Polinsky, R. J. 1998. Clinical pharmacology of rivastigmine: a new- generation acetylcholinesterase inhibitor for the treatment of Alzheimer's disease. Clin. Therap. 20, 634-647
Sarter, M., G. Bodewitz, and D. N. Stephens. 1988. Attenuation of scopolamine-induced impairment of spontaneous alteration behaviour by antagonist but not inverse agonist and agonist beta-carbolines. Psychopharmacol. 94, 491-495
Shin, Y. S., J. E. Lee, I. K. Yeon, H. W. Do, J. D. Cheung, C. K. Kang, S. Y. Choi, S. J. Youn, J. G. Cho, and D. J. Kwoen. 2008. Antioxidant and antimicrobial effects of extract with water and ethanol of oriental melon (Cucumis melo L. var makuwa Makino). J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 51, 194-199
Shin, Y. S., J. E. Lee, I. K. Yeon, H. W. Do, J. D. Cheung, C. K. Kang, S. Y. Choi, S. J. Youn, J. G. Cho, and D. J. Kwoen. 2008. Antioxidant effects and tyrosinase inhibition activity of oriental melon (Cucumis melo L. var makuwa Makino) extracts. J. Life Sci. 18, 963-967
Singh, R. S. and J. S. Chohan. 1978. Total phenols in the fruits of cucurbits and their relation to development of charcoal rot. Indian Phytopathol. 31, 529-530
Singh, R. C. and C. S. Sisodia. 1970. Pharmacodynamic investigations into the diuretic activity of Cucumis melo seed (ether extract). Ind. J. Med. Res. 58, 505-512
Ukai, M., T. Kobayashi, N. Shinkai, X. Shan-Wu and T. Kameyama. 1995. Dynorphin A-(1-13) potently improves scopolamine-induced impairment of passive avoidance response in mice. Eur. J. Pharmacol. 274, 89-93
Wakimoto, N., D. Yin, J. O'Kelly, T. Haritunians, B. Karlan, J. Said, H. Xing and H. P. Koeffler. 2008. Cucurbitacin B has a potent antiproliferative effect on breast cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Sci. 99, 1793-1797
Wei, F., H. Qu, H. Wang, S. Yang, and Y. Chang. 2005. Protective effects of cucurbitacin B on the acute alcohol liver injured jaundice. Shipin Kexue (Beijing, China) 26, 487-489
Weldon, D. T., S. D. Rogers, J. R. Ghilardi, M. P. Finke, J. P. Cleary, E. O'Hare, W. P. Esler, J. E. Maggio, and P. W. Mantyh. 1998. Fibrillar beta-amyloid induces microglial phagocytosis, expression of inducible nitric oxide synthase, and loss of a select population of neurons in the rat CNS in vivo. J. Neurosci. 18, 2161-2173
Yamin, G., K. Ono, M. Inayathullah, and D. B. Teplow. 2008. Amyloid $\beta$ -protein assembly as a therapeutic target of Alzheimer's disease. Current Pharm. Design 14, 3231-3246
Yang, S., Y. Chang, L. Zheng, Z. Wei, H. Qu, and S. Cao. 2005. Protective effects of cucurbitacin B on the acute liver injury induced by $CCl_4$ . Shipin Kexue (Beijing, China) 26, 524-526
Zhu, Y., K. Xiao, L. Ma, B. Xiong, Y. Fu, H. Yu, W. Wang, X. Wang, D. Hu, H. Peng, J. Li, Q. Gong, Q. Chai, X. Tang, H. Zhang, J. Li, and J. Shen. 2009. Design, synthesis and biological evaluation of novel dual inhibitors of acetylcholinesterase and $\beta$ -secretase. Bioorg. Med. Chem. 17, 1600-1613
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.