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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 키틴으로부터 면역증강물질인 glucosamine을 가축의 체내에 축적시킴으로써 동물의 면역력을 향상시켜 폐사율을 줄이고자 키틴이 함유된 DFMs를 급여한 생후 3~7개월령된 한우 송아지의 분변에서 키틴분해 효소능을 가진 분변내 미생물을 분리 동정함으로서 이를 산업화하기 위한 기초자료로 활용하고자 수행하였다.
- 본 연구는 키틴으로부터 면역증강물질인 N-acetyl-Dglucosamine을 축적시킴으로써 동물의 면역력을 향상시켜 폐사율을 줄이고자 키틴이 함유된 DFM을 급여한 생후 3~7개월령된 한우 송아지의 분변에서 키틴분해 효소능을 가진 미생물을 분리 동정하기 위해서 수행하였다.
제안 방법
- 본 실험 균주의 chromosomal DNA을 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용해 분리한 후 16S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATA CCTTG TTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR 증폭하였다 (Yoon 등 1996).
- 키틴을 분해하는 미생물을 분리하기 위해서 키틴을 함유한 DFMs을 급여한 송아지 분변에서 시료를 채취한 다음 Sakai (1998)의 방법에 따라 삼각플라스크 500ml에 Table 1과 Table 2의 배지에서 agar를 제외한 액체배지 100ml씩을 넣고 한우 송아지 분변을 각 1g씩 접종하여 30℃에서 5일간 진탕배양한다. 액체배양액을 peptone 수(peptone 1%, NaCl 0.
- 키틴을 분해하는 미생물을 분리하기 위해서 키틴을 함유한 DFMs을 급여한 송아지 분변에서 시료를 채취한 다음 Sakai (1998)의 방법에 따라 삼각플라스크 500ml에 Table 1과 Table 2의 배지에서 agar를 제외한 액체배지 100ml씩을 넣고 한우 송아지 분변을 각 1g씩 접종하여 30℃에서 5일간 진탕배양한다. 액체배양액을 peptone 수(peptone 1%, NaCl 0.5%, pH 7.2) 10배 희석법으로 연속적으로 희석한 후 각 희석액을 키틴 및 키토산이 함유된 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하면서 출현된 colony 주위에 형성된 chitin 및 chitosan 분해환 형성 균주를 분리하였다. 이때 각 효소의 생산능은 Vipul 등(2005)의 방법에 따라 Congo red로 염색하여 확인하였다.
- 각각의 배지에서 무작위로 형태가 다른 콜로니들을 선별․분리하여 RBA (Heart infusion agar + 5% Sheep blood) 배지에 patching 방법으로 도말한 후 배지상에 나타나는 hemolysis 형상을 관찰하였다. 콜로니 주변에 부분적인 녹색투명대를 형성하는 것을 α-용혈로, 콜로니 주변에 상당히 넓게 누런 투명대를 형성하는 것을 β-용혈로, 용혈현상이 나타나지 않아 투명대가 없을 때를 γ-용혈로 표시하였다 (Facklam과 Wilkinson 1981).
- 본 실험 균주의 chromosomal DNA을 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용해 분리한 후 16S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATA CCTTG TTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR 증폭하였다 (Yoon 등 1996). 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system (Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system (Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였다 (Thompson 등, 1994).
- DNA의 염기 조성을 측정하기 위해서 Katayama-Fujimura 등 (1984)과 Tamaoka와 Komagata (1984)의 방법에 따라 분리된 DNA (1 mg/ml)를 eppendorf tube에 녹인 후 100℃의 끊은 물에 5분간 넣어 DNA를 변성시킨다. 새로운 eppendorf tube에 열 변성된 DNA를 10㎕ 분주한 후 nuclease P1 (0.1 mg/ml in 40 mM Na-actate + 2 mM ZnSO4 solution, pH 5.3)을 10㎕를 첨가하여 30분간 반응시켜 deoxyribonucleotide 상태로 되게 한 후 10㎕의 alkaline phosphatase solution (2.4 unit/ml in 0.1M Tris-Hcl buffer, pH 8.1)를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킴으로서 nucleoside로 만든 후 Table 3의 조건의 HPLC에서 분석하였다.
- 키틴과 키토산의 유용성이 우수한 송아지 분변내 미생물을 10균주 중 각각 2균주를 선발하였으며, Nutrient 한천 평판배지 및 Nutrient 액체배지에 접종하여 37℃에서 24~48시간 동안 배양하면서 집락형태, 색깔, 표면상태, 광택, 가장자리 및 생육상태 등 배양상 특성을 관찰하였다. 선발균주의 배양학적 특성은 Nutrient broth에서 침전이나 pellicle이 없이 성장하였으며, Nutrient agar상에서 HANDI 110은 yellow였고 HANDI 309는 Bright beige, HANWOO는 Creamy, HANYOO는 Strong yellow의 색을 지녔다.
- 선발균주를 동정하기 위해서 4개 균주의 물리화학적인 성상을 구명하였다.
- 최적성장온도를 구명하기 위해서 Nutrient 사면배지에 접종한 후 각각 다른 온도에서 72시간 동안 배양하며 생육 여부를 관찰하였다. 4종의 선발균주 모두가 30℃에서 최적온도였으며, 생육 pH 범위를 구명하기 위해서 멸균한 Nutrient 액체배지에 pH를 HCl과 NaOH로 3~11로 조절하고, 균주를 접종한 후 37℃에서 72시간 동안 배양시키면서 생육 여부를 관찰한 결과 HANDI 110, HANWOO, HANYOO는 5~10의 범위에서 성장하였고, HANDI 309는 6~10의 범위에서 생육함이 관찰되었다.
- 선발균주 4종 모두 Catalase test는 양성, Oxidase는 음성이였고 Citrate를 이용하지 못하였으며 용혈환을 생성하지 않았다. Basal Medium (NH4NO3 1 g, KH2PO4 1 g, MgSO4․7H2O 0.5 g, KCl 0.2 g, 증류수 1,000 ml, pH 7.2)에 별도로 멸균한 각종의 당액을 최종농도가 1% (w/v)씩 되게 첨가한 후 각각의 균주를 접종하여 37℃에서 7일간 배양하면서 균주의 생육 상태를 당을 첨가하지 않은 대조구와 비교하여 관찰한 결과 HANDI 110은 Arabinose, Dextrin, Fructose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sucrose를 이용하였고, HANDI 309는 Dextrin, Glucose, Soluble starch를, HANWOO는 Dextrin만을, HANYOO는 Arabinose, Fructose, Glucose, Maltose, Soluble starch, Sucrose, Xylose를 이용하였다. 분리 균주의 물리화학적인 성상은 Table 6과 같다.
대상 데이터
- 송아지 분변 1g당 키틴이 함유된 배지상에서 105 이상의 집락이 형성된 10균주 중 키틴을 분해하는 2균주와 키토산을 분해하는 2균주를 선발하였으며 이들은 모두 용혈성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 키틴을 분해하는 균주는 선발한 4균주 모두 그람 음성균으로서 HANDI 110과 HANDI 309는 키틴을 분해하는 균주로 선발되었으며 HANWOO와 HANYOO는 키토산을 분해하는 균주로 선발되었다.
데이터처리
- 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였다 (Thompson 등, 1994).
이론/모형
- 2) 10배 희석법으로 연속적으로 희석한 후 각 희석액을 키틴 및 키토산이 함유된 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하면서 출현된 colony 주위에 형성된 chitin 및 chitosan 분해환 형성 균주를 분리하였다. 이때 각 효소의 생산능은 Vipul 등(2005)의 방법에 따라 Congo red로 염색하여 확인하였다. 키틴 및 키토산 분해 균주 선발을 위해 사용된 배지의 조성은 Table 1과 Table 2와 같다.
- DNA의 염기 조성을 측정하기 위해서 Katayama-Fujimura 등 (1984)과 Tamaoka와 Komagata (1984)의 방법에 따라 분리된 DNA (1 mg/ml)를 eppendorf tube에 녹인 후 100℃의 끊은 물에 5분간 넣어 DNA를 변성시킨다. 새로운 eppendorf tube에 열 변성된 DNA를 10㎕ 분주한 후 nuclease P1 (0.
- 키틴 및 키토산 분해능이 우수한 선발균주를 동정하기 위해 분리균의 형태, 생리, 생화학적 특성을 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg와 Holt, 1984), Bergey’s Manual of determinative bacteriology (Holt 등, 1994)와 Microbiological Application (Benson, 1990)에 따라 조사하였고 유전학적 특성을 통해 선발균주를 동정하였다.
성능/효과
- 키틴과 키토산의 유용성이 우수한 송아지 분변내 미생물을 10균주 중 각각 2균주를 선발하였으며, Nutrient 한천 평판배지 및 Nutrient 액체배지에 접종하여 37℃에서 24~48시간 동안 배양하면서 집락형태, 색깔, 표면상태, 광택, 가장자리 및 생육상태 등 배양상 특성을 관찰하였다. 선발균주의 배양학적 특성은 Nutrient broth에서 침전이나 pellicle이 없이 성장하였으며, Nutrient agar상에서 HANDI 110은 yellow였고 HANDI 309는 Bright beige, HANWOO는 Creamy, HANYOO는 Strong yellow의 색을 지녔다. 선발균주의 배양학적 특성은 Table 4와 같다.
- 선발균주의 배양학적 특성은 Table 4와 같다. Fig. 1과 같이 Chitinase를 생산하는 균주로 분해환을 보인 HANDI 110는간균이였으며 HANDI 309는 구균으로 모두 그람 음성균으로서 운동성과 포자형성은 없었다. Chitosanase를 생산하는 균주로 분해환을 보인 HANWOO와 HANYOO는 그람음성의 간균이였으며 운동성과 포자는 형성하지 않았다.
- 1과 같이 Chitinase를 생산하는 균주로 분해환을 보인 HANDI 110는간균이였으며 HANDI 309는 구균으로 모두 그람 음성균으로서 운동성과 포자형성은 없었다. Chitosanase를 생산하는 균주로 분해환을 보인 HANWOO와 HANYOO는 그람음성의 간균이였으며 운동성과 포자는 형성하지 않았다. 선발 균주의 형태학적 특징은 Table 5와 같다.
- 분리균주별 Genomic DNA의 G+C 함량과 16S rDNA 상동성는 HANDI 110의 경우 G+C mol% (HPLC)는 55.32%였고 Gene Bank Data의 Escherichia fergusonii ATCC 35469 AF 530475와 Homology가 99%로 나타났다. 그 결과는 Fig.
- 2와 같다. HANDI 309는 G+C mol% (HPLC)는 45.43%였고 Gene Bank Data의 Acinetobacter parvus LUH4616AJ 293691과 Homology가 96%로 나타났다. 그 결과는 Fig.
- 본 실험에서 분리한 미생물 4종의 G+C 함량은 미생물을 동정시 표준균주로 제시하고 있는 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg N.R과 J.G Holt, 1984)과 Bergey’s Manual of determinative bacteriology (Holt 등, 1994)를 참조하여 차이가 없어 동일한 염기서열이라고 판단되어 진다.
- 3과 같다. HANWOO는 G+C mol% (HPLC)는 66.14%였고 Gene Bank Data의 Comamonas koreensis과 KCTC12005 AF275377과 Homology가 99%로 나타났다. 그 결과는 Fig.
- 4와 같다. HANYOO는 G+C mol% (HPLC)는 42.29%였고 Gene Bank Data의 Chryseobacterium indologenes ATCC29897 M58773과 Homology가 98%로 나타났다. 그 결과는 Fig.
- 분리균주의 물리화학적 특성 및 유전학적 특성을 통해 키틴 유용균인 HANDI 110과 HANDI 309는 각각 Escherichia fergusonii HANDI 110과 Acinetobacter parvus HANDI 309로 명명하였으며, 키토산 유용균인 HANWOO와 HANYOO는 각각 Comamonas koreensis HANWOO와 Chryseobacterium indologenes HANYOO로 명명하였다. 염기조성에 있어서 미생물의 경우 25~75%의 넓은 G+C 분포를 나타내고 있지만 Marmur와 Doty (1962)가 DNA의 염기조성의 분석방법을 발표한 이후로 미생물 종 (Species)단계 분류의 주요한 인자로 정착되었다.
- 이상의 집락이 형성된 10균주 중 키틴을 분해하는 2균주와 키토산을 분해하는 2균주를 선발하였으며 이들은 모두 용혈성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 키틴을 분해하는 균주는 선발한 4균주 모두 그람 음성균으로서 HANDI 110과 HANDI 309는 키틴을 분해하는 균주로 선발되었으며 HANWOO와 HANYOO는 키토산을 분해하는 균주로 선발되었다.
- 분리된 미생물은 형태학적, 물리화학적 및 유전학적 분류를 통해 HANDI 110는 Escherichia fergusonii으로, HANDI 309는 Acinetobacter parvus으로, HANWOO는 Comamonas koreensis으로 HANYOO는 Chryseobacterium indologenes으로 각각 동정하였다.
- 최적성장온도를 구명하기 위해서 Nutrient 사면배지에 접종한 후 각각 다른 온도에서 72시간 동안 배양하며 생육 여부를 관찰하였다. 4종의 선발균주 모두가 30℃에서 최적온도였으며, 생육 pH 범위를 구명하기 위해서 멸균한 Nutrient 액체배지에 pH를 HCl과 NaOH로 3~11로 조절하고, 균주를 접종한 후 37℃에서 72시간 동안 배양시키면서 생육 여부를 관찰한 결과 HANDI 110, HANWOO, HANYOO는 5~10의 범위에서 성장하였고, HANDI 309는 6~10의 범위에서 생육함이 관찰되었다. 선발균주 4종 모두 Catalase test는 양성, Oxidase는 음성이였고 Citrate를 이용하지 못하였으며 용혈환을 생성하지 않았다.
후속연구
- Crude 키틴을 이용하여 분리 및 동정한 이들 균종을 산업화하기 위해선 효소생산을 위한 최적조건의 구명과 함께 분해산물의 특성 등에 대한 연구가 좀 더 이루어져야 할 것으로 여겨진다.
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