[논문]분심기음(分心氣飮)의 도파민 세포 보호 효과

김로사; 이창훈; 이진무; 조정훈; 장준복; 이경섭

doi:10.15204/jkobgy.2009.22.2.119

분심기음(分心氣飮)의 도파민 세포 보호 효과
Neuroprotective Effects of Bunsimgieum 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.22 no.2, 2009년, pp.119 - 131

김로사 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실) , 이창훈 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실) , 이진무 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실) , 조정훈 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실) , 장준복 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실) , 이경섭 (경희대학교 한의과대학 한방부인과학 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: The depression accompanied with menopuase shows the relation with the dopamine secretion. These studies were undertaken to evaluate the anti- oxidative and neuroprotective effects of Bunsimgieum(BSGE) on dopaminergic neurons. Methods: To estimate the antioxidant effects, we carried out 1.1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid (ABTS) radical cation decolorization assay, and measurement of total polyphenolic content. To evaluate neuroprotective effect of BSGE in vitro, We performed thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) assay, reactive oxygen species (ROS) creation in SH-SY5Y. Tyrosine hydroxylase (TH) immunocytochemistry, nitric oxide (NO) assay, and TNF-${\alpha}$ assay in primary rat mesencephalic dopaminergic neurons. Results: The DPPH free radical and the ABTS radical cation inhibition activities were increased at a dose dependent manner. Total polyphenolic content was 0.83%. In SH-SY5Y culture, BSGE significantly increased the decreased cell viability by 6-OHDA at the concentrations of 10${\mu}$g/m${\ell}$ in pre-treatment group, 0.1-200${\mu}$g/m${\ell}$ in post-treatment group. The production of ROS induced by 6-OHDA was significantly inhibited in BSGE treated group. In mesencephalic dopaminergic cell culture, the BSGE group reduced the dopaminergic cell loss against 6-OHDA toxicity and the production of No and TNF-${\alpha}$ at the concentration of 5${\mu}$g/m${\ell}$. Conclusion: These results shows that BSGE has antioxidant and neuroprotective effects in the dopaminergic cells through decreasing the production of ROS, NO and TNF-${\alpha}$ which can cause many neurodegenerative changes in brain cell. We suggest that BSGE could be useful for the treatment of postmenopausal depression related with the decrease of dopamine.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

가 많으나 도파민 분비 뇌신경세포 보호 효과에 대한 연구는 없었다. 이에 저자는 分心氣飮의 항산화 효과 및 human neuroblastoma cell 및 태아 중뇌 세포에서 6-OHDA로부터 유도된 세포 독성에 대한 보호 효과를 알아보았다.
이에 저자는 分心氣飮의 항산화 효과와 SH-SY5Y human neuroblastoma cell 및 태아 중뇌 세포에서 6-OHDA로부터 유도된 도파민 세포 독성에 대한 보호 효과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

6-OHDA와 BSGE 처리 시기에 관계없이 SH-SY5Y 세포 보호 효과가 있는 0.1, 1 및 10㎍/㎖농도의 BSGE를 이용하여 6-OHDA에 의해 발생되는 ROS생성을 측정하였다. NOS (reactive nitrogen species)와 함께 세포가 산화적 스트레스 상태가 되면 증가하는 ROS는 생성 정도에 따라 세포의 산화적 손상 정도를 확인할 수 있는데³²⁾, 0.
96 well plate에 2.5×104/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후, 0.1, 1 및 10㎍/㎖ 농도의 BSGE 100㎕을 각각 6시간 처리하였다.
96 well plate에 2.5×10⁴/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후, 농도별 BSGE (0.1, 1, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖) 100㎕를 PBS에 녹여 24시간 동안 배양하였다.
96 well plate에 2.5×10⁴/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후, 농도별 BSGE (0.1, 1, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖) 100㎕와 6-OHDA를 처리하였다.
ABTS radical cation 소거능 측정을 위해 7mM ABTS와 2.45mM potassium persulfate를 혼합하여 상온 암실에서 24시간 반응시켰다. ABTS와 potassium persulfate 혼합액을 phosphate buffer saline (PBS pH 7.
BSGE의 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA에 대한 보호 효과를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. 6-OHDA는 세포내 ROS를 생성하여 산화적 스트레스 상태를 만들고²⁹⁾, 도파민 세포의 자가 산화를 자극하여 신경 생존에 중요한 역할을 하는 세포 분자들의 변성을 일으켜 세포를 퇴행시키는 신경 독성물질로 많이 사용되고 있다^29,30).
DPPH free radical 소거능 측정을 위해 0.2mM DPPH ethanolic solution 100㎕에 농도별 BSGE (1, 10, 100, 500 및 1,000㎍/㎖)를 100㎕씩 가하였다. 반응 30분 후 37℃에서 spectrophotometer(Versamax, Molecular Devices, Sunyvale, USA)를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였으며, DPPH free radical 소거능은 아래와 같이 계산하였다.
ELISA reader로 450㎚ 파장에서 0pg/㎖∼1,000pg/㎖의 TNF-α standard를 이용한 standard curve에 측정한 흡광도를 대입하여 TNF-α의 농도(pg/㎖)를 구하였다.
FBS가 없는 MEM에서 태아 중뇌 세포에 0.2, 1 및 5㎍/㎖의 BSGE를 가하고 6시간 배양 후 10µM의 6-OHDA를 처리하였다.
PBS로 세척 후, 200µM의 6-OHDA를 처리하여 15분, 30분 및 60분에서 fluorescence excitation 495㎚, emission 530㎚로 측정하였다.
SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA에 대한 ROS생성을 억제한 10㎍/㎖이하의 BSGE를 이용하여 primary culture를 시행하였다. TH-positive cell 측정은 도파민 세포 생성에 관여하는 TH를 염색함으로써 생존해 있는 도파민성 세포를 확인할 수 있다³³⁾.
태아 중뇌 세포에 1㎍/㎖, 5㎍/㎖의 BSGE 및 10µM의 6-OHDA를 처리하여 20시간 배양한 다음, 배양액 100㎕을 회수하여 Griess reagent 100㎕를 첨가하고 상온 암실에서 10분간 반응시켰다. Spectrophotometer를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrite를 이용해 표준 곡선을 그려 NO 농도를 결정하였다.
5㎎/㎖로 100㎕씩 처리하여 3시간 배양 후, 생성된 formazan을 DMSO로 녹여 15분간 shaking 하였다. Spectrophotometer를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며, cell viability를 무처치 control group에 대한 백분율로 표시하였다.
2㎖를 첨가하여 실온 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. spectrophotometer로 725㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 구하였다.
分心氣飮 한 첩(56g)에 증류수 560㎖를 가해 100℃, 2시간 환류추출 후 Whatman filter paper #2를 이용해 여과하였다. 여과액을 55℃에서 감압농축 (R-200; Buchi.
무작위로 4개의 조직을 선택하여 각 조직 당 9구역에서 현미경 (Axioskop 2; Carl Zeiss Inc., Göttingen, Germany)를 이용하여 세포 수를 계측 (100X) 후, 무처치 control group에 대한 백분율로 표시하였다.
2mM DPPH ethanolic solution 100㎕에 농도별 BSGE (1, 10, 100, 500 및 1,000㎍/㎖)를 100㎕씩 가하였다. 반응 30분 후 37℃에서 spectrophotometer(Versamax, Molecular Devices, Sunyvale, USA)를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였으며, DPPH free radical 소거능은 아래와 같이 계산하였다. control은 0분일 때의 값으로 하였다.
고 하였다. 연구에 사용된 分心氣飮은 흉부에 上衝하는 氣를 내리기 위해 桂枝²⁸⁾를 2g 加하여 君藥으로 사용하였다.
이 때 pre-treatment군은 농도별 BSGE를 21시간 처리 후 6-OHDA 200µM을 가하여 3시간 처리하였고, co-treatment군은 농도별 BSGE와 6-OHDA 150µM을 동시에 24시간 배양하였으며, post-treatment군은 먼저 6-OHDA 150µM을 3시간 처리 후 농도별 BSGE를 21시간 처리하였다.
1, 1, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖) 100㎕를 PBS에 녹여 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 1㎎/㎖를 처리하여 3시간 배양 후, DMSO로 생성된 formazan을 녹여 15분간 shaking하고, spectrophotometer로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. cell viability를 무처치 control group에 대한 백분율로 표시하였다.
총 폴리페놀 함량 측정을 위해 BSGE 10㎎/㎖를 증류수로 희석한 후, 2N folin 200㎕와 Na₂CO₃ 2㎖를 첨가하여 실온 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. spectrophotometer로 725㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 구하였다.
태아 중뇌 세포에 1㎍/㎖, 5㎍/㎖의 BSGE 및 10µM의 6-OHDA를 처리하여 20시간 배양한 다음, 배양액 100㎕을 회수하여 Griess reagent 100㎕를 첨가하고 상온 암실에서 10분간 반응시켰다.
, USA) 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA 방법을 실시하였다. 후 검정은 LSD를 실시하였으며 평균값의 유의성을 5% 미만의 한계로 조사하였다.
02가 되게 하였다. 희석 용액 950㎕에 1, 10, 100, 500 및 1,000㎍/㎖의 BSGE를 50㎕씩 가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후 spectrophotometer로 732㎚에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS radical cation 소거능은 아래와 같이 계산하였다.

대상 데이터

Orient Bio. (Osan, Korea)에서 14일된 Sprague-Dawley 태아를 구매하여 forceps으로 태아 중뇌 조직을 얼음 위에서 박리하고 10% FBS를 포함한 MEM에 모은 후, pipet을 이용하여 기계적으로 dissociation하였다. 조직에 trypsin을 처리하여 세포 수를 counting한 후, PLL로 미리 coating한 coverslip에 1.
American Type Culture Collection (Rockville, USA)로부터 human neuroblastoma cell인 SH-SY5Y를 분양받아, 60㎜ dish에서 10% (v/v) FBS, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM으로 37℃와 5% CO₂에서 배양하였다.
Neuroblastoma cell 보호 효과 연구에 사용한 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (이하 DMEM), minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum (이하 FBS), 1% penicillin/streptomycin 등은 Gibco Industries Inc. (Auckland, New Zealand)에서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (이하 MTT), 6-hydroxydopamine (이하 6-OHDA), 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H₂ DCF-DA), dimethyl sulfoxide (이하 DMSO) 및 Griess reagent 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다.
Primary culture에 사용한 para-formaldehyde (이하 PFA), poly-L-lysine (이하 PLL) 및 diaminobenzidine (이하 DAB) 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서, biotinylated anti-rabbit antibody, normal goat serum, avidin biotin peroxidase complex (이하 ABC) standard kit 등은 Vector laboratories (Burlingame, USA)에서, rat tumor necrosis factor-α (이하 TNF-α) ELISA kit는 Invitrogen Corp. (Carlsbad, USA)에서, tyrosine hydroxylase (이하 TH)-rabbit in goat primary antibody는 Chemicon International Inc. (Temecula, USA)에서 구입하여 사용하였다.
ROS는 H₂ DCF-DA를 사용해 fluorescence를 측정하였다. 96 well plate에 2.
실험에서 사용한 處方은 경희대학교 한의과대학 부속한방병원의 慶熙韓方處方集에 收載된 分心氣飮 (HK086)²⁰⁾을 따랐으며, 각 약재들은 경희대학교 한의과대학 부속한방병원 약제과에서 구입하여 사용하였고, 약재의 구성과 1貼의 분량은 Table 1과 같다.
항산화 효과 연구에 사용한 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (이하 DPPH), 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (이하 ABTS), potassium persulfate, tannic acid, folin 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.

데이터처리

결과 data는 Mean±S.E.M.으로 표시하였고 유의성 평가는 SPSS 12.0K for windows (SPSS Inc., USA) 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA 방법을 실시하였다.

성능/효과

1. BSGE의 DPPH free radical 소거능과 ABTS radical cation 소거능을 측정한 결과 농도 의존적으로 증가하였고, 총 폴리페놀 함량은 0.83%였다.
2. SH-SY5Y 세포에 농도별 BSGE를 처리한 결과 cell viability가 control group에 비하여 유의하게 감소하였다.
3. SH-SY5Y 세포에 농도별 BSGE와 6-OHDA를 처리 하고 pre-treatment, co-treatment 및 post-treatment로 나누어 관찰한 결과, pre-treatment는 10㎍/㎖농도, post-treatment는 모든 농도에서 유의하게 cell viability가 증가되었다.
4. SH-SY5Y 세포에 BSGE를 pre-treatment 하고 6-OHDA를 처리하여 ROS 생성 반응을 관찰한 결과, 모든 농도에서 유의하게 시간 경과에 따라 억제되었다.
5. 태아 중뇌 세포에서 6-OHDA에 의해 감소된 도파민 세포는 1㎍/㎖, 5㎍/㎖ 농도의 BSGE에서 유의하게 증가되었다.
6-OHDA에 대한 SH-SY5Y 세포보호 효과를 농도별 BSGE 처리 후 측정한 결과, pre-treatment군의 cell viability는 6-OHDA만 처리시 66.91%였고, 10㎍/㎖ 이하의 BSGE에서 증가된 cell viability를 나타내었으나 10㎍/㎖에서만 유의하게(p<0.01) 증가하였다.
6. 태아 중뇌 세포에서 6-OHDA에 의해 증가된 NO생성은 5㎍/㎖농도의 BSGE에서 유의하게 억제되었다.
7. 태아 중뇌 세포에서 6-OHDA에 의해 증가된 TNF-α는 5㎍/㎖농도의 BSGE에서 유의하게 억제되었다.
도파민 세포에 6-OHDA만 반응시켰을 때 NO생성이 증가되었다. BSGE를 처리한 후 6-OHDA를 반응시켰을 때 농도에 비례하여 NO생성이 억제되었는데, 5㎍/㎖ 농도에서만 유의하게 확인하였다. TNF-α는 염증 과정과 세포의 apoptosis를 조절하는 중요한 요소인데³³⁾, BSGE는 5㎍/㎖에서 6-OHDA에 의한 TNF-α생성을 억제하여 항염증 효과가 있음이 확인되었다.
BSGE의 6-OHDA에 의한 ROS 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 0.1, 1 및 10㎍/㎖농도의 BSGE를 pre-treatment하고, 6-OHDA를 처리하여 0분, 15분, 30분 및 60분 후 ROS생성을 측정한 결과, 6-OHDA만 처리한 경우 30분, 60분 후 control group에 비해 유의하게 (p<0.001) ROS생성이 증가하였으며, 농도별 BSGE를 pre-treatment하고 6-OHDA를 투여하였을 때 30분, 60분에서 6-OHDA만 처리하였을 때에 비해 ROS생성이 억제되었다(Fig. 5).
BSGE의 항산화 효과를 알아보기 위하여 ABTS radical cation 소거능을 측정한 결과, 1㎍/㎖ 농도에서는 25.38%, 500㎍/㎖ 농도에서는 93.67%, 1000㎍/㎖ 농도에서는 94.12%로 농도 의존적으로 소거능이 증가하였다(Fig. 2).
BSGE의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH free radical 소거능, ABTS radical cation 소거능을 측정한 결과 농도 의존적으로 증가하였고, BSGE 10㎎/㎖의 총 폴리페놀 함량은 0.83%로 BSGE이 free radicals를 제거하여 산화적 세포손상을 억제할 수 있었다.
DPPH free radical 소거능을 측정한 결과, 1㎍/㎖에서는 11.11%, 500㎍/㎖에서는 70.24%, 1000㎍/㎖에서는 89.22%로 농도에 비례하여 소거능이 증가하였다(Fig. 1).
Post-treatment군의 cell viability는 6-OHDA만 처리했을 때 45.40%였고, 모든 농도의 BSGE에서 유의한 (p<0.001, 단 200㎍/㎖에서는 p<0.01) cell viability 증가를 나타내었다(Fig. 4).
SH-SY5Y 세포 보호 효과를 알아보기 위해 0.1, 1, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖농도의 BSGE 처리 후 측정한 결과, control group의 cell viability 100%를 기준으로 0.1㎍/㎖에서 95.88%, 50㎍/㎖에서 92.05% 및 200㎍/㎖에서 83.40%로 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
SH-SY5Y 세포에 농도별 BSGE 단독 처리 시 농도비례로 cell viability가 감소하였다. SH-SY5Y 세포에 농도별 BSGE 와 6-OHDA를 함께 투여 시 pre-treatment 중 10㎍/㎖ 농도, post-treatment에서는 모든 농도에서 cell viability를 증가시켜 세포 보호 효과를 확인할 수 있었다.
TH-positive cell 측정은 도파민 세포 생성에 관여하는 TH를 염색함으로써 생존해 있는 도파민성 세포를 확인할 수 있다³³⁾. Sprague-Dawley 14일 태아 중뇌로부터 얻은 세포에 6-OHDA만 반응시켰을 때 TH-positive 세포 수가 유의하게 감소하였고, BSGE를 처리한 후 6-OHDA를 반응시켰을 때 농도비례로 TH-positive 세포 수가 유의하게 증가되었다.
태아 중뇌 세포를 이용하여 BSGE의 6-OHDA에 대한 세포 보호 효과를 관찰한 결과, 6-OHDA만 투여 시 37.63%에 비하여 0.2, 1㎍/㎖ BSGE에서 39.07%, 47.85%(p<0.01), 5㎍/㎖ BSGE에서 65.23% (p<0.001)로 농도 의존적으로 cell viability가 증가되었다(Fig. 6, 7).
태아 중뇌 세포에 BSGE와 6-OHDA를 처리 후 배양액 내 NO의 농도를 관찰한 결과, 6-OHDA만 투여 시 171.30%에 비하여 5㎍/㎖ BSGE에서 117.83%로 유의하게 (p<0.05) NO가 감소하였으며, 1㎍/㎖ BSGE에서는 감소하였으나 유의한 차이는 없었다(Fig. 8).
태아 중뇌 세포에 BSGE와 6-OHDA를 처리한 후 배양액 내 TNF-α의 농도를 관찰한 결과, 6-OHDA만 투여 시 5.01pg/㎖에 비하여 5㎍/㎖ BSGE에서 2.74pg/㎖로 유의하게 (p<0.05) TNF-α가 감소되었으며, 1㎍/㎖ BSGE에서는 감소하였으나 유의한 차이는 없었다(Fig. 9).

후속연구

이와 같이 갱년기 鬱火를 치료하는 BSGE가 항산화작용으로 도파민 세포보호 효과를 보였으며, 이를 통해 갱년기 여성의 신체적, 감정적, 인지적 증상의 치료 및 관리에 HRT를 대체할 약물 후보가 될 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	分心氣飮이란 무엇인가?	分心氣飮은 太平惠民和劑局方에 처음 記載된 處方으로 男子와 婦人의 一切氣不和를 치료하는 처방이다12).
	폐경의 증상은 무엇이 있는가?	2세2)로 인생의 30%이상을 폐경 상태로 지내게 되었다. 폐경 전후로 안면 홍조, 야간 발한, 불규칙한 생리, 질건조감, 우울증, 두통, 수면 장애, 무기력, 집중력 저하, 기억력 감퇴 등 다양한 증상을 경험하게 된다3).
	폐경 증상에 처방되는 약물은 무엇이 있는가?	이들 증상에 대하여 hormone replacement therapy (HRT)가 보편적으로 처방되어 왔고, 일부 항우울제들이 혈관 운동 증상을 포함한 갱년기 증상들을 경감시킨다고 보고되어4-6) 항우울제도 사용되고 있다6,7). 그러나 HRT의 위험성에 대한 보고8) 이후 이를 대체할 치료법에 대한 필요성이 대두되었다.

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Baker H, Joh TH, Reis DJ. Genetic control of number of midbrain dopaminergic neurons in inbred strains of mice: Relationship to size and neuronal density of the striatum. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77(7):4369-4373.

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Wilms H et al. Inflammation in Parkinson's diseases and other neurodegenerative diseases: cause and therapeutic implications. Curr Pharm Des. 2007;13:1925-1928.

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Dehmer T et al. Deficiency of inducible nitric oxide synthase protects against

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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