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문제 정의
- 본 연구는 외국소 (Bos taurus)의 유전체정보 (B_tau2.1)를 토대로 만들어진 한우의 유전체지도 (Choi 등, 2007)를 최근 새롭게 바뀐 외국소 (Bos taurus)의 유전체정보 (B_tau3.1)를 바탕으로 새롭게 만들어진 한우 유전체지도의 제작에 대한 내용으로 한우 유전체를 연구하는 국내․외 연구자들에게 도움을 줄 수 있는 기초자료를 만들고자 수행되었다.
- 1)와 비교 분석하여 한우의 유전체지도 초안 (제2세대 한우유전체지도)이 제작되었다. 본 연구에서는 기존에 확보한 한우의 박테리아인공염색체 클론의 염기서열을 최근에 공개된 소유전체 데이터 (B-tau 3.1)와 비교 분석하여 한우 유전체 지도를 최신화하기 위해 실시하였다. 제2세대 한우유전체지도에서 총 5,105개의 클론에 대한 염색체상 위치가 결정된 반면에 제3세대 한우유전체지도에서는 총 9,595개의 클론에 대한 염색체 위치가 결정되어 약 2배 정도로 향상되었다.
제안 방법
- 1차 매핑을 한 후에 2차적으로 반복서열이 제거 된 서열들만 모아서 멀티파스타 형식으로 취합한 후 자체적으로 구축한 서버에서 BLAST 수행을 통해 1×e-10의 조건으로 BLASTN 분석을 실시하였다.
- 1차적으로 지도 작성에 사용되지 않은 클론 중 E<e-40조건으로 소 염색체 염기서열과 유사성을 나타내지 않은 2,716개 클론과 반복염기서열 제거 후 한쪽의 말단염기서 열만 유사성을 나타내고 다른 쪽은 유사도를 보이지 않은 (single- end hit) 7,319개의 클론에 대하여 낮은 e-value (E<e-40)에서 2차 유사성 비교를 다시 시도하였다.
- )에서 2차 유사성 비교를 다시 시도하였다. 2차 유사성 비교를 통해 선발된 클론들 중 양쪽 말단염기서열의 크기가 300 kb가 넘는 것을 제외한 1,090개 클론에 대해 추가로 유전체지도 작성을 하였다. 따라서 1차 분석 8,505개와 2차 분석 1,090개, 총 9,595 BAC 클론의 염색체상 위치가 밝혀졌다.
- BAC 클론의 염색체상 위치 파악에는 각 BAC 클론의 양쪽 말단염기서열 모두가 같은 번호의 소 염색체염기서열과 높은 유사성 (E<e-40)을 보이는 (paired-ends hits) 클론을 먼저 선별하였다.
- 매핑에는 서로 같은 염색체에 일치되는 서열들 중에서 길이가 300 Kbp 이하인 것들을 사용하였다 (Chae 등, 2007; Choi 등, 2007). BLAST 결과 파일에서 나와 있는 서열의 좌표 정보를 이용하여 펄스크립트를 작성한 후에 GD library라는 소프트웨어를 이용하여 그림을 확대해도 계단현상이 생기지 않도록 벡터화된 그림 형식인 포스트스크립트 (postscript) 형식의 파일을 생성하였다. 1차 매핑을 한 후에 2차적으로 반복서열이 제거 된 서열들만 모아서 멀티파스타 형식으로 취합한 후 자체적으로 구축한 서버에서 BLAST 수행을 통해 1×e-10의 조건으로 BLASTN 분석을 실시하였다.
- BLAST 분석을 통해 얻은 결과 파일을 스프레드시트 형식으로 변환 한 후 변환된 파일에서 BLAST 결과가 있는 것과 없는 것을 서로 나누었다. BLAST 결과가 있는 것 중에서 앞쪽 방향서열 (forward)과 역 방향서열 (reverse)이 같은 염색체에 일치되는 경우와 앞쪽 방향서열과 역 방향서열이 다른 염색체에 일치되는 경우 그리고 앞쪽 방향서열 또는 역 방향서열 어느 한쪽만 결과가 있는 것으로 다시 한 번 나누었다.
- 이 과정에서 펄스크립트 (Perl script)를 통해 일정수준 (Phred 점수 20) 이하의 데이터는 삭제한 후 멀티 파스타 (multi FASTA) 형식의 파일로 데이터를 취합 하였다 (Ewing and Green, 1998; Ewing 등, 1998). Crossmatch 프로그램 (http://www.phrap.org)을 이용하여 데이터에 혼재되어 있는 벡터서열을 제거한 후 Repeat Masker 프로그램 (Jurka 등, 2005)을 이용하여 반복서열을 제거 (repeat masking) 하였다 (Ver. 2007. 12). 이러한 처리과정을 거친 결과에서 남은 서열의 길이가 100 bp 이하인 경우는 데이터로 사용하지 않았으며, 최종의 멀티 파스타 형식의 데이터는 자체 구축한 서버에서 BLAST를 이용하여 1×e-40의 E-value 조건에서 BLASTN 분석을 수행하였다 (Altschul 등, 1990).
- 분석한 클론 중 신뢰도가 높으며 (Phred score 20 이상), 벡터를 제거한 크기가 100 bp 이상인 말단염기서열이 한쪽 (single BES) 또는 양쪽 모두 (paired BES)에 존재하는 20,153개 클론에 대하여 반복염기서열을 제거 한 후 공개된 염색체별 소 유전체 염기서열(NCBI Genome B. taurus Build 3.1)과 유사성을 비교 (blast analysis)하였다 (Table 2). 분석에 사용된 20,153개의 클론 중 2,716 클론이 양쪽 말단염기서열 모두 소의 염기서열과 어떤 유사성 (no hit; E<e-40)도 나타내지 않은 반면, 17,437개 클론은 높은 유사성 (significant blast hit; E<e-40)을 나타냈다.
- 최초 96℃에서 2분간 반응하여 DNA를 변성 시킨 다음, 96℃ 10초, 50℃ 10초, 60℃ 4분간 총 80회 반응을 하였다. 이 PCR 산물은 에틸알코올을 사용하여 침전 과정을 통해 순수 분리한 후 DNA 분석장치 (AB3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 이러한 처리과정을 거친 결과에서 남은 서열의 길이가 100 bp 이하인 경우는 데이터로 사용하지 않았으며, 최종의 멀티 파스타 형식의 데이터는 자체 구축한 서버에서 BLAST를 이용하여 1×e-40의 E-value 조건에서 BLASTN 분석을 수행하였다 (Altschul 등, 1990).
- 양쪽 말단 염기서열이 모두 같은 염색체에 유사성을 보여준 9,304개의 클론 중 각각의 양쪽 말단염기서열이 소 염기서열의 한 부분과만 유사도 (single hit)를 나타낸 클론의 수는 4,562개 이며, 양 말단 중 한 쪽 이라도 여러 곳과 유사도(multiple hits)를 나타내는 클론의 숫자는 4,742개 이다. 이렇게 한우 BAC클론 말단염기서열 (BES)과 30쌍의 소 염색체가 갖고 있는 염기서열을 비교분석 (blast analysis)한 결과를 바탕으로 각 클론의 염색체상의 위치를 파악하여 유전체 지도를 작성하였다. Fig.
- 자동염기서열분석장치에서 얻은 초기파일 (chromatogram file)을 Phred 프로그램을 이용하여 텍스트 형태로 자동 전환시켰다. 이 과정에서 펄스크립트 (Perl script)를 통해 일정수준 (Phred 점수 20) 이하의 데이터는 삭제한 후 멀티 파스타 (multi FASTA) 형식의 파일로 데이터를 취합 하였다 (Ewing and Green, 1998; Ewing 등, 1998).
- Thermocycler (MJ research, USA)를 이용한 PCR 반응 조건은 아래와 같다. 최초 96℃에서 2분간 반응하여 DNA를 변성 시킨 다음, 96℃ 10초, 50℃ 10초, 60℃ 4분간 총 80회 반응을 하였다. 이 PCR 산물은 에틸알코올을 사용하여 침전 과정을 통해 순수 분리한 후 DNA 분석장치 (AB3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 배양된 각 박테리아인공염색체 클론은 Montage BAC96 miniprep kit (Millipore, USA) 또는 alkaline lysis 방법 (Birnboim and Doly, 1979; Kelley 등, 1999)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 각 박테리아인공염색체클론의 말단염기서열 분석은 클론 DNA 500 ng/㎕에 AmpliTaq DNA polymerase FS (Applied Biosystems, USA)를 포함하는 1 ㎕의 BigDye ready mix, 4 ㎕ 5X buffer (200 mM Tris-HCl, pH 9.0, 5 mM MgCl2)와 3 pmol로 희석한 공통 프라이머 (universal primer) 0.64 ㎕을 넣고 총량이 11 ㎕이 되도록 하여 반응하였다. 염기서열분석에 사용한 공통 프라이머의 염기서열은 각각 다음과 같다.
- 한우 염색체 DNA를 이용해 제작 된 약 150,000개의 박테리아인공염색체클론 (Chae 등, 2007) 중 총 21,024 BAC 클론에 대한 말단염기서열 (BES) 분석을 수행하였다 (Table 1). 이 중 염기서열 분석결과의 신뢰도가 낮은 서열 (Phred score 20 이하) 및 벡터로부터 유래한 염기서열을 제거한다음 그 크기가 100 bp 이상인 클론의 수는 20,153개 (38,061 BES, 23,585,813 bp) 이었으며, 평균 크기는 620 bp 이었다.
대상 데이터
- BAC 클론의 염색체상 위치 파악에는 각 BAC 클론의 양쪽 말단염기서열 모두가 같은 번호의 소 염색체염기서열과 높은 유사성 (E<e-40)을 보이는 (paired-ends hits) 클론을 먼저 선별하였다. 따라서 Table 2에서 표기한 것처럼 같은 염색체 상에 두 말단 염기서열이 모두 유사도를 보이는 9,304개 클론에 대한 분석을 실시하였다. 이중에서 한쪽 또는 양쪽 모두 같은 염색체에 2곳 이상과 유사도를 나타내는 클론 (4,742개)의 경우 E-value의 점수를 고려하여 양쪽 말단염기서열 모두 높은 E-value 점수로 같은 염색체와 유사도를 나타낼 때만 유전체지도 작성에 사용하였다.
- 이중에서 한쪽 또는 양쪽 모두 같은 염색체에 2곳 이상과 유사도를 나타내는 클론 (4,742개)의 경우 E-value의 점수를 고려하여 양쪽 말단염기서열 모두 높은 E-value 점수로 같은 염색체와 유사도를 나타낼 때만 유전체지도 작성에 사용하였다. 또한, 본 연구에 사용된 BAC 클론에 삽입된 한우 염색체 DNA의 평균 크기가 약 140 kb (Chae 등, 2007)로 추정되므로, 양쪽 말단염기서열이 같은 염색체에 유사성을 나타낸 총 9,304개의 클론 중 양쪽 말단염기서열간의 간격이 300 kb 이상인 클론을 제외한 나머지 8,505개 클론만 1차적으로 유전체지도 작성에 사용하였다.
- BLAST 결과가 있는 것 중에서 앞쪽 방향서열 (forward)과 역 방향서열 (reverse)이 같은 염색체에 일치되는 경우와 앞쪽 방향서열과 역 방향서열이 다른 염색체에 일치되는 경우 그리고 앞쪽 방향서열 또는 역 방향서열 어느 한쪽만 결과가 있는 것으로 다시 한 번 나누었다. 매핑에는 서로 같은 염색체에 일치되는 서열들 중에서 길이가 300 Kbp 이하인 것들을 사용하였다 (Chae 등, 2007; Choi 등, 2007). BLAST 결과 파일에서 나와 있는 서열의 좌표 정보를 이용하여 펄스크립트를 작성한 후에 GD library라는 소프트웨어를 이용하여 그림을 확대해도 계단현상이 생기지 않도록 벡터화된 그림 형식인 포스트스크립트 (postscript) 형식의 파일을 생성하였다.
- 따라서 1차 분석 8,505개와 2차 분석 1,090개, 총 9,595 BAC 클론의 염색체상 위치가 밝혀졌다. 지난 번 COMPASS 프로그램을 이용해 제작된 한우의 제2차 소 조사혼융지도 (Everts-van der Wind 등, 2004; Chae 등, 2007)에 올려진 629개의 양쪽 말단 염기서열에 모두 유사성이 있는 (paired-ends hit) 클론 중 265개 만이 이번 지도 작성에 포함 되었다. 또한, 이번 유전자 지도 작성에 사용된 9,595개 BAC 클론의 평균 insert 크기가 약 126.
- 지도에 사용된 9,595개의 클론 중 중복 (overlapping)되지 않는 클론은 모두 3,158개 이며 중복 되거나 다른 클론에 포함이 되는 클론 수는 모두 6,437개로서, 겹치는 영역을 제거한 총 길이는 907,203,954 bp이다. 현재 NCBI Btau_3.
이론/모형
- 96 deep well plate에 접종된 클론은 37℃의 진탕 배양기 (HT-Megagrow Bioneer, Korea) 안에서 550 rpm의 속도로 16시간 동안 배양하였다. 배양된 각 박테리아인공염색체 클론은 Montage BAC96 miniprep kit (Millipore, USA) 또는 alkaline lysis 방법 (Birnboim and Doly, 1979; Kelley 등, 1999)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 각 박테리아인공염색체클론의 말단염기서열 분석은 클론 DNA 500 ng/㎕에 AmpliTaq DNA polymerase FS (Applied Biosystems, USA)를 포함하는 1 ㎕의 BigDye ready mix, 4 ㎕ 5X buffer (200 mM Tris-HCl, pH 9.
성능/효과
- 8% 길이가 늘어났다. 그 결과에 따라 한우의 말단염기서열의 매핑 결과 밝혀진 외국소 유전체 서열에 대한 한우 유전체 클론의 coverage는 약 29.33%에서 37.27%로 늘어나 전반적으로 127% 증가하였으며, 양쪽 말단이 B-tau2.1에 매핑된 클론 숫자는 5,105 비해 B_tau3.1는 9,595 클론이 매핑되어 전반적으로 188% 증가하였다. 하지만 이와 같이 매우 높은 E-value로 BLAST를 수행했음에도 불구하고 BLAST 결과가 나오지 않는 클론이 많은 이유는 한우의 특이적인 서열일 수도 있으며 NCBI의 소유전체 데이터 (B_tau3.
- 제2세대 한우유전체지도에서 총 5,105개의 클론에 대한 염색체상 위치가 결정된 반면에 제3세대 한우유전체지도에서는 총 9,595개의 클론에 대한 염색체 위치가 결정되어 약 2배 정도로 향상되었다. 또한 겹치는 부분을 제외했을 때 제3세대 한우유전체지도에 사용된 클론은 소 전체 염색체의 약 37.27%에 해당되는 부분을 커버하는 것으로 나타났다. 앞으로 추가적인 한우 클론의 염기서열 해독을 통해 얻어진 데이터를 확보한다면 한우염색체 정밀 지도의 완성과 이를 이용한 한우 개량에 유용한 유전자 발굴에 활용될 수 있을 것으로 판단되다.
- 지난 번 COMPASS 프로그램을 이용해 제작된 한우의 제2차 소 조사혼융지도 (Everts-van der Wind 등, 2004; Chae 등, 2007)에 올려진 629개의 양쪽 말단 염기서열에 모두 유사성이 있는 (paired-ends hit) 클론 중 265개 만이 이번 지도 작성에 포함 되었다. 또한, 이번 유전자 지도 작성에 사용된 9,595개 BAC 클론의 평균 insert 크기가 약 126.8 kb 인 것으로 계산되므로 예상한 한우 BAC 클론의 평균 크기와 유사하다. 현재까지 전체 소 염색체에 대한 염기서열이 밝혀지지 않은 상태 이므로 향후에 보다 정확한 소의 염색체 염기서열이 밝혀지고 유전자의 지도가 작성 될 경우 지금까지 말단염기서열 분석을 마친 클론 중 보다 많은 한우 BAC 클론이 소 유전자 지도에 더 올라갈 수 있을 것으로 예상한다.
- 분석에 사용된 20,153개의 클론 중 2,716 클론이 양쪽 말단염기서열 모두 소의 염기서열과 어떤 유사성 (no hit; E<e-40)도 나타내지 않은 반면, 17,437개 클론은 높은 유사성 (significant blast hit; E<e-40)을 나타냈다.
- 분석에 사용된 20,153개의 클론 중 2,716 클론이 양쪽 말단염기서열 모두 소의 염기서열과 어떤 유사성 (no hit; E<e-40)도 나타내지 않은 반면, 17,437개 클론은 높은 유사성 (significant blast hit; E<e-40)을 나타냈다. 소 염기서열과 높은 유사성을 나타낸 17,437개 클론의 말단염기서열 중 7,319개 클론이 한 쪽만 높은 유사성 (single-end hit)을 나타냈으며, 10,118개 클론은 양쪽 모두에서 높은 유사성 (paired-end hits)을 나타냈다. 한쪽 말단 염기서열만 높은 유사성을 나타낸 7,319개 클론 중 5,104개 클론은 소유전체 염기서열의 한 곳에만 유사도(single hit)를 나타냈고 2,215개 클론의 경우는 여러 곳과 유사도(multiple hits)를 보여주었다.
- 한우 염색체 DNA를 이용해 제작 된 약 150,000개의 박테리아인공염색체클론 (Chae 등, 2007) 중 총 21,024 BAC 클론에 대한 말단염기서열 (BES) 분석을 수행하였다 (Table 1). 이 중 염기서열 분석결과의 신뢰도가 낮은 서열 (Phred score 20 이하) 및 벡터로부터 유래한 염기서열을 제거한다음 그 크기가 100 bp 이상인 클론의 수는 20,153개 (38,061 BES, 23,585,813 bp) 이었으며, 평균 크기는 620 bp 이었다. 이 중에서 한 클론에 대한 양쪽 말단 염기서열이 모두 위 조건을 만족하는 클론 (paired BES를 갖는 클론)의 수는 17,908개 이었고 한쪽 말단 염기서열만 위 조건을 충족시키는 클론 (single BES를 갖는 클론)의 수는 2,245개였다.
- 이러한 경우는 클론에 삽입된 insert가 없거나, 염기서열 분석에서 실패 한 것으로 판단된다. 이러한 결과를 통해 본 연구에서 제작된 한우 박테리아인공염색체 클론 중 최소 95.86%의 클론이 한우 염색체 DNA 토막을 포함하고 있는 것으로 추정된다.
- 1)와 비교 분석하여 한우 유전체 지도를 최신화하기 위해 실시하였다. 제2세대 한우유전체지도에서 총 5,105개의 클론에 대한 염색체상 위치가 결정된 반면에 제3세대 한우유전체지도에서는 총 9,595개의 클론에 대한 염색체 위치가 결정되어 약 2배 정도로 향상되었다. 또한 겹치는 부분을 제외했을 때 제3세대 한우유전체지도에 사용된 클론은 소 전체 염색체의 약 37.
후속연구
- 현재까지 전체 소 염색체에 대한 염기서열이 밝혀지지 않은 상태 이므로 향후에 보다 정확한 소의 염색체 염기서열이 밝혀지고 유전자의 지도가 작성 될 경우 지금까지 말단염기서열 분석을 마친 클론 중 보다 많은 한우 BAC 클론이 소 유전자 지도에 더 올라갈 수 있을 것으로 예상한다. 아직까지 말단염기 서열이 밝혀지지 않은 나머지 약 130,000개의 BAC 클론에 대한 염기서열 분석 작업이 완료될 경우 보다 자세한 한우 BAC 클론 지도가 완성 될 것이고, 이에 따른 한우 유전체 분석 및 소 품종간의 차이를 규명할 수 있는 특이 염기서열 규명에 큰 역할을 할 수 있을 것으로 판단되며, 아울러 외국소의 WGS (Whole Genome Shotgun) 데이터를 보완 하는데 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 27%에 해당되는 부분을 커버하는 것으로 나타났다. 앞으로 추가적인 한우 클론의 염기서열 해독을 통해 얻어진 데이터를 확보한다면 한우염색체 정밀 지도의 완성과 이를 이용한 한우 개량에 유용한 유전자 발굴에 활용될 수 있을 것으로 판단되다.
- 8 kb 인 것으로 계산되므로 예상한 한우 BAC 클론의 평균 크기와 유사하다. 현재까지 전체 소 염색체에 대한 염기서열이 밝혀지지 않은 상태 이므로 향후에 보다 정확한 소의 염색체 염기서열이 밝혀지고 유전자의 지도가 작성 될 경우 지금까지 말단염기서열 분석을 마친 클론 중 보다 많은 한우 BAC 클론이 소 유전자 지도에 더 올라갈 수 있을 것으로 예상한다. 아직까지 말단염기 서열이 밝혀지지 않은 나머지 약 130,000개의 BAC 클론에 대한 염기서열 분석 작업이 완료될 경우 보다 자세한 한우 BAC 클론 지도가 완성 될 것이고, 이에 따른 한우 유전체 분석 및 소 품종간의 차이를 규명할 수 있는 특이 염기서열 규명에 큰 역할을 할 수 있을 것으로 판단되며, 아울러 외국소의 WGS (Whole Genome Shotgun) 데이터를 보완 하는데 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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