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문제 정의
- 버섯 균 표면에 염료가 흡착되어 제거되거나 버섯 균이 분비한 효소에 의하여 염료가 분해되어 제거될 것이다. 따라서 버섯 균에 염료가 흡착되어 제거 정도를 조사하기 위하여 이 버섯균에 의한 염료의 흡착정도를 조사하였다.
- 본 논문에서는 한국산 야생버섯에서 분리 배양된 버섯균들 중에서 염료탈색에 가장 우수한 균주를 선발하여 이들에 의한 염료의 탈색을 조사하였다.
- 염료(Bromophenol Blue, Congo Red, 혹은 Methylene Blue)를 함유한 배지에 분리된 버섯균을 10%로 접종한 후 7일 동안 정치배양 혹은 진탕배양하여 염료제거능이 우수한 6 종의 버섯 균을 선발하였다. 이렇게 선발된 버섯 균을 대상으로 다핵방향족 염료를 제거하는 능력을 조사하였다. 모든 버섯 균이 진탕배양 시보다 정치배양 시 더 우수한 염료제거 능을 보였다.
제안 방법
- Azo 염료로는 Congo Red 와 Bromophenol Blue, 이종고리식 방향족 (heterocylic aromatic) 염료로는 Methylene Blue를 여과지(filtraton size, 0.22 μm)를 사용하여 여과멸균한 후 최종농도를 50 mM로 하였다.
- 화학적으로 안정한 다환 방향족 염료을 페수처리 시설이나 천연적인 분해에 통해서 제거시키는 것이 비효율적인 것으로 알려져 있다. 다환 방향족 염료를 제거를 위하여 우리는 여러 버섯균류의 조사하였다. 한국의 야산에서 채집된 230종의 버섯으로부터 조직분리를 통하여 100개 버섯 균을 분리하였다.
- 버섯 균을 얻기 위하여 버섯의 갓과 대를 분리한 후 오염되지 않은 조직에서 조직절편을 떼어서 감자설탕 한천배지(PDA, potato dextrose agar, 설탕 2%)에 이식한 후 실온에서 배양하였다. 순수하게 분리된 것으로 판단된 균류는 PDA 배지에서 배양한 후 글리세롤을 15%로 첨가한 후 -90C 에서 냉동보관 하였다.
- 버섯균에 의한 염료의 제거가 염료의 분해에 의한 경우와 세포에 흡착되어 제거되는 경우가 있어서 균사체에 흡착된 염료량을 조사하기 위해서, 배양액은 원심분리 하여(3000 g, 10분) 상등액을 제거한 후 남아있는 침전물에 0.1N NaOH 3ml을 시험관에 가하고 1 분간 vortex한 후 원심분리(18,700 g, 5 분간)하여 상등액의 흡광도를 측정하였다.
- 분리 보관된 균류들을 감자 설탕배지(설탕 2%) 에서 진탕 배양한 후 접종원으로 이용하였다. 접종시 접종원의양은 배지량의 10%가 되도록 접종하였다.
- 선발된 6개의 버섯 균에 의한 Congo Red의 탈색 정도를 조사하였다. 3 종의 버섯 균을 대상으로 8일 동안 염료의 탈색으로 조사한 결과 진탕배양시보다 정치배양시 염료의 탈색이 더 빠르게 진행되었다(Fig.
- 본 실험에서는 한국의 야산에서 채취한 230 종의 버섯으로부터 조직분리 하여 100 종의 버섯균을 얻어 이들을 대상으로 염료 제거능이 우수한 균주를 선발하였다. 염료를 함유한 배지에 버섯 균을 접종한 후 정치배양과 진탕배양을 동시에 진행시키며 24시간 간격으로 탈색정도를 관찰하였다. 탈색 정도는 진탕배양시보다 정치배양시 탈색이 더 빠르게 진행되었으며 정치배양시 빨리 탈색되는 균주의 경우에는 48시간 후부터 탈색정도를 느낄 수 있었다.
- 염료를 함유한 배지에서 버섯 균을 배양한 후 원심분리하여 상등액을 버리고 침전된 버섯 균을 얻어서 이를 NaOH로 처리하여 막을 분해하여 막에 붙어 있던 염료를 분리시켜흡착된 염료의 양을 조사하였다. 가장 흡착이 가장 많이 일어나는 버섯 균(Boletellus nussellii.
- 이렇게 선발된 40개 버섯 균을 대상으로 다시 한번 정치배양 하여 염료의 탈색 정도를 조사하여 최종적으로 6종의버섯 균을 선발하여 염료의 탈색의 변화를 조사하였다. 염료의 탈색조사는 선발한 6종의 버섯 균을 대상으로 일정한 간격으로 시험관 1개씩을 꺼내어 원심분리한 후 상등액의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 각 화합물의 흡수파장에 따라 Congo Red는 490 nm에서 Methylene Blue는 660 nm에서 Bromophenol Blue는 590 nm에서 각각 측정하였다(Windholz et al., 1983).
- 정치배양한 균은 7일 동안 관찰해가며 탈색이 잘되는 40 종의 균을 1차적으로 선발하였다. 이 버섯 균을 대상으로 다시 한번 더 정치배양하면서 탈색정도를 조사하여 최종적으로 6종의 버섯 균을 선발하였다(Table 1).
- 1 ml)을 각각 시험관에 넣은 후 정치배양을 하여 육안으로 염료의 탈색을 조사하여 1차로 40개의 버섯 균을 선발하였다. 이렇게 선발된 40개 버섯 균을 대상으로 다시 한번 정치배양 하여 염료의 탈색 정도를 조사하여 최종적으로 6종의버섯 균을 선발하여 염료의 탈색의 변화를 조사하였다. 염료의 탈색조사는 선발한 6종의 버섯 균을 대상으로 일정한 간격으로 시험관 1개씩을 꺼내어 원심분리한 후 상등액의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 각 화합물의 흡수파장에 따라 Congo Red는 490 nm에서 Methylene Blue는 660 nm에서 Bromophenol Blue는 590 nm에서 각각 측정하였다(Windholz et al.
대상 데이터
- 버섯 균은 1997년 7월부터 1998월 10월까지 충청남도의 여러 지역, 강원도 연습림과 전남 지리산에서 여러 차례에 걸쳐서 230 종을 채집하였다. 버섯은 채집한 뒤 바로 자르기 전후 여러 각도에서 사진촬영을 하고 버섯의 특징을 기술한 후 45℃에서 건조시켰다.
- 본 실험에서는 한국의 야산에서 채취한 230 종의 버섯으로부터 조직분리 하여 100 종의 버섯균을 얻어 이들을 대상으로 염료 제거능이 우수한 균주를 선발하였다. 염료를 함유한 배지에 버섯 균을 접종한 후 정치배양과 진탕배양을 동시에 진행시키며 24시간 간격으로 탈색정도를 관찰하였다.
- 한국의 야산에서 채집된 230종의 버섯으로부터 조직분리를 통하여 100개 버섯 균을 분리하였다. 염료(Bromophenol Blue, Congo Red, 혹은 Methylene Blue)를 함유한 배지에 분리된 버섯균을 10%로 접종한 후 7일 동안 정치배양 혹은 진탕배양하여 염료제거능이 우수한 6 종의 버섯 균을 선발하였다. 이렇게 선발된 버섯 균을 대상으로 다핵방향족 염료를 제거하는 능력을 조사하였다.
- 탈색 정도는 진탕배양시보다 정치배양시 탈색이 더 빠르게 진행되었으며 정치배양시 빨리 탈색되는 균주의 경우에는 48시간 후부터 탈색정도를 느낄 수 있었다. 정치배양한 균은 7일 동안 관찰해가며 탈색이 잘되는 40 종의 균을 1차적으로 선발하였다. 이 버섯 균을 대상으로 다시 한번 더 정치배양하면서 탈색정도를 조사하여 최종적으로 6종의 버섯 균을 선발하였다(Table 1).
- 채취된 230종의 버섯 중에서 감자한천 배지상(PDA)에서 버섯 균이 얻어진 100개의 버섯 균은 감자 배지(PDB, 1ml), 위에서 언급한 염료 (45 mM), 버섯 균(0.1 ml)을 각각 시험관에 넣은 후 정치배양을 하여 육안으로 염료의 탈색을 조사하여 1차로 40개의 버섯 균을 선발하였다. 이렇게 선발된 40개 버섯 균을 대상으로 다시 한번 정치배양 하여 염료의 탈색 정도를 조사하여 최종적으로 6종의버섯 균을 선발하여 염료의 탈색의 변화를 조사하였다.
- 다환 방향족 염료를 제거를 위하여 우리는 여러 버섯균류의 조사하였다. 한국의 야산에서 채집된 230종의 버섯으로부터 조직분리를 통하여 100개 버섯 균을 분리하였다. 염료(Bromophenol Blue, Congo Red, 혹은 Methylene Blue)를 함유한 배지에 분리된 버섯균을 10%로 접종한 후 7일 동안 정치배양 혹은 진탕배양하여 염료제거능이 우수한 6 종의 버섯 균을 선발하였다.
성능/효과
- 선발된 6개의 버섯 균에 의한 Congo Red의 탈색 정도를 조사하였다. 3 종의 버섯 균을 대상으로 8일 동안 염료의 탈색으로 조사한 결과 진탕배양시보다 정치배양시 염료의 탈색이 더 빠르게 진행되었다(Fig. 1). 8일 후 잔존염료의 양을 조사한 결과, 정치배양 시에는 4-16%가 남았고 진탕배양 시에는 40-50% 이었다.
- 1). 8일 후 잔존염료의 양을 조사한 결과, 정치배양 시에는 4-16%가 남았고 진탕배양 시에는 40-50% 이었다. 각 균주별로 분석하면 진탕배양시보다 정치배양시 3-10 배 탈색이 되었다.
- 시간이 지남에 따라 처음에는 빠르게 그 후에는 느리게 탈색반응이 진행되었다. Congo Red와 Methylene Blue가Bromophenol Blue보다 빨리 상등액에서의 탈색반응이 빠르게 진행되어지는 것을 알 수 있었다. 그리고 앞에서 언급한 것과 같이 균사체의 흡착에 있어서 Congo Red, Bromophenol Blue, Methylene Blue순으로 Azo 염료가 이종고리식 방향족염료(Heterocyclic aromatic dye)보다 더 잘 흡착되었다.
- 염료를 함유한 배지에서 버섯 균을 배양한 후 원심분리하여 상등액을 버리고 침전된 버섯 균을 얻어서 이를 NaOH로 처리하여 막을 분해하여 막에 붙어 있던 염료를 분리시켜흡착된 염료의 양을 조사하였다. 가장 흡착이 가장 많이 일어나는 버섯 균(Boletellus nussellii.)을 대상으로 15일 동안염료의 흡착을 조사한 결과 Methylene Blue, Bromophenol Blue, Congo Red 순으로 높은 흡착을 보였다(Fig. 2). Methylene Blue의 경우, 전 배양기간 동안 흡착이 완만하게 증가하여 결과적으로 흡착은 매우 미미하였다.
- 모든 버섯 균이 진탕배양 시보다 정치배양 시 더 우수한 염료제거 능을 보였다.
- 버섯 균 각각의 염료분해 패턴을 비교하면, 털밤그물버섯(Boletellus russellii)은 Methylene Blue에서 2일 까지는 빠르게 분해되고 그 후에는 아주 천천히 진행되어 16일 후에도 16%가 잔존하였다. Bromophenol Blue의 경우, 6일까지 빠르게 분해가 진행되고 그 후에는 아주 천천히 분해가 진행되어 16일 후에도 잔존 양이 15%이상이었다.
- 본 실험에서는 진탕배양시보다도 정치배양시에 염료의 제거 속도가 빨랐다. 이런 현상은 다른 실험자에 의한 연구에서도 동일하게 관찰되었으며 그 원인은 아래와 같이 정리할 수 있을 것이다.
- 진균 그 중에서도 백색부후 담자균류를 이용한 다양한 화합물의 분해가 시도되어 상당한 결과를 얻었다. 본 연구에서 선발된 버섯균을 이용한 염료의 분해에 대한 연구에서 이 버섯균들이 효과적으로 염료를 제거하는 것을 관찰할 수 있었다. 염료분해를 더욱 잘하게 하는 배지, 배양조건, 환경요인들에 대한 연구가 진행되어 분해를 최적화하면 더욱 빠른 속도로 염료를 분해할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서 연구된 균 중에서 알광대버섯(Amanita phalloides)와 푸른주름무당버섯(Russulla delica)이 세 염료를 16일 후에는 거의 다 제거할 수 있었다(Fig. 4, 8). 여러 버섯균을 염료의 제거에 사용한 결과, 다음과 같은 경향을 찾을 수있었다.
- , 2004). 본 연구에서 조사된 버섯 균에서 흡착에 의한 염료의 제거는 분해에 의한 염료의 제거에 비해 미미하였다(총염료의 10%이하).이외에도 버섯균사체는 생장하지 않는 조건에서에서는 자가분해가 일어나 빠르게 분해가 일어난다.
- 8에 표시하였다. 조사된 모든 균에서 공통적으로 Bromophenol Blue의 분해가 가장 천천히 그리고 적게 일어났지만, Congo Red 와 Methylene Blue 분해는 빨리 일어났다.
- 진균 그 중에서도 백색부후 담자균류를 이용한 다양한 화합물의 분해가 시도되어 상당한 결과를 얻었다. 본 연구에서 선발된 버섯균을 이용한 염료의 분해에 대한 연구에서 이 버섯균들이 효과적으로 염료를 제거하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 염료를 함유한 배지에 버섯 균을 접종한 후 정치배양과 진탕배양을 동시에 진행시키며 24시간 간격으로 탈색정도를 관찰하였다. 탈색 정도는 진탕배양시보다 정치배양시 탈색이 더 빠르게 진행되었으며 정치배양시 빨리 탈색되는 균주의 경우에는 48시간 후부터 탈색정도를 느낄 수 있었다. 정치배양한 균은 7일 동안 관찰해가며 탈색이 잘되는 40 종의 균을 1차적으로 선발하였다.
- Bromophenol Blue는 처음 7 일까지는 흡착이 미미하였지만 그 후 빠르게 증가하였고, Congo Red의 경우 2-3일 흡착이 빠르게 증가하여 그 후에는 완만하게 증가하였다. 흡착에 의한 염료의 제거정도를 15일 후 측정한 결과 Congo Red 경우에는 총염료의 10%, Bromophenol Blue 경우에는 6%, Methylene Blue 경우에는 1% 이하로 제거되었다. 다른 버섯균도 흡착정도는 낮았지만 비슷한 양상을 보였다.
후속연구
- 염료의 분해에 관여할 것으로 사료되는 laccase, 리그닌 퍼옥시데이즈, 페놀옥시데이드, 망간 의존 혹은 비의존 퍼옥시데이즈 등의 다양한 세포외 효소의 발현을 촉진하는 배지와 배양조건에 대한 차후의 연구들 통해서 염료를 효과적으로 분해시킬 수 있는 조건을 찾을 수 있을 것으로 사료된다. 또한 이들 균들을 이용하여 자연상태에서 잘 분해되지 않은 polychlorinated biphenyl, polycyclic aromatic carbon, azo dye, heterocyclic dye, polymericdye 등의 여러 가지 물질의 분해를 연구하는 것도 의미가 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 선발된 버섯균을 이용한 염료의 분해에 대한 연구에서 이 버섯균들이 효과적으로 염료를 제거하는 것을 관찰할 수 있었다. 염료분해를 더욱 잘하게 하는 배지, 배양조건, 환경요인들에 대한 연구가 진행되어 분해를 최적화하면 더욱 빠른 속도로 염료를 분해할 수 있을 것이다. 염료의 분해에 관여할 것으로 사료되는 laccase, 리그닌 퍼옥시데이즈, 페놀옥시데이드, 망간 의존 혹은 비의존 퍼옥시데이즈 등의 다양한 세포외 효소의 발현을 촉진하는 배지와 배양조건에 대한 차후의 연구들 통해서 염료를 효과적으로 분해시킬 수 있는 조건을 찾을 수 있을 것으로 사료된다.
- 염료분해를 더욱 잘하게 하는 배지, 배양조건, 환경요인들에 대한 연구가 진행되어 분해를 최적화하면 더욱 빠른 속도로 염료를 분해할 수 있을 것이다. 염료의 분해에 관여할 것으로 사료되는 laccase, 리그닌 퍼옥시데이즈, 페놀옥시데이드, 망간 의존 혹은 비의존 퍼옥시데이즈 등의 다양한 세포외 효소의 발현을 촉진하는 배지와 배양조건에 대한 차후의 연구들 통해서 염료를 효과적으로 분해시킬 수 있는 조건을 찾을 수 있을 것으로 사료된다. 또한 이들 균들을 이용하여 자연상태에서 잘 분해되지 않은 polychlorinated biphenyl, polycyclic aromatic carbon, azo dye, heterocyclic dye, polymericdye 등의 여러 가지 물질의 분해를 연구하는 것도 의미가 있을 것으로 사료된다.
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