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문제 정의
- 또한, 녹차추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도(40～150℃) 및 pH(3～11)에서 안정성을 나타냈다. 따라서 녹차추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 대상 미생물의 분야가 광범위할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다. 아울러, 녹차추출물의 항균작용을 알기 위하여, 녹차추출물 처리가 미생물 세포막 기능에 미치는 영향을 조사한 결과, 녹차추출물의 주요 작용기작은 세포막 perturbation에 기인한 것으로 사료되었다.
- 그러나 현재까지 진행되어 오고 있는 녹차의 항균관련 연구는 그 처리에 따른 미생물의 생육억제현상을 기술하는데 머물러 있는 형편이며, 녹차실험시료 또한 특정 제다회사의 증제차나 덖음차를 이용하고 있어 생녹차의 기능성을 연구하기에는 부족한 점이 많다. 따라서 본 연구에서는 녹차 재배현장에서 직접 채취한 녹차를 일정한 저장조건에서 보관하면서, 녹차추출물의 미생물 생육억제효과를 생리기작의 변화를 중심으로 검토하고자 하였다. 즉, 녹차추출물 처리전후의 전자현미경촬영사진 결과 및 β-galactosidase 효소활성변화를 통하여 녹차추출물이 미생물의 생육과 물질의 수송을 조절하는 세포막의 생화학적 기능에 미치는 영향을 검토하여 녹차추출물의 항균작용을 구명함으로서, 녹차추출물의 항균성을 확인하는데 필요한 기초자료를 마련하고자 하였다.
- 아울러, 녹차의 항균 및 항진균 작용에 관한 연구결과도 발표되고 있으나, 항균작용 기작에 접근한 기초 연구는 별로 많지 않다. 본 연구는 식품변패미생물에 대한 녹차추출물의 항균작용을 구명하는 기초자료를 획득하는데 그 목적이 있다. 녹차추출물의 항균력을 조사한 결과, 500 μg/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부패성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다.
- 즉, 녹차추출물 처리전후의 전자현미경촬영사진 결과 및 β-galactosidase 효소활성변화를 통하여 녹차추출물이 미생물의 생육과 물질의 수송을 조절하는 세포막의 생화학적 기능에 미치는 영향을 검토하여 녹차추출물의 항균작용을 구명함으로서, 녹차추출물의 항균성을 확인하는데 필요한 기초자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- E. coli의 β-galactosidase 생성유무를 알아보기 위하여 IPTG와 X-gal을 가한 배지에 배양하여 파란색 colony의 발현으로 이 효소의 활성을 확인할 수 있었다.
- GTE를 미생물 세포에 처리하였을 때, 세포막 기능에 대한 영향을 알아보기 위하여 GTE의 존재하에서 E. coli의 세포내 β-galactosidase의 활성을 측정하였다.
- 녹차추출물에 함유된 항균물질의 미생물 생육저해 최소 농도를 측정하기 위하여 GTE를 membrane filter(0.2 μm)로 제균시키고, tryptic soy broth(TSB)에 여러 가지 농도단위로 첨가한 후, 사면배지에서 각 공시균주 1백금이를 취하여 10 mL TSB에 접종, 30℃에서 24시간동안 전 배양시키고, 이 배양액 0.1 mL를 취해 상기와 동일한 배양조건으로 계대배양한 배양액 0.1 mL를 여러 농도의 녹차추출물이 함유된 plate count agar상에 평판도말하고 30℃에서 3일간 배양하여 생존균수를 대조구와 비교․측정하여 미생물의 생육저해정도를 배양시간별로 조사하였다.
- 녹차추출물이 미생물의 세포형태에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Scanning electron microscope(SEM)에 의한 녹차추출물 처리전후의 미생물 세포의 형태변화를 관찰하였다(18). 즉, 공시균주를 녹차추출물 무처리구인 대조구와 함께, 250 μg/mL 농도의 녹차추출물이 첨가된 각각의 TSB에서 36∼48시간동안 배양한 다음, 배양액 1 mL를 eppendorf tube에 옮긴 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 1 mL의 4% neutral buffered para-formaldehyde(NBP)를 가하여 다시 원심분리한 후 천천히 진탕하면서 2회 세척하였다.
- 또한 pH안정성은 염산이나 수산화나트륨으로 GTE의 pH를 3에서 11까지 조정한 후, 50 μL씩을 채취하여 paper disk에 접종하고, 열안정성과 동일한 방법으로 생육저해환을 측정·비교하였다.
- 배양액 1.5 ml에 같은 부피의 완충용액 [100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 10 mM KCI, 1 mM MgSO4․7H2O, 50 mM β-mercaptoethanol]을 가하고, 최종 농도가 3%가 되도록 각각 증류수, toluene, 녹차추출물을 첨가, 처리하고, 10초간 세게 흔들어 주었다.
- 살균, 냉각한 PDA배지 표면에 500 μg/mL 농도의 시험용액을 일정간격으로 위치한 paper disk에 접종하고, paper disk 확산법으로 대조구와 같이 37℃에서 24시간동안 배양하여 Escherichia coli 및 Staphylococcus aureus의 생육저해환을 측정·비교하였다.
- 아울러, GTE가 유산균의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 멸균된 Lactobacilli MRS 배지에 계대 배양한 유산균주를 단독균주로 하여 접종 도말한 후 GTE를 농도별(250 μg/mL , 500 μg/mL, 1,000 μg/mL)로 하여 paper disk에 분주하여 30℃ incubator에서 배양한 후 paper disk 주위의 생육 저해환을 관찰하였다.
- 23으로 맞추어 20℃ 데시케이트에 보관하면서 시료로 사용하였다. 아울러, 분말녹차는 구입한 덖음차를 분쇄기를 이용하여 분쇄후 100 mesh체를 통해 거른 후, 수분활성도 각각 0.81, 0.69 및 0.23으로 맞추어 20℃ 데시케이트에 보관하면서 시료로 사용하였다. 추출온도에 따른 추출수율의 변화를 살펴보기 위하여 증류수를 원료중량의 9배가 되게 한 다음 40℃, 60℃, 80℃, 100℃로 추출온도를 달리하여 3시간동안 추출하여 추출수율을 측정하였다.
- 즉, 공시균주를 녹차추출물 무처리구인 대조구와 함께, 250 μg/mL 농도의 녹차추출물이 첨가된 각각의 TSB에서 36∼48시간동안 배양한 다음, 배양액 1 mL를 eppendorf tube에 옮긴 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 1 mL의 4% neutral buffered para-formaldehyde(NBP)를 가하여 다시 원심분리한 후 천천히 진탕하면서 2회 세척하였다. 여기에 1 mL의 NBP를 다시 가하여 4℃에서 48시간동안 고정시키고 0.015 M phospate buffer solution(PBS, pH 7.2)을 1 mL 가하고 진탕하면서 2회 세척한 후 무수 알콜로 진탕하여 탈수하고 임계점 건조기로 건조한 후, 대조구와 함께 미생물세포의 형태변화를 관찰하였다.
- coli의 β-galactosidase 생성유무를 알아보기 위하여 IPTG와 X-gal을 가한 배지에 배양하여 파란색 colony의 발현으로 이 효소의 활성을 확인할 수 있었다. 이어서, 세포를 배양한 후, ONPG와 세포 혼합액에 증류수, toluene, acetone, GTE(0.01% 및 0.05%)를 가하였다. 측정하고자 하는 효소 β-galactosidase가 배양세포내에 존재하므로 GTE가 세포막에 영향을 주어 세포막이 손상을 받아 β-galactosidase가 세포밖으로 유출되어, toluene을 가하여 준 대조군에서 처럼 효소 활성이 검출되었다.
- 즉, 멸균하여 미리 건조시킨 BHIA배지에 각 세균의 24시간 배양액 100 μL를 평판도말한 후 GTE 2,000 μg/mL(0.2%상당), sodium benzoate 및 potassium sulfate 각각 2% 용액을 직경 10 mm의 paper disk에 60 μL씩 주입하여 확산시킨 후 37℃에서 48시간 배양했을 때, 생육 저해환의 크기를 비교하였다.
- 5 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 원심 분리하고 상등액의 흡광도를 420 nm에서 측정하였다. 증류수를 넣은 경우를 0으로 하고 toluene을 넣어준 경우를 100으로 하여 녹차추출물이 세포막에 미치는 영향을 비교하였다.
- 23으로 맞추어 20℃ 데시케이트에 보관하면서 시료로 사용하였다. 추출온도에 따른 추출수율의 변화를 살펴보기 위하여 증류수를 원료중량의 9배가 되게 한 다음 40℃, 60℃, 80℃, 100℃로 추출온도를 달리하여 3시간동안 추출하여 추출수율을 측정하였다. 한편, 녹차추출물은 잎녹차 또는 분말녹차를 열탕추출하고 여과한 후, rotary evaporator(Eyela, NE-1, Tokyo, Japan)로 농축하고 freeze drier(Clean Vac.
- 항균활성물질의 열안정성을 측정하기 위하여 녹차추출물을 40℃에서 150℃의 온도범위 중, 일정온도에서 30분동안 각각 열처리한 후 시료용액으로 사용하였다. 살균, 냉각한 PDA배지 표면에 500 μg/mL 농도의 시험용액을 일정간격으로 위치한 paper disk에 접종하고, paper disk 확산법으로 대조구와 같이 37℃에서 24시간동안 배양하여 Escherichia coli 및 Staphylococcus aureus의 생육저해환을 측정·비교하였다.
대상 데이터
- 8, Biotron, Seoul, Korea) 로 건조하여 조제하였다. 녹차추출물을 일정량의 증류수에 희석하여 일정농도의 녹차추출물용액을 준비하여 실험에 사용하였다.
- 84% 순으로 나타났다. 따라서, 수율이 높고 항균력이 뛰어난 물추출물(수용성 GTE)을 본 실험의 항균성 검토 시료로 사용하였다.
- 본 실험에서 녹차추출물의 항균력 검색용 균주는 식품원료 및 가공식품의 변질에 관여하는 부패미생물 및 젖산균을 대상으로, 경상대학교 식품공학과에 보관중인 미생물을 계대배양하여 실험에 사용하였다. 곰팡이 및 효모는 potato dextrose agar(PDA), 세균은 brain heart infusion agar(BHIA) 등의 사면배지에 계대배양하여 4℃에 보관하면서 사용하였다.
- 잎녹차는 경남 하동군 악양면에서 재배 중인 재래종(Camellia sinensis. var. sinensis) 품종을 2007년 6월 채취하여 전통식 방법으로 덖음차로 제조한 것을 구입하여 4℃ 냉풍건조를 통해 수분활성도 각각 0.81, 0.69 및 0.23으로 맞추어 20℃ 데시케이트에 보관하면서 시료로 사용하였다. 아울러, 분말녹차는 구입한 덖음차를 분쇄기를 이용하여 분쇄후 100 mesh체를 통해 거른 후, 수분활성도 각각 0.
이론/모형
- 녹차시료의 일반성분은 AOAC법(15)에 준하여 수분은 dry oven method, 회분은 직접 회화법, 총질소는 Kjeldahl법, 전당은 Somogyi변법, 지방은 Soxhlet 추출법으로 측정하였다.
- 녹차추출물의 세균 및 효모에 대한 항균력을 측정하기 위하여 전보(16)와 같이 여러농도의 녹차추출물용액으로 포화된 paper disk를 BHIA plate상에 접촉시켜 공시균주의 증식도를 비교하여 생육저해정도를 측정하는 paper disk확산법(17)을 이용하였으며, 기존 항균제와 녹차추출물의 항균력도 동일한 방법에 준하여 비교, 검토하였다. 즉, 멸균하여 미리 건조시킨 BHIA배지에 각 세균의 24시간 배양액 100 μL를 평판도말한 후 GTE 2,000 μg/mL(0.
- 녹차추출물이 세포막에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 세포를 파쇄하지 않고 녹차추출물 존재시에 Collectotrichum fragariae ATCC 58568의 β-galactosidase효소활성이 정량되는가의 여부를 Miller의 방법(19)에 준하여 살펴보았다.
성능/효과
- Collectotrichum fragariae가 β-galactosidase효소활성을 나타내는 정도는 isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)와 X-gal(5-bro-mo-4 -chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)을 함유한 배지에서 확인한 후, Collectotrichum fragariae를 영양배지에 접종한 뒤 30℃에서 12시간 배양한 후, M9 medium으로 옮겨 주고 600 nm에서의 흡광도가 0.5∼0.7이 되도록 배양한 다음, 0℃에 방치하여 성장을 억제하였다.
- 즉, GTE의 농도가 증가할수록 생육저해환의 크기가 증가하여 clear zone의 크기가 250 μg/mL 처리구 14-15 mm, 500 μg/mL 처리구 16-18 mm, 1,000 μg/mL 처리구 18-20 mm로 GTE 500 μg/mL 이상의 농도에 침지 처리한 paper disk 주위에는 균의 증식이 억제되는 clear zone을 형성함으로써 GTE의 항균력을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. GTE는 Gram양성균, Gram음성균, 효모 및 곰팡이 등 넓은 영역의 미생물에 대하여 뚜렷한 생육저해환을 보여 항균작용이 우수한 것으로 나타났다. 아울러, 이들은 공시균주에 대해서는 농도에 비례하여 항균력이 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 05%의 경우 90%의 활성이 검출되었다. acetone을 가하여 세포막을 손상하여 얻은 값이 10%였는데 이를 토대로 보면, GTE는 acetone보다 세포막을 더 손상시키는 것으로 판단되었다. 이 결과는 전자현미경을 이용한 미생물 세포형태의 변화에서 보여준 실험결과와 잘 일치하였으며, GTE의 항균작용은 미생물의 세포막 기능에 손상을 주는 인자에 기인하는 것으로 생각되었다.
- 그리고 녹차추출물의 항균성분의 pH에 대한 안정성은 Fig. 6에서와 같이 넓은 pH범위 (pH 3∼11)에서 동일한 크기의 생육저해환을 나타내어 pH안정성을 보였으며, Escherichia coli의 생육저해환의 지름은 약 18 mm정도로 전처리 pH에 관계없이 일정하였고, Staphylococcus aureus의 경우, 생육저해환의 지름은 약 16 mm정도로 전처리 pH에 관계없이 일정하게 나타나 녹차추출물의 항균활성물질은 넓은 pH범위에서 안정하였다.
- 녹차시료(잎녹차와 분말녹차)를 수분활성도가 각각 0.23, 0.69 및 0.81로 유지되는 20℃의 저장실에서 4주간 저장하면서, 저장기간과 수분활성도에 따른 녹차시료의 항균력을 paper disk법에 의한 clear zone의 크기로 비교한결과, 잎녹차의 경우 16-18 mm, 분말녹차의 경우 15-17 mm로 잎녹차가 분말녹차보다 다소 항균력이 높은 것으로 나타났고, 저장 4주째까지는 저장환경별 녹차시료의 항균력은 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며, 수분활성도가 낮을수록 잎녹차와 분말녹차 모두 항균력이 높은 것으로 나타났으나, 결론적으로 추론해 보면, 주어진 실험범위에서의 저장기간과 수분활성도에 따라 녹차시료의 항균력은 유의적인 차이가 없었다.
- 녹차추출물의 항균력을 조사한 결과, 500 μg/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부패성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다.
- 시중에 판매되는 덖음차의 일반성분 분석결과는 Table 1과 같다. 덖음 녹차의 수분함량은 1.36%, 조회분 함량은 13.23%, 조지방은 2.67%였으며, 조단백질은 37.25%, 탄수화물은 37.28%로 가장 높았으며, 조섬유은 8.21%이였다. 본 실험결과에서 녹차의 수분함량은 Lee 등(20)의 3.
- 2%)의 clear zone 20 mm, 2%의 보존료 sodium benzoate 및 potassium sulfate 각각 clear zone이 15-19 mm 및 16-18 mm로 나타나 GTE처리구가 기존보존료보다 더 크고 뚜렷한 생육저해환를 나타내었다. 따라서 GTE는 천연항균제 또는 보존료로서의 이용 가능성을 가지고 있는 것으로 판단되었다.
- 6에서와 같이 넓은 pH범위 (pH 3∼11)에서 동일한 크기의 생육저해환을 나타내어 pH안정성을 보였으며, Escherichia coli의 생육저해환의 지름은 약 18 mm정도로 전처리 pH에 관계없이 일정하였고, Staphylococcus aureus의 경우, 생육저해환의 지름은 약 16 mm정도로 전처리 pH에 관계없이 일정하게 나타나 녹차추출물의 항균활성물질은 넓은 pH범위에서 안정하였다. 따라서 녹차를 원료로 한 가공식품에 대해서 뚜렷한 항균효과 및 저장효과를 기대할 수 있었다.
- 08%로 가장 높은 추출 수율을 보였다. 따라서, 추출 온도가 높을수록 추출 수율이 높아지는 것을 관찰할 수 있었으며, 최적추출온도는 100℃로 설정할 수 있었다.
- 녹차추출물의 항균력을 조사한 결과, 500 μg/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부패성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다. 또한, 녹차추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도(40～150℃) 및 pH(3～11)에서 안정성을 나타냈다. 따라서 녹차추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 대상 미생물의 분야가 광범위할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다.
- 한편 Jung 등(27)의 가루녹차 첨가에 의한 유산균의 영향에 대한 보고에 따르면, 가루녹차 첨가는 배양 초기에는 유산균의 생육에 큰 영향을 미치치 않았으며 오히려, 배양 9시간부터 가루녹차 첨가에 의한 유산균의 증식 촉진 효과가 타나나는 것으로 보고하고 있다. 본 실험 결과에서도 일정시간 배양중에는 녹차추출물에 의해 김치 유산균의 생육이 억제되지 않는 것으로 나타났으며, 김치 유산균 등의 장내 유용미생물은 GTE에 의한 생육 저해 효과가 뚜렷하지 않은 것으로 판단되었다.
- 따라서 녹차추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 대상 미생물의 분야가 광범위할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다. 아울러, 녹차추출물의 항균작용을 알기 위하여, 녹차추출물 처리가 미생물 세포막 기능에 미치는 영향을 조사한 결과, 녹차추출물의 주요 작용기작은 세포막 perturbation에 기인한 것으로 사료되었다.
- GTE는 Gram양성균, Gram음성균, 효모 및 곰팡이 등 넓은 영역의 미생물에 대하여 뚜렷한 생육저해환을 보여 항균작용이 우수한 것으로 나타났다. 아울러, 이들은 공시균주에 대해서는 농도에 비례하여 항균력이 증가하는 것을 알 수 있었다.
- acetone을 가하여 세포막을 손상하여 얻은 값이 10%였는데 이를 토대로 보면, GTE는 acetone보다 세포막을 더 손상시키는 것으로 판단되었다. 이 결과는 전자현미경을 이용한 미생물 세포형태의 변화에서 보여준 실험결과와 잘 일치하였으며, GTE의 항균작용은 미생물의 세포막 기능에 손상을 주는 인자에 기인하는 것으로 생각되었다.
- 8과 같다. 즉, Fig. 7 및 Fig. 8에서와 같이 GTE처리로 미생물 균체가 세포벽 또는 세포막의 파괴로 인하여 세포형태의 변화가 뚜렷하게 발생하고, 사멸하게 되어 미생물 균체세포에 대한 GTE의 항균작용을 확인할 수 있었다. 따라서, 부패성 및 병원성 균주오염 가능성이 있는 식품을 GTE로 예방처리함으로써, 변패성 미생물균주에 의한 농축수산 식품원료 및 그 가공식품의 변패현상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
- 2는 GTE에 의해 형성된 Escherichia coli와 Sacharomyces cerevisiae의 생육저해환의 크기를 기존 보존료(sodium benzoate, potassium sulfate)와 비교한 결과이다. 즉, GTE(0.2%)의 clear zone 20 mm, 2%의 보존료 sodium benzoate 및 potassium sulfate 각각 clear zone이 15-19 mm 및 16-18 mm로 나타나 GTE처리구가 기존보존료보다 더 크고 뚜렷한 생육저해환를 나타내었다. 따라서 GTE는 천연항균제 또는 보존료로서의 이용 가능성을 가지고 있는 것으로 판단되었다.
- 즉, GTE의 농도가 증가할수록 생육저해환의 크기가 증가하여 clear zone의 크기가 250 μg/mL 처리구 14-15 mm, 500 μg/mL 처리구 16-18 mm, 1,000 μg/mL 처리구 18-20 mm로 GTE 500 μg/mL 이상의 농도에 침지 처리한 paper disk 주위에는 균의 증식이 억제되는 clear zone을 형성함으로써 GTE의 항균력을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.
- 5가지 서로 다른 용매를 사용하여 추출한 녹차의 항균력 실험결과는 Table 6과 같다. 즉, Staphylococcus aureus, Esherichia coli에 대해 용매별 효과는 물추출물에서 clear zone이 17-18 mm, butanol 13 mm, ethanol 13-14 mm, acetone 10-11 mm 등으로 나타나 추출용매가 물인 경우가 가장 큰 생육저해환을 보였고, 다음으로 ethanol, butanol 순으로 나타났다. Park 등 (24)은 20종의 한약재를 다른 용매로 추출시, 추출용매나 시료에 따라 항균력의 차이를 나타낸다고 하였다.
- 즉, Staphylococcus aureus에서는 250 μg/mL 이상에서 생육이 완전히 억제되는 것으로 나타났으며, Esherichia coli 및 Fusarium oxysporum에서도 각각 100 μg/mL 및 500 μg/mL 이상에서 거의 생육이 억제되는 것으로 나타났다.
- 6과 같다. 즉, 열안정성 실험결과는 Fig. 5에서와 같이, Escherichia coli의 생육저해환은 전처리 온도범위에서 관계없이 생육저해환의 직경이 17 mm정도로 일정하였고, Staphylococcus aureus의 경우에도 전처리온도에 관계없이 약 16 mm로 일정하여 광범위한 처리온도범위에서 녹차추출물이 뚜렷한 항균력을 나타내었다. 그리고 녹차추출물의 항균성분의 pH에 대한 안정성은 Fig.
- 측정하고자 하는 효소 β-galactosidase가 배양세포내에 존재하므로 GTE가 세포막에 영향을 주어 세포막이 손상을 받아 β-galactosidase가 세포밖으로 유출되어, toluene을 가하여 준 대조군에서 처럼 효소 활성이 검출되었다.
후속연구
- 8에서와 같이 GTE처리로 미생물 균체가 세포벽 또는 세포막의 파괴로 인하여 세포형태의 변화가 뚜렷하게 발생하고, 사멸하게 되어 미생물 균체세포에 대한 GTE의 항균작용을 확인할 수 있었다. 따라서, 부패성 및 병원성 균주오염 가능성이 있는 식품을 GTE로 예방처리함으로써, 변패성 미생물균주에 의한 농축수산 식품원료 및 그 가공식품의 변패현상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
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