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문제 정의
- 지금까지의 말초신경손상에서 경피신경전기자극과 전침자극의 진통효과에 대한 각각의 연구는 많이 있지만 두 가지 전기 자극을 비교한 연구는 미흡하며, 말초신경 손상에 대한 평가로 조직의 면역조직화학 반응과 함께 행동학적 측면에서 관찰한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구는 흰쥐의 좌골신경을 압좌 손상 시킨 후 경피신경전기자극과 전침자극을 일정기간 동안 적용시킨 후 나타나는 효과를 세포면역학적으로 척수 후각 천층에서 통각신경활성의 지표로 이용되는 c-fos의 발현을 관찰하고, 운동기능 회복과 통증완화 효과를 행동학적 측면에서 족적 분석(footprint analysis)을 통한 좌골신경기능지수(sciatic function index)와 핫플레트 검사를 통한 발도피지연시(foot withdrawal latency)를 통해 확인하고자 한다.
- 본 연구는 흰쥐를 대상으로 좌골신경 압좌 손상을 유발하고 경피신경전기자극과 전침자극의 효과를 알아보기 위하여 연구를 진행하였다. 좌골신경 압좌 손상 후 경피신경전기자극과 전침자극을 적용한 결과 실험군의 발도피지연시 증가, 좌골신경지수 증가, c-fos 발현을 감소시킨 것으로 나타나 말초신경 손상모델에서 통증완화 및 기능회복에 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 본 연구는 흰쥐를 대상으로 좌골신경 압좌손상 후 전침자극과 경피신경전기자극 적용 후 시간 경과에 따른 진통효과와 기능회복에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 이를 위해 먼저 좌골신경 압좌손상이 유발된 흰쥐에게 전침자극과 경피신경전기자극을 1일, 7일, 14일 동안 적용하여 통증 평가로 핫플레트 검사를 통해 발도피지연시를 측정하였고, 운동신경 회복 평가로 족적 분석을 통한 좌골신경기능지수로써 운동신경 회복을 평가하였다.
제안 방법
- 3％ DAB(3, 3‘-diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 처리하여 발색 반응을 유도하고 증류수로 10분씩 3회 수세하였다. 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 알코올에 담가 탈수시키고 xylene에 담가 청명의 과정을 거친 후 봉입제를 이용하여 영구표본을 제작하였다.
- TENS군은 활성전극을 대퇴 원위부위, 비활성 전극은 둔부에 실리콘전극(5㎜2)을 이용하여 전기자극을 적용하였다. 전침자극은 좌골신경 손상과 관련된 족삼리혈(ST 36, 슬관절아래 전경골근과 장지신근 사이)과 태충혈(Liv 3, 1·2 중족골 접합부 앞) 부위에 침(stainless steel, .
- 말초신경 재생에 관한 대부분의 연구는 조직학적, 형태학적 그리고 전기생리학적 연구에 기반을 두고 있는데, 이런 정보는 기능 회복에 관한 실제 정보를 제공하지 못하고 장기간의 기능회복에 관한 연구에 적합하지 않으므로 여러 가지 행동학적 연구방법들이 사용되고 있다[25]. 감각신경의 회복을 평가하는 방법중 pinch test와 전도속도 검사 등은 침습적(invasive)이므로 장기간 연구에 적합하지 않기 때문에 비침습적인 도피검사를 이용하여 통증 정도를 평가하였다. 신경손상 후 운동신경 회복의 평가에는 쥐의 족적을 분석한 보행 패턴이 운동신경 회복의 평가 방법으로 많이 사용되고 있다[9][26-29].
- 압박시 부드러운 플라스틱으로 겸자를 씌운 상태에서 압좌를 실시하였다. 겸자는 3단계로 힘을 가할 수 있도록 만들어져 있는 것을 사용하였으며, 신경 손상을 동일한 힘으로 일정부위에서 줄 수 있도록 겸자의 끝에서 5㎜ 위쪽에 선을 표시한 후 매번 같은 부위에서 신경을 압박하였고 가장 강한 3단계의 힘으로 손상을 유발하였다. 압좌 후 상처를 봉합한 후, 감염을 방지하기 위한 피부 소독을 실시하였다.
- 마취 후 오른쪽 대퇴부의 내측과 외측을 삭모하였다. 대전자부와 슬관절 사이에서 2㎝ 길이로 절개하고 경골신경과 비골신경으로 분지하기 전의 부위를 지혈겸자를 이용하여 30초간 압박하였다. 압박시 부드러운 플라스틱으로 겸자를 씌운 상태에서 압좌를 실시하였다.
- 대조군, TENS군과 EA군으로부터 분리한 요수 팽대부의 척수 조직은 -30℃로 냉동시킨 상태에서, 미세절단기를 사용하여 30㎛ 두께로 횡단 절단하였다. 절단된 척수 표본은 10mM phosphate buffer solution에 침수시켜 4℃로 냉장 보관한 후 24시간 이후에 실험에 이용하였다.
- )를 이용하여 발도피지연시를 측정하였다. 먼저 가열하지 않은 hot plate 위에서 흰쥐를 30분 적응시킨 후, 흰쥐를 일정한 온도(51.2℃)로 가열된 hot plate 위에 두고 손상측 발도피지연시를 측정하였다. 이때 흰쥐가 이동하기 위해 발을 떼는 것은 측정에서 제외하였고, 조직 손상을 예방하기 위해 30초 이내에서 측정을 실시하였다.
- 통로의 진행방향 끝에는 암실을 제작하여 실험동물이 전방으로 진행할 수 있도록 유도하였다. 먼저 흰쥐가 통로의 방향을 익히도록 2회 걷도록 한 이후에 3회씩 반복하여 족적을 기록하였다. 실험동물로부터 기록한 족적의 분석을 위하여 뒤꿈치에서 세 번째 발가락까지 거리(plantar length: PL), 첫 번째와 다섯 번째 발가락 사이의 거리(toe spread: TS), 두 번째와 네 번째 발가락 사이의 거리(intermediary toe spread: IT)를 측정하고, 측정한 값으로부터 좌골신경기능지수를 구하였다[그림 2].
- 면역조직화학적 관찰은 광학현미경(BX50, Olympus, Japan)에 장착된 CCD 카메라와 개인용 컴퓨터를 연결시켜 Image-Pro Plus 윈도용 4.0β 프로그램을 사용하여 c-fos의 면역반응을 관찰하였다.
- 최근 통증정도와 진통효과를 검정하는 방법 중에 조기발현유전자 c-fos의 생산물질인 c-fos 단백질을 면역조직화학적으로 관찰하는 형태학적 검정방법이 개발되어 사용되고 있다[22-24]. 본 실험에서도 좌골신경 압좌손상 후 통증 감소를 위한 전침자극과 경피신경전기자극의 효과를 대표적인 통증 기전 지표물질인 c-fos 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 통해 관찰하였다. 기존의 연구들을 보면 유해자극을 가한 후 c-fos가 lamina Ⅰ, Ⅱ와 Ⅴ, Ⅹ에서 발현한다고 하였는데 [12][21], 본 연구에서도 좌골신경 압좌 손상으로 통증을 유발시킨 후 요수 천층부위에서 면역반응을 확인할 수 있었다.
- 손상 후 1일, 7일, 14일에 분리한 요수 표본에 대하여 면역조직화학법을 적용하여 조직학적 소견을 비교 관찰하였다. 손상 후 1일 시점에 c-fos의 면역반응을 관찰한 결과, 요수의 Lamina Ⅰ～Ⅲ 영역에서 대조군에서는 강한 양성반응(+++)이 TENS군과 EA군은 중간 양성반응(++)을 보였다[그림 3][표 5].
- 손상 후 1일, 7일, 14일에 흰쥐를 대상으로 손상측 후지에 hot plate(IITC Model 39, Life Science Instruments, U.S.A.)를 이용하여 발도피지연시를 측정하였다. 먼저 가열하지 않은 hot plate 위에서 흰쥐를 30분 적응시킨 후, 흰쥐를 일정한 온도(51.
- 손상 후 7일, 14일에 흰쥐를 대상으로 Dellon과 Mackinnon 등(1989)이 사용한 족적 분석을 변형하여 적용하였다. 흰쥐의 족저면에 먹물을 묻힌 후, 바닥에 흰색 종이가 깔린 길이 80㎝, 폭 7㎝, 높이 10㎝의 통로를 통해 걷도록 함으로써 족적을 기록하였다.
- 먼저 흰쥐가 통로의 방향을 익히도록 2회 걷도록 한 이후에 3회씩 반복하여 족적을 기록하였다. 실험동물로부터 기록한 족적의 분석을 위하여 뒤꿈치에서 세 번째 발가락까지 거리(plantar length: PL), 첫 번째와 다섯 번째 발가락 사이의 거리(toe spread: TS), 두 번째와 네 번째 발가락 사이의 거리(intermediary toe spread: IT)를 측정하고, 측정한 값으로부터 좌골신경기능지수를 구하였다[그림 2].
- 본 연구에서는 동일한 조건하에서 사육한 생후 8～10주, 체중 250～300g의 건강하고 성숙한 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 45마리를 사용하였다. 실험동물은 대조군(n=15), 경피신경전기자극자극을 적용한 TENS군(n=15), 전침자극을 적용한 EA군(n=15)으로 구분하였고 각 군당 5마리씩 1일군, 7일군, 14일군으로 배정하였다. 대조군은 좌골신경 압좌손상을 시킨 후 표준사육장에서 사육하였다.
- 대전자부와 슬관절 사이에서 2㎝ 길이로 절개하고 경골신경과 비골신경으로 분지하기 전의 부위를 지혈겸자를 이용하여 30초간 압박하였다. 압박시 부드러운 플라스틱으로 겸자를 씌운 상태에서 압좌를 실시하였다. 겸자는 3단계로 힘을 가할 수 있도록 만들어져 있는 것을 사용하였으며, 신경 손상을 동일한 힘으로 일정부위에서 줄 수 있도록 겸자의 끝에서 5㎜ 위쪽에 선을 표시한 후 매번 같은 부위에서 신경을 압박하였고 가장 강한 3단계의 힘으로 손상을 유발하였다.
- 겸자는 3단계로 힘을 가할 수 있도록 만들어져 있는 것을 사용하였으며, 신경 손상을 동일한 힘으로 일정부위에서 줄 수 있도록 겸자의 끝에서 5㎜ 위쪽에 선을 표시한 후 매번 같은 부위에서 신경을 압박하였고 가장 강한 3단계의 힘으로 손상을 유발하였다. 압좌 후 상처를 봉합한 후, 감염을 방지하기 위한 피부 소독을 실시하였다.
- 요수 분절(L4-6)의 후각부에서 c-fos 면역반응성을 관찰하기 위하여, 10mM PB에 냉장 보관한 척수 표본에 rabbit polyclonal anti-c-fos(Sigma, U.S.A)를 1:200농도로 실온에서 24시간동안 처리하였다. 일차항체 처리 후, biotinylated anti-rabbit IgG(Vector Lab, Inc.
- 2℃)로 가열된 hot plate 위에 두고 손상측 발도피지연시를 측정하였다. 이때 흰쥐가 이동하기 위해 발을 떼는 것은 측정에서 제외하였고, 조직 손상을 예방하기 위해 30초 이내에서 측정을 실시하였다.
- 본 연구는 흰쥐를 대상으로 좌골신경 압좌손상 후 전침자극과 경피신경전기자극 적용 후 시간 경과에 따른 진통효과와 기능회복에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 이를 위해 먼저 좌골신경 압좌손상이 유발된 흰쥐에게 전침자극과 경피신경전기자극을 1일, 7일, 14일 동안 적용하여 통증 평가로 핫플레트 검사를 통해 발도피지연시를 측정하였고, 운동신경 회복 평가로 족적 분석을 통한 좌골신경기능지수로써 운동신경 회복을 평가하였다. 그 결과 발도피지연시는 손상 후 1일 시점에서는 각 그룹간 유의한 차이가 나지 않았으나 손상 후 7일, 14일 시점에서 TENS군과 EA군이 대조군보다 유의하게 증가하였다.
- 9％ NaCl로 관류수세 하였다. 이어서 4％ paraformaldehyde을 이용하여 관류고정을 실시하고 척수를 적출 하였다. 적출한 흰쥐의 척수는 24시간 동안 4％ paraformaldehyde으로 후고정을 실시하였고, 미세절단기 사용시 빙결을 방지하기 위해서 25％ sucrose에 하루 동안 4℃ 냉장보관 하였다.
- A)를 1:200농도로 실온에서 24시간동안 처리하였다. 일차항체 처리 후, biotinylated anti-rabbit IgG(Vector Lab, Inc., U.S.A.)를 1:25의 농도로 각각 90분간 처리하고, 이후에 Vectastatin Elite ABC Reagent(Vector Lab, Inc., U.S.A.)를 이용하여 3차 항체를 1시간 동안 처리하였다. 항체 처리과정 사이에서는 10 mM PB를 이용하여 10분씩 3회 수세하였다.
- 이어서 4％ paraformaldehyde을 이용하여 관류고정을 실시하고 척수를 적출 하였다. 적출한 흰쥐의 척수는 24시간 동안 4％ paraformaldehyde으로 후고정을 실시하였고, 미세절단기 사용시 빙결을 방지하기 위해서 25％ sucrose에 하루 동안 4℃ 냉장보관 하였다.
- 25㎜×30㎜)을 꽂고[14], 비활성 자극은 족삼리혈 부위, 활성전극은 태충혈 부위에 적용하였다[그림 1]. 전기자극은 압좌손상 1일 후부터 2주 동안 매일 15분간 60㎐, 약 1㎃(가시적인 근수축이 보이면 강도를 약간 감소시켜 근육의 움직임이 사라진 상태)로 전기자극을 시행하였다. 전기자극 적용시 대조군 또한 마취를 시켜주어 실험군과 최대한 동일한 조건을 주었다.
- 전침자극은 좌골신경 손상과 관련된 족삼리혈(ST 36, 슬관절아래 전경골근과 장지신근 사이)과 태충혈(Liv 3, 1·2 중족골 접합부 앞) 부위에 침(stainless steel, .25㎜×30㎜)을 꽂고[14], 비활성 자극은 족삼리혈 부위, 활성전극은 태충혈 부위에 적용하였다[그림 1].
- 항체 처리가 종료된 척수표본에 대하여 .3％ DAB(3, 3‘-diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 처리하여 발색 반응을 유도하고 증류수로 10분씩 3회 수세하였다.
- )를 이용하여 3차 항체를 1시간 동안 처리하였다. 항체 처리과정 사이에서는 10 mM PB를 이용하여 10분씩 3회 수세하였다. 항체 처리가 종료된 척수표본에 대하여 .
- 손상 후 7일, 14일에 흰쥐를 대상으로 Dellon과 Mackinnon 등(1989)이 사용한 족적 분석을 변형하여 적용하였다. 흰쥐의 족저면에 먹물을 묻힌 후, 바닥에 흰색 종이가 깔린 길이 80㎝, 폭 7㎝, 높이 10㎝의 통로를 통해 걷도록 함으로써 족적을 기록하였다. 통로의 진행방향 끝에는 암실을 제작하여 실험동물이 전방으로 진행할 수 있도록 유도하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 동일한 조건하에서 사육한 생후 8～10주, 체중 250～300g의 건강하고 성숙한 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 45마리를 사용하였다. 실험동물은 대조군(n=15), 경피신경전기자극자극을 적용한 TENS군(n=15), 전침자극을 적용한 EA군(n=15)으로 구분하였고 각 군당 5마리씩 1일군, 7일군, 14일군으로 배정하였다.
- 실험동물의 전신마취를 유도하기 위하여 전신마취제인 럼푼(Xylazine hydrochloride, Bayer Korea, Korea)을 복강내 주사(2 ㎖/㎏)하였다. 마취 후 오른쪽 대퇴부의 내측과 외측을 삭모하였다.
데이터처리
- 각 수치는 평균±표준편차로 나타냄.
- 0β 프로그램을 사용하여 c-fos의 면역반응을 관찰하였다. 각 집단 내의 변인에 따른 발도피지연시, 좌골신경기능지수와 c-fos 면역반응 변화를 비교하기 위해 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)을 실시하고 사후검정은 Duncan의 다중범위검정을 실시하였다. 본 연구의 통계학적 유의수준 α=.
- 본 연구의 실험 결과는 평균±표준편차로 표시하였고 통계처리는 SPSS 윈도용 12.0 프로그램을 사용하였다.
성능/효과
- 각 그룹에서 족적분석을 통한 좌골신경기능지수를 분석한 결과 손상 후 7일, 14일 시점에서 유의한 차이가 나타나지 않았지만, TENS군과 EA군 모두 손상 후 7일, 14일 시점에서 대조군 보다 높은 좌골신경기능지수를 보였다[표 3].
- 각 그룹에서 측정된 발도피지연시를 분석한 결과 손상 후 1일에는 세 그룹간의 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 손상 후 7일, 14일에서 대조군은 TENS군과 EA군에 비하여 유의하게 짧은 발도피지연시를 나타냈지만, TENS군과 EA군은 유의한 차이가 관찰되지 않았다[표 1].
- 손상 후 14일 시점에서, 대조군은 매우 약한 양성반응(±)을, TENS군과 EA군은 음성반응(-)을 보였다[그림 3][표 5]. 경피신경전기자극과 전침을 적용함으로써 대조군에 비하여 감소된 c-fos 면역반응성을 확인 할 수 있었다.
- 이를 위해 먼저 좌골신경 압좌손상이 유발된 흰쥐에게 전침자극과 경피신경전기자극을 1일, 7일, 14일 동안 적용하여 통증 평가로 핫플레트 검사를 통해 발도피지연시를 측정하였고, 운동신경 회복 평가로 족적 분석을 통한 좌골신경기능지수로써 운동신경 회복을 평가하였다. 그 결과 발도피지연시는 손상 후 1일 시점에서는 각 그룹간 유의한 차이가 나지 않았으나 손상 후 7일, 14일 시점에서 TENS군과 EA군이 대조군보다 유의하게 증가하였다. 좌골신경기능지수는 손상 후 1일 시점에서는 좌골신경 압좌손상으로 인해 보행시 발등을 이용하여 끄는 보행(antalgic gait)을 하므로 족적을 얻을 수 가 없었고[32], 손상 후 7, 14일 시점에서 TENS군과 EA군에서 대조군 보다 좌골신경기능지수가 통계적으로 유의하지는 않지만 증가한 것으로 관찰되어 경피신경전기자극과 전침자극의 효과를 확인할 수 있었다.
- 기존의 연구들을 보면 유해자극을 가한 후 c-fos가 lamina Ⅰ, Ⅱ와 Ⅴ, Ⅹ에서 발현한다고 하였는데 [12][21], 본 연구에서도 좌골신경 압좌 손상으로 통증을 유발시킨 후 요수 천층부위에서 면역반응을 확인할 수 있었다. 선행연구에서와 같이 손상 후 1일 시점에서 각 군에서 가장 강한 면역조직화학 반응을 확인할 수 있었고 시간이 지남에 따라 감소된 반응을 관찰할 수 있었으며 대조군보다 TENS군과 EA군에서 감소된 반응을 관찰할 수 있었다.
- 손상 후 1일, 7일, 14일에 분리한 요수 표본에 대하여 면역조직화학법을 적용하여 조직학적 소견을 비교 관찰하였다. 손상 후 1일 시점에 c-fos의 면역반응을 관찰한 결과, 요수의 Lamina Ⅰ～Ⅲ 영역에서 대조군에서는 강한 양성반응(+++)이 TENS군과 EA군은 중간 양성반응(++)을 보였다[그림 3][표 5]. 손상 후 7일 시점에서 대조군은 약한 양성반응을(+), TENS군과 EA군에서는 매우 약한 양성반응(±)을 보였다[그림 3][표 5].
- 본 연구는 흰쥐를 대상으로 좌골신경 압좌 손상을 유발하고 경피신경전기자극과 전침자극의 효과를 알아보기 위하여 연구를 진행하였다. 좌골신경 압좌 손상 후 경피신경전기자극과 전침자극을 적용한 결과 실험군의 발도피지연시 증가, 좌골신경지수 증가, c-fos 발현을 감소시킨 것으로 나타나 말초신경 손상모델에서 통증완화 및 기능회복에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 보아 경피신경전기자극과 전침자극이 말초신경손상 환자의 통증완화와 기능회복에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 결과 발도피지연시는 손상 후 1일 시점에서는 각 그룹간 유의한 차이가 나지 않았으나 손상 후 7일, 14일 시점에서 TENS군과 EA군이 대조군보다 유의하게 증가하였다. 좌골신경기능지수는 손상 후 1일 시점에서는 좌골신경 압좌손상으로 인해 보행시 발등을 이용하여 끄는 보행(antalgic gait)을 하므로 족적을 얻을 수 가 없었고[32], 손상 후 7, 14일 시점에서 TENS군과 EA군에서 대조군 보다 좌골신경기능지수가 통계적으로 유의하지는 않지만 증가한 것으로 관찰되어 경피신경전기자극과 전침자극의 효과를 확인할 수 있었다.하지만 경피신경전기자극과 전침자극을 적용한 실험군간의 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타나 추후에 더 많은 연구 필요한 것으로 생각된다.
후속연구
- 좌골신경 압좌 손상 후 경피신경전기자극과 전침자극을 적용한 결과 실험군의 발도피지연시 증가, 좌골신경지수 증가, c-fos 발현을 감소시킨 것으로 나타나 말초신경 손상모델에서 통증완화 및 기능회복에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 보아 경피신경전기자극과 전침자극이 말초신경손상 환자의 통증완화와 기능회복에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 좌골신경기능지수는 손상 후 1일 시점에서는 좌골신경 압좌손상으로 인해 보행시 발등을 이용하여 끄는 보행(antalgic gait)을 하므로 족적을 얻을 수 가 없었고[32], 손상 후 7, 14일 시점에서 TENS군과 EA군에서 대조군 보다 좌골신경기능지수가 통계적으로 유의하지는 않지만 증가한 것으로 관찰되어 경피신경전기자극과 전침자극의 효과를 확인할 수 있었다.하지만 경피신경전기자극과 전침자극을 적용한 실험군간의 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타나 추후에 더 많은 연구 필요한 것으로 생각된다.
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