본 연구에서는 심혈관계 질환의 표지인자인 콜레스테롤의 농도를 새롭게 개발한 형광 크로마토그라피 방법에 의하여 측정 하고자 시도하였다. 개발된 측정 시스템은 크로마토그라피 스트립이 들어 있는 카트리지, 발색제 AEC, 콜레스테롤 옥사데이즈 (CholesterolOxidase, CO), 콜레스테롤 에스트라아제(Cholesterol Esterase, CE), 호스래 디쉬페록시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP)를 포함하는 효소혼합 수용액, 그리고 형광 판독기로 구성되어 었다. 콜레스테롤 농도 변화에 따른 형광 세기 변화로 얻은 상관계수 r= 0.968로 측정 가능한 농도 범위에서 신뢰할 만한 직선성 관계를 제시하여 주었다. 회복률과 Hitachi 747 검사기기와 비교 테스트에서는 각각 106.5-94%와 상관관계 r = 0.939 (p<0.001)로 비교적 높은 유의성을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 개발된 새로운 콜레스테롤 농도 측정법은 빠른 반응 시간 (8분)과 적은 시료량 ($5\;{\mu}l$)을 사용하기에 시료를 실험실로 운반할 필요없이 클리닉에서 측정 가능한 준현장검사 플랫폼형으로 개발되었으며 기존의 고가의 자동화 장비를 사용하는 생화학적 진단방식 대체용으로의 응용이 기대된다.
본 연구에서는 심혈관계 질환의 표지인자인 콜레스테롤의 농도를 새롭게 개발한 형광 크로마토그라피 방법에 의하여 측정 하고자 시도하였다. 개발된 측정 시스템은 크로마토그라피 스트립이 들어 있는 카트리지, 발색제 AEC, 콜레스테롤 옥사데이즈 (Cholesterol Oxidase, CO), 콜레스테롤 에스트라아제(Cholesterol Esterase, CE), 호스래 디쉬페록시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP)를 포함하는 효소혼합 수용액, 그리고 형광 판독기로 구성되어 었다. 콜레스테롤 농도 변화에 따른 형광 세기 변화로 얻은 상관계수 r= 0.968로 측정 가능한 농도 범위에서 신뢰할 만한 직선성 관계를 제시하여 주었다. 회복률과 Hitachi 747 검사기기와 비교 테스트에서는 각각 106.5-94%와 상관관계 r = 0.939 (p<0.001)로 비교적 높은 유의성을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 개발된 새로운 콜레스테롤 농도 측정법은 빠른 반응 시간 (8분)과 적은 시료량 ($5\;{\mu}l$)을 사용하기에 시료를 실험실로 운반할 필요없이 클리닉에서 측정 가능한 준현장검사 플랫폼형으로 개발되었으며 기존의 고가의 자동화 장비를 사용하는 생화학적 진단방식 대체용으로의 응용이 기대된다.
In this study, we have developed a fluorescence chromatographic assay for the quantification of total cholesterol in serum, which is a well-known risk predictor for cardiovascular diseases. The new assay system consists of a chromatographic strip in a cartridge, enzyme buffer containing cholesterol ...
In this study, we have developed a fluorescence chromatographic assay for the quantification of total cholesterol in serum, which is a well-known risk predictor for cardiovascular diseases. The new assay system consists of a chromatographic strip in a cartridge, enzyme buffer containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, horseradish peroxidase, and color developer AEC, and a laser fluorescence scanner. The correlation coefficient (r) between cholesterol concentration and relative fluorescence units was 0.968 in the new assay, showing a reliable linearity through the tested range of cholesterol. Recovery test and comparability with a Hitachi 747 instrument showed 106.5-94% and r = 0.939 (p<0.001), respectively. The new assay system for cholesterol was developed as a pre-POCT platform conducted in clinics since it is fast (8 min) and uses a small volume of sample ($5\;{\mu}l$), and it may be applied for on-site diagnostics to replace expensive automated biochemical analyzer.
In this study, we have developed a fluorescence chromatographic assay for the quantification of total cholesterol in serum, which is a well-known risk predictor for cardiovascular diseases. The new assay system consists of a chromatographic strip in a cartridge, enzyme buffer containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, horseradish peroxidase, and color developer AEC, and a laser fluorescence scanner. The correlation coefficient (r) between cholesterol concentration and relative fluorescence units was 0.968 in the new assay, showing a reliable linearity through the tested range of cholesterol. Recovery test and comparability with a Hitachi 747 instrument showed 106.5-94% and r = 0.939 (p<0.001), respectively. The new assay system for cholesterol was developed as a pre-POCT platform conducted in clinics since it is fast (8 min) and uses a small volume of sample ($5\;{\mu}l$), and it may be applied for on-site diagnostics to replace expensive automated biochemical analyzer.
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문제 정의
본 연구에서는 심혈관계 질환의 표지인자인 콜레스테롤의 농도를 새롭게 개발한 형광 크로마토그라피 방법에 의하여 측정 하고자 시도하였다. 개발된 측정 시스템은 크로마토그라피 스트립이 들어있는 카트리지, 발색제 AEC, 콜레스테롤 옥사데이즈 (Cholesterol Oxidase, CO), 콜레스테롤 에스트라아제 (Cholesterol Esterase, CE), 호스래디쉬페록시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP)를 포함하는 효소혼합 수용액, 그리고 형광 판독기로 구성되어 있다.
본 연구에서는 혈중 콜레스테롤 양의 측정을 위하여 Fig. 1과 같은 구조를 갖는 크로마토그라피 스트립을 제작하고 휴대용이 가능한 형광 판독기를 이용하여 반응에 따른 형광 세기의 변화를 측정하는 시스템을 개발하고자 하였다. 콜레스테롤 측정 시스템은 효소가 분주되어져 있는 크로마토그라피 스트립, 버프용액 그리고 형광판독기로 구성되어 있다.
제안 방법
0.4mg/ml의 AEC 용액, 5 unit/ml CE 수용액 , 5 unit/ml CO 수용액 , 5 unit/ml HRP 수용액의 혼합 용액을 분주기 (Biodot)를 이용하여 접착제 카드가 부착되어 있는 니트로셀룰로오즈 막 위의 정해진 위치에 선으로 분주하였다. 건조시킨 막 위에 1% BSA, 0.
콜레스테롤 측정 시스템은 효소가 분주되어져 있는 크로마토그라피 스트립, 버프용액 그리고 형광판독기로 구성되어 있다. CO에 의하여 생성된 H2O2의 양에 비례하여 발색제 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC)는 반응에 참여하며 반응에서 생성된 유색물질은 다중체(polymer) 형태로 선상에 남아있게 되며 이를 휴대용이 가능한 간편한 형광 판독기를 이용하여 측정이 가능하도록 하였다. 이때의 반응식을 수식으로 나타내면 다음과 같다.
측정 하고자 시도하였다. 개발된 측정 시스템은 크로마토그라피 스트립이 들어있는 카트리지, 발색제 AEC, 콜레스테롤 옥사데이즈 (Cholesterol Oxidase, CO), 콜레스테롤 에스트라아제 (Cholesterol Esterase, CE), 호스래디쉬페록시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP)를 포함하는 효소혼합 수용액, 그리고 형광 판독기로 구성되어 있다. 콜레스테롤 농도 변화에 따른 형광 세기 변화로 얻은 상관계수 r = 0.
4mg/ml의 AEC 용액, 5 unit/ml CE 수용액 , 5 unit/ml CO 수용액 , 5 unit/ml HRP 수용액의 혼합 용액을 분주기 (Biodot)를 이용하여 접착제 카드가 부착되어 있는 니트로셀룰로오즈 막 위의 정해진 위치에 선으로 분주하였다. 건조시킨 막 위에 1% BSA, 0.1% Tween 20이 처리된 시료 패드와 흡수 패드를 차례대로 부착한 다음 60x4.1 mm 크기로 잘라 플라스틱 카트리지의 상판에 접착제 카드가 윈도우 쪽으로 향하도록 뒤집어서 삽입하였다. 시료 투입 창이 있는 플라스틱 하판을 상판에 맞추어 카트리지를 조립하고 완성된 카트리지는 크로마토그라피 스트립이 습기를 먹는 것을 방지하기 위하여 제습제와 함께 알루미늄 파우치 (pouch)에 넣어 보관하였다.
농도 단위로 측정되는 형광 크로마토그라피 분석의 정확성을 확보하기 위하여 회복률을 조사하여 보았다. 독립적으로 콜레스테롤 농도 1, 2, 3, 4mg/ml에서 각 농도 당 10회의 분석을 수행하고 그들의 평균 농도값과 회복률(%) 을 구하여 Table 1에 나타내었다.
독립적으로 콜레스테롤 농도 1, 2, 3, 4mg/ml에서 각 농도 당 10회의 분석을 수행하고 그들의 평균 농도값과 회복률(%) 을 구하여 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 제시하듯이 측정한 콜레스테롤 모든 농도 l-4mg/ml 범위에서 회복률은 106.
0) 40 μ1을 혼합하여 시료 투입 창을 통하여 적하하였다. 반응이 8분간 진행된 후 카트리지를 형광 판독기(BoditechMed Inc., Chuncheon)에 삽입하여 형광 창으로부터 형광세기를 주사(seaming)하여 결과를 얻었다. 얻어진 결과는 가우시안 피팅 (Gaussian Fitting) 방법에 의하여 최고점 (peak)의 면적값으로 표시 되어졌다.
그러나 6-7분 사이에서 비교적 높은 형광을 나타내기 시작하였고, 반응시간을 8-9분 까지 증가하였을 때에는 현저한 형광의 세기 변화를 관찰할 수 있었다. 여러 번의 실험을 거쳐 형광의 세기값이 가장 안정한 8분을 반응시간으로 결정하였다. 현재 임상 현장에서 사용되고 있으면서 컷오프(cut-ofi) 값을 기준으로 양성/음성을 판별하는 것이 아닌 콜레스테롤 측정값을 제공하여 주는 키트 중 Molecular probes사의 것은 반응 시간이 30분, 콜레스트렉사의 것은 16분인 것에 비하여 본 실험에서 도입된 시스템은 더욱 짧은 시간이 소요되므로 POCT형 콜레스테롤 측정에 적합한 방법이라 사료된다.
콜레스테롤 농도에 따른 형광 세기의 선형적인 변화를 관찰하기 위하여 콜레스테롤 표준용액 1, 2, 4mg/ml을 서로 조합하여 여러 가지의 농도로 만든 다음 각 농도에 대하여 5회 측정하여 평균값의 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 각각의 콜레스테롤 농도에 의한 형광의 세기는 최고점에서의 면적으로 전환하여 X-축상에 표시하였다.
콜레스테롤의 농도에 따른 형광세기의 변화를 관찰하기 위하여 1, 2, 4mg/ml 콜레스테롤 표준용액을 카트리지에 각각 적하하고 농도변화에 따른 상대적인 형광 세기를 측정하여 보았다. Fig.
대상 데이터
(Watertown, MA, USA)에서 구입하였고, 흡수 패드는 Schleicher & Schuell Corp.(Keene, NH, USA)에서 구입하였으며, 시료 패드는 폴사(Pall, New York, USA) 에서구입한 Cytosep 1662를 사용하였다.
콜레스테롤 표준용액 , 효소 CO와 CE, 발색제 AEC는 Sigma (St louis, MO, USA)로부터 구입하였고, HRP는 Kem-En- Tec(Copenhagen, Danmark)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 시약은 분석 시약급 이상을 사용하였다.
이론/모형
, Chuncheon)에 삽입하여 형광 창으로부터 형광세기를 주사(seaming)하여 결과를 얻었다. 얻어진 결과는 가우시안 피팅 (Gaussian Fitting) 방법에 의하여 최고점 (peak)의 면적값으로 표시 되어졌다.
성능/효과
보았다. Fig. 2에서 보여 주듯이, 콜레스테롤 농도가 증가함에 따라 형광의 상대적인 세기도 비례적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 형광의 세기가 콜레스테롤의 농도의 의존하는 것을 보여주는 것으로 제작된 측정시스템이 적절하게 작동하고 있다는 것을 제시하여 준다.
5에 나타내었다. Fig. 5에서 볼 수 있는 바와 같이 본 방법으로 측정한 결과와 Hitachi 747의 결과는 상관관계 r = 0.939 (p<0.001)로 비교적 높은 유의성을 보였다. Hitachi 747은암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 이용하여 침전물에 의한 흡광도의 차이를 측정하는 방법을 사용한 자동생화학 분석기로서 간기능, 신장검사, 고지혈증, 당뇨, 췌장질환, 근육효소, 전해질, 철분대사 검사 등의 검사를 소량의 혈액으로 검사할 수 있으며 현재 많은 대형 병원들에서 이 기기를 사용되고 있다.
이는 형광의 세기가 콜레스테롤의 농도의 의존하는 것을 보여주는 것으로 제작된 측정시스템이 적절하게 작동하고 있다는 것을 제시하여 준다. W. T. Law'이등이 연구한 넓은 띠의 길이에 따른 콜레스테롤의 농도를 측정하는 방법과는 달리 본 실험을 통하여 개발한 시스템에서는 좁은 띠 모양의 최고점이 얻어지기에 좁은 영역에서 형광 판독기의 주사가 한층 용이 하였으며, 간단한 프로그램을 이용하여 최고점의 면적을 쉽게 계산할 수 있었다.
변화에 따른 형광 세기 변화로 얻은 상관관계, 회복률 그리고 Hitachi 747 자동화 검사기기와의 비교에서 얻은 상관관계 등에서 비교적 높은 유의성을 보여주었다. 적은 시료량 (5 μ1)의 사용, 빠른 반응 시간 (8분), 그리고 스트립의 저비용성 등을 고려할 때 개발된 콜레스테롤 농도 측정법은 전문가 없이 작은 클리닉에서 사용가능한 준 현장 검사 플랫폼형식을 지닌 검사시스템이다.
6% 로 나타났다. 즉 측정 시 해당하는 모든 농도에서 변이계수는 10% 내에 분포하였으므로 이러한 결과는 본 실험에서 개발되어 적용된 형광 크로마토그라피에 의한 방법이 이전에 보고된 다른 콜레스테롤 농도 측정 방법의 결과와 비교 시 신뢰할 수 있는 측정방법임을 확인할 수 있는 것이라고 사료된다.
여러 번의 실험을 거쳐 형광의 세기값이 가장 안정한 8분을 반응시간으로 결정하였다. 현재 임상 현장에서 사용되고 있으면서 컷오프(cut-ofi) 값을 기준으로 양성/음성을 판별하는 것이 아닌 콜레스테롤 측정값을 제공하여 주는 키트 중 Molecular probes사의 것은 반응 시간이 30분, 콜레스트렉사의 것은 16분인 것에 비하여 본 실험에서 도입된 시스템은 더욱 짧은 시간이 소요되므로 POCT형 콜레스테롤 측정에 적합한 방법이라 사료된다.
968로 측정 가능한 농도 범위에서 신뢰할 만한 직선성 관계를 제시하여 주었다. 회복률과 Hitachi 747 검사기기와 비교 테스트에서는 각각 106.5-94%와 상관관계 r = 0.939 (p<0.001)로 비교적 높은 유의성을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 개발된 새로운 콜레스테롤 농도 측정법은 빠른 반응 시간 (8분)과 적은 시료량 (5 μ1)을 사용하기에 시료를 실험실로 운반할 필요없이 클리닉에서 측정 가능한 준현장검사 플랫폼형으로 개발되었으며 기존의 고가의 자동화 장비를 사용하는 생화학적 진단방식 대체용으로의 응용이 기대된다.
후속연구
001)로 비교적 높은 유의성을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 개발된 새로운 콜레스테롤 농도 측정법은 빠른 반응 시간 (8분)과 적은 시료량 (5 μ1)을 사용하기에 시료를 실험실로 운반할 필요없이 클리닉에서 측정 가능한 준현장검사 플랫폼형으로 개발되었으며 기존의 고가의 자동화 장비를 사용하는 생화학적 진단방식 대체용으로의 응용이 기대된다.
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