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문제 정의
- 일반적으로 반추동물의 반추위 내에서 각종 미생물의 성장을 보조하기 위해서 비타민 A를 추가로 필요로 하는지 정확히 인식되지 못하고 있으나, NRC에서는 기본적으로 비타민 A의 권장량을 제시하고 있으며 또한 사료 원료가 다양하게 공급되고 있는 현실을 감안하여 볼 때 비타민 A의 요구량도 급여사료의 종류에 따라 달라질 수 있다고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 사료의 종류에 따른 즉, 조사료 위주의 사료 급여 체계와 농후사료 위주의 급여 체계에 따른 비타민 A의 급여 효과 차이가 반추위내 미생물의 발효 성상에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하고자 하였으며 또한 제1위내에서 섬유소 분해 능력이 가장 왕성한 박테리아인 R. flavefaciens에서의 비타민 A 공급시 박테리아의 건물분해율, 가스생성량, 효소분해력 등을 조사하여 비타민 A가 반추동물의 반추위의 섬유소분해 박테리아에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 본 시험은 다당류 분해효소인 xylanase를 분석하기 위하여 수행하였다 (Miller 등, 1960). 배양액을 14,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층 액을 조효소로 이용하였다.
- 본 실험은 조농비율에 따른 반추위내 비타민 A (ROVIMIX, DSM Ltd.) 급여 효과의 변화를 평가하기 위해 실시하였다. 실험 1과 2에 사용한 비타민 A 첨가량은 두당 일일 요구량을 기준으로 (Requirement 100,000 IU/h/d, 1 IU = 0.
제안 방법
- R.F 균주에 비타민을 첨가한 후 0, 12, 24, 48, 72hr 동안 39℃ incubator에서 배양하였다.
- VFA 분석은 상층액 5 ml과 25% metaphosphoric acid와 희석 후 vial에 넣어서 -30℃의 냉동고에 보관 후 분석 시 저온에서 서서히 해동시켜 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후상층액을 Gas Chromatography용 vial에 넣어 GC (HP 6890 USA, 1998)를 이용하여 분석하였다.
- 공시균주를 배양한 후 30ml bottle에 1ml씩 각각의 DA medium에 접종하였다. Vitamin A의 첨가를 위해서 stock solution을 제조하고 0.1ml level, 0.2ml level 및 무첨가구의세 처리구로 구분하였다. R.
- , Ltd)에서 120rpm으로 교반 배양하였으며, 배양시간을 3, 6, 12, 24, 48h로 하였다. cellulose 소화율 측정을 위하여 Filter bag F57, (ANKOM Technology Ltd.)안에 cellulose micro granular (SIGMA Ltd.)를 1g 넣은 후 각각의 삼각플라스크 안에 넣고 시간별 배양 후 꺼내어 물로 세척한 뒤 60℃ drying oven에서 건조시킨 후 무게를 측정하였다.
- 각 배양시간 대별로 배양이 끝난 후 serum bottle을 실온에서 10분정도 온도를 안정시킨 후 가스발생량을 측정하였다. 가스발생 량은 Pipet을 이용하여 2개의 피펫을 스탠드에 고정시킨후 증류수를 채우고 한쪽 끝에는 고무호스를 연결하여 주사기 바늘을 꼽은 후 샘플에 넣었을 때 기압차로 물이 내려가 높이만큼을 읽어주어 측정하였다.
- 가스 발생량 측정법은 Williams 등 (1996)과 Beuvink와 Kogut (1993)의 방법을 이용하였다. 각 배양시간 대별로 배양이 끝난 후 serum bottle을 실온에서 10분정도 온도를 안정시킨 후 가스발생량을 측정하였다. 가스발생 량은 Pipet을 이용하여 2개의 피펫을 스탠드에 고정시킨후 증류수를 채우고 한쪽 끝에는 고무호스를 연결하여 주사기 바늘을 꼽은 후 샘플에 넣었을 때 기압차로 물이 내려가 높이만큼을 읽어주어 측정하였다.
- 활력 다당류 분해효소인 carboxymethyl cellulase (CMCase)를 분석은 Miller 등 (1960)의 방법으로 활력을 측정하였다. 각시간대별 배양액을 채취하여 14,00rpm에서 5분 동안 원심 분리 하여 조효소로 이용하였다. 0.
- 건물분해율의 측정은 배양 후 기질을 filter paper로 여과한 후 남은 잔기를 60℃ drying oven에서 48시간 이상 건조한 paper disc 기질을 dessicator에서 30분간 방냉시킨 후무게를 측정하여 배양 전과 배양 후의 무게 차에 의하여 구하였다. 가스 발생량 측정법은 Williams 등 (1996)과 Beuvink와 Kogut (1993)의 방법을 이용하였다.
- 공시기질로 filter paper (Whatman NO. 1)를 punching하여 지름 50mm로 만든 paper disk를 30ml serum bottle에 0.1g씩 첨가하여 사용하였으며 배지로는 탄수화물 공급원이 제거된 Dehority’s artificial medium (DA medium) (Dehority, 1963; Table 1)을 total volume에 맞게 넣어 사용하였다.
- 비타민은 필수영양소로서 가축에서도 비타민제의 사용의 필요성이 인식되고 있는 추세이나 반추동물에서는 아직 비타민의 활성기전 및 효과가 정확히 명시되어 있지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 연구는 실험 1에서 비타민 A를 조농비율을 다르게 한 사료로 첨가하여 반추위 내공급하였을 때 반추위 내의 pH, VFA 생성 및 cellulose 소실율 등에 어떠한 영향을 미치는지를 배양시간별로 조사 하였다. 실험 2에서는 반추위내 섬유소분해박테리아인 Ruminococcus flavefaciens를 사용하여 비타민 A의 추가 공급이 섬유소분해박테리아의 가스발생량, 효소활력 등에 영향을 미치는 지를 조사하였다.
- 배양 후 분석방법은 앞의 CMCase 분석방법과 같은 방법으로 분석하였으며 분석 후 기질로부터 유리된 화원당의 양을 xylose를 standard로 하여 μ㏖/min 단위로 환산하였다.
- 배양은 Tilly와 Terry (1963)의 방법에 따라 실시하였으며, 250 ml의 flask에 200 ml의 rumen inoculum을 주입하고, 준비된 사료를 rumen inoculum에 침지시켜 39℃ ±0.5로 설정된 항온 교반기 (Vision Co., Ltd)에서 120rpm으로 교반 배양하였으며, 배양시간을 3, 6, 12, 24, 48h로 하였다.
- 344㎍ Vit A-acetate) 하였으며 실험 처리구는 다음과 같다. 비타민 A 첨가량은 농후사료 함량에 따라 비타민 A의 요구량이 달라질 수 있다는 전제하에 처리구별 첨가량을 달리하였으며 동물의 비타민 A 요구량 이상으로 충분하게 처리하였다.
- ) 급여 효과의 변화를 평가하기 위해 실시하였다. 실험 1과 2에 사용한 비타민 A 첨가량은 두당 일일 요구량을 기준으로 (Requirement 100,000 IU/h/d, 1 IU = 0.344㎍ Vit A-acetate) 하였으며 실험 처리구는 다음과 같다. 비타민 A 첨가량은 농후사료 함량에 따라 비타민 A의 요구량이 달라질 수 있다는 전제하에 처리구별 첨가량을 달리하였으며 동물의 비타민 A 요구량 이상으로 충분하게 처리하였다.
- 이는 사료내 농후사료 함량이 높을수록 비타민 A의 필요성이 더 증가한다고 추정할 수 있다. 실험 2에서 섬유소분해박테리아 균별 비타민 A 첨가 효과를 보기 위하여 Ruminococcus flavefaciens의 Vitamin A 이용성을 가스발생량, 효소활력 등을 조사하였다. R.
- 따라서 본 연구는 실험 1에서 비타민 A를 조농비율을 다르게 한 사료로 첨가하여 반추위 내공급하였을 때 반추위 내의 pH, VFA 생성 및 cellulose 소실율 등에 어떠한 영향을 미치는지를 배양시간별로 조사 하였다. 실험 2에서는 반추위내 섬유소분해박테리아인 Ruminococcus flavefaciens를 사용하여 비타민 A의 추가 공급이 섬유소분해박테리아의 가스발생량, 효소활력 등에 영향을 미치는 지를 조사하였다.
- 증류수로 각각의 tube에 4.2ml씩 첨가하여 희석시킨 후 550nm에서 spectro-photometer를 이용하여 흡광도(OD값)를 측정하여 기질로부터 유리된 환원당의 양을 glucose를 standard로하여 μ㏖/min/1ml 단위로 환산하였다.
대상 데이터
- Rumen inoculum은 경기도 천안시 성환 축산연구소에서 반추위 누관이 장착된, 조사료를 무제한 급여한 거세우 수소 Holstein에서 채취하였다. 채취한 반추위 내용물을 4 겹의 Gauze로 걸러 보온병에 담아 실험실로 운반하였으며, 7겹의 Gauze로 다시 여과하였고, 배양개시 30분전 반추위 내용물과 CO2 bubbling 으로 pH 7.
-
(2) 공시균주, 사용배지 및 공시기질
공시균주로는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입한 Ruminococcus flavefaciens (ATCC NO.19208, RF))를 이용하였다. 공시기질로 filter paper (Whatman NO.
- 본 실험에 사용된 공시 사료로 농후사료는 육성우 사료 (양주축협)를 사용하였고, 조사료는 볏짚을 사용하였으며 실험 개시 전 Wiley mill로 분쇄하여 2 mm로 screening하여 사용하였다. 배양은 Tilly와 Terry (1963)의 방법에 따라 실시하였으며, 250 ml의 flask에 200 ml의 rumen inoculum을 주입하고, 준비된 사료를 rumen inoculum에 침지시켜 39℃ ±0.
- 본 실험에 사용한 농후사료 및 볏짚의 성분으로 조단백질 각각 17.07, 4.16% 이었으며 조섬유 3.10, 28.30%, 조지방 4.02, 1.54% 조회분 6.77, 11.28%, NDF 31.10, 66..50%, ADF 15.26, 47.13%이었다(Table 2).
- 본 실험에는 retinol (99%; FLUKA ,Japan)를 실험 재료로 사용하였다. 실험에 사용되어질 retinol 첨가량은 실험 1과 같은 조건으로 두당 일일 요구량을 기준으로 (Requirement 100,000 IU/h/d, 1 IU = 0.
- 실험에 사용되어질 retinol 첨가량은 실험 1과 같은 조건으로 두당 일일 요구량을 기준으로 (Requirement 100,000 IU/h/d, 1 IU = 0.344 ㎍) 하였으며 retinol 0.375 μg /0.1 ml을 만들어 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험의 결과로 얻어진 자료에 대한 통계처리는 SAS(Statistical Analysis System, 1996) package의 GLM(General Liner Model)을 이용하여 분산분석을 실시하였다. 각 처리 평균에 대하여 Ducan의 다중검정법(1955)을 이용하여 유의수준 95% 수준에서 처리간 비교하였다.
- 본 실험의 결과로 얻어진 자료에 대한 통계처리는 SAS(Statistical Analysis System, 1996) package의 GLM(General Liner Model)을 이용하여 분산분석을 실시하였다. 각 처리 평균에 대하여 Ducan의 다중검정법(1955)을 이용하여 유의수준 95% 수준에서 처리간 비교하였다.
이론/모형
- 건물분해율의 측정은 배양 후 기질을 filter paper로 여과한 후 남은 잔기를 60℃ drying oven에서 48시간 이상 건조한 paper disc 기질을 dessicator에서 30분간 방냉시킨 후무게를 측정하여 배양 전과 배양 후의 무게 차에 의하여 구하였다. 가스 발생량 측정법은 Williams 등 (1996)과 Beuvink와 Kogut (1993)의 방법을 이용하였다. 각 배양시간 대별로 배양이 끝난 후 serum bottle을 실온에서 10분정도 온도를 안정시킨 후 가스발생량을 측정하였다.
- 공시 사료의 분석은 AOAC (1990)의 방법에 준하여 사료의 조성분을 분석하였고, 반추위액의 pH 측정은 pH meter (HM-30G Japan, 2002)를 사용하여 측정하였다. VFA 분석은 상층액 5 ml과 25% metaphosphoric acid와 희석 후 vial에 넣어서 -30℃의 냉동고에 보관 후 분석 시 저온에서 서서히 해동시켜 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후상층액을 Gas Chromatography용 vial에 넣어 GC (HP 6890 USA, 1998)를 이용하여 분석하였다.
- 활력 다당류 분해효소인 carboxymethyl cellulase (CMCase)를 분석은 Miller 등 (1960)의 방법으로 활력을 측정하였다. 각시간대별 배양액을 채취하여 14,00rpm에서 5분 동안 원심 분리 하여 조효소로 이용하였다.
성능/효과
- Acetate 생성량은 처리구간 대부분의 배양시간에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 6hr 및 12hr 배양 후에는 비타민 A 첨가구가 더 높은 경향을 보였다.
- Table 5에서는 섬유소 분해력을 가지고 있는 혐기성 박테리아의 CMCase 및 xylanase 효소의 활력을 측정하였다. CMCase 효소의 활력은 전체적으로 볼 때 대조구와 처리구 간에 비슷한 경향을 나타내었고 배양시간이 경과함에 따라 점차적으로 증가하였다. Retinol 첨가구인 1 level과 2 level에서도 비슷한 경향을 나타내었으나 72hr에 2 level에서 유의하게 증가하였다 (P<0.
- 05). acetate 및 propionate 생성량도 고농후사로인 H와 HV에서 저농후사료인 L과 LV 보다 대부분의 배양시 간대별로 대체적으로 높은 경향을 보였다. 비타민 A의 첨가 효과는 고농후사료에서는 total VFA 생성량이 6hr 및 12hr대를 제외한 3hr, 24hr 및 48hr 배양 후 무첨가구보다 유의하게 높았으며 (P<0.
- 비타민 A 첨가시 반추위내 pH 및 cellulose 소화율의 변화는 Table 3에서 보는 바와 같다. pH는 전체적으로 실험 개시부터 종료까지 배양시간이 경과함에 따라 모두 감소 하는 경향을 나타내었으나 전반적으로 일반적인 반추위내 pH보다 다소 낮은 pH를 보였다. 처리구별 및 배양시간별 pH의 변화는 고농후사료에서 전체적으로 배양시간이 지날 수록 감소하였으며 저농후사료 역시 고농후사료 보다는 pH가 높은 경향으로 배양시간이 지날수록 감소하였으나 비타민 첨가와 무첨가 처리구 간에 큰 차이는 없었다.
- 건물분해율도 배양시간이 경과함에 따라 증가하 였으나 대조구와 처리구간에는 유의적 차이가 없었다 (P>0.05).
- 05) 높았으나 나머지 배양시간대에서는 통계적인 차이를 보이지 못하였다. 결국, 본 실험에서의 비타민 A 첨가는 저농후사료보다는 고농후사료에서 휘발성지방산 생성이 더 증가한 점으로 보아, 이는 사료내 농후사료 함량이 높을수록 비타민 A의 필요성이 더 증가한다고 할 수있다. 또한 본 실험의 고농후사료구는 비타민 A 첨가량이 0.
- 고농후사료인 H와 HV의 total VFA 생성량이 저농후 사료인 L과 LV 보다 모든 배양시간대별로 유의하게 높았다 (P<0.05).
- 발효시간에 따른 반추위내 cellulose 소화율의 변화는, 배양개시 후 3hr에는 HV, H, LV 및 L 각각 8.58, 3.85, 8.64 및 3.70%로 비타민 A를 첨가한 처리구에서 무첨가구보다 유의하게 높은 소화율을 보였다 (P0.05).
- 05). 본 실험의 결과는 반추위내 비타민 A 의 공급이 배양초기에 (12시간 이내) 미생물의 성장에 영향을 주어 cellulose 소화율이 증가하는 것으로 나타났다. 이것은 배양후기 (24hr 이후)의 pH가 전반적으로 너무 낮아져 섬유소분해 박테리아가 섬유소분해능력을 상실하였기 때문이라고 할 수 있으며 특히 이는 배양초기 섬유소 분해박테리아의 활력이 높을 때 비타민 A의 요구량이 높다고도 추정할 수 있다.
- 실험 1의 결과 pH는 저농후사료구에서 고농후사료구보다는 높은 경향이 있었으며 Cellulose 소화율은 전반적으로 뚜렷하지는 않았지만 배양초기에 비타민 A 첨가군에서 무첨가군보다 높았고 휘발성지방산의 생성량도 비타민 A 추가 공급시 증가하는 결과가 나타났다. 비타민 A 공급에 따른 Total VFA 생성량은 저농후사료구에서보다 고농후사 료구에서 더욱 분명하게 대부분의 배양시간대별로 비타민 A 첨가구에서 유의하게 높았다. 이는 사료내 농후사료 함량이 높을수록 비타민 A의 필요성이 더 증가한다고 추정할 수 있다.
- 비타민 A의 첨가 효과는 고농후사료에서는 total VFA 생성량이 6hr 및 12hr대를 제외한 3hr, 24hr 및 48hr 배양 후 무첨가구보다 유의하게 높았으며 (P<0.05) acetate, propionate 및 butyrate 생성량도 이와 같은 경향을 보였다.
- 실험 1과 실험 2의 결과를 종합하여 볼 때 실험 2는 섬유소분해박테리아인 R.F. 균주는 비타민 A를 필요로 하지 않으나, 실험 1의 rumen inoculum을 이용한 in vitro 배양 실험 결과 농후사료 함량이 높고 비타민 A를 첨가한 HA 구에서 배양초기에 cellulose 소화율 및 VFA 생성량이 높게 나타난 것으로 보아 R.F. 이외의 반추위내 다른 섬유소 분해박테리아가 비타민 A를 이용하였다고 사료된다.
- 실험 1의 결과 pH는 저농후사료구에서 고농후사료구보다는 높은 경향이 있었으며 Cellulose 소화율은 전반적으로 뚜렷하지는 않았지만 배양초기에 비타민 A 첨가군에서 무첨가군보다 높았고 휘발성지방산의 생성량도 비타민 A 추가 공급시 증가하는 결과가 나타났다.
- 05). 이러한 결과를 볼 때 각 섬유소분해균주별로 Vitamin A를 추가 공급할 때 gas 발생율 및 건물분해율에는 영향을 주지 않았다고 사료된다. 일반적으로 반추위 미생물은 비타민 B군을 이용하여 체합성 및 성장유지를 할 수 있기 때문에 비타민 A에 대한 추가공급 부분은 더 연구되어져야 한다고 생각된다.
- 05) acetate, propionate 및 butyrate 생성량도 이와 같은 경향을 보였다. 저농후사료에서의 total VFA 생성은 3hr 배양 후 비타민 A 첨가구에서 무첨 가구보다 유의하게 증가하였지만 나머지 배양시간인 6hr, 12hr, 24hr 및 48hr에서는 통계적인 유의차를 보이지 못하 였다. Acetate 생성량은 처리구간 대부분의 배양시간에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 6hr 및 12hr 배양 후에는 비타민 A 첨가구가 더 높은 경향을 보였다.
- pH는 전체적으로 실험 개시부터 종료까지 배양시간이 경과함에 따라 모두 감소 하는 경향을 나타내었으나 전반적으로 일반적인 반추위내 pH보다 다소 낮은 pH를 보였다. 처리구별 및 배양시간별 pH의 변화는 고농후사료에서 전체적으로 배양시간이 지날 수록 감소하였으며 저농후사료 역시 고농후사료 보다는 pH가 높은 경향으로 배양시간이 지날수록 감소하였으나 비타민 첨가와 무첨가 처리구 간에 큰 차이는 없었다. 비타민 A의 첨가와는 무관하게 농후사료의 급여량에 따라 12시간 배양이후부터 배양액의 pH의 차이가 뚜렷하였다 (P<0.
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