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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 백출(白朮)4 macr-ocephala, 가는 잎 삽주(茅蒼朮) 4 lancea, 삽주(關蒼朮)4 japonica 3종에 대해 외부형태와 내부형태 및 이화학 패턴 분석을 이용하여 朮類 한약재의 감별 기준을 제시하고자 한다.
가설 설정
- 1. 皮層에 木質化된 纖維束이 없거나 極少數 존재한다.
- 1. 皮層에 木質化된 纖維束이 있다.
- 1. 葉이 互生하고 莖下部葉柄은 길며 莖下部葉身이 3-5裂이다.
- 1. 葉이 互生하고 葉柄이 없거나 드물게 있으며 꽃이 白色이다.
- 1. 連珠狀結節狀根의 형태로 斷面은 黃白色이다 3. 斷面이 纖維性이고 皮層이 中心部보다 작고 皮 層에 放射狀 排列이 드물다-----A japonica
- 3. 導管-纖維束이 반복된다. 纖維束이 확연하게 두꺼우며 그 간격이 좁다--------A japonica
제안 방법
- HPLC를 이용하여 분리된 5가지 지표물질에 대한 분석을 실시하여 standard chroma-togram을 얻었다(Fig. 10).
- 朮類 한약재의 HPLC 패턴분석을 위해서 산지별 朮類 한약재를 분쇄하였다 각각의 분쇄물에서 0.5 g씩 취하여 추출용 MeOH 20 ml止를 가한 후 초음파 추출기를 이용하여 40분 동안 추출하였다. 각 추출물을 1 mL씩 취하여 원심분리기를 이용하여 약 5분 정도 원심분리한 후 상등액만 0.
- 전체적인 길이는 4-7cm 정도, 지름은 3-5cm 정도였다. 表面 은 주로 灰褐色으로 瘤狀의 돌기가 있었고, 質은 단단하고 잘 잘라지지 않았으며, 斷面은 灰白色을 나타냈고 평탄하였다. 斷面내부에 큰 細胞間隙이 특징적으로 보였고, 갈색의 點狀油室이 산재되어 있었다(Fig.
- 또한 표본 한약재에 대하여 건조 상태의 관찰을 자연조건에서 실시하였고, 식물체와 표본 한약재 모두 외부적인 관능검사 个준을 보강하기 위해서 확대경과 stereoscope 를 이용하여 정확도를 높였다.
- 주줄 물을 여과한 후 농축하여 MeOH extract 약 319 g을 얻은 뒤, 이를 증류수로 현탁하고 n-Hexane, CHCI3, EtOAc, n-BuOH 순으로 용매분획을 진행하였다. 분획층 가운데 양이 가장 많은 CHCb충 농축물(42 g)로 Open Column Ch顶omatngraphy를 진행하였다. 유리 컬럼 (i.
- 분획층 가운데 양이 가장 많은 CHCb충 농축물(42 g)로 Open Column Ch顶omatngraphy를 진행하였다. 유리 컬럼 (i.d. 60 mmx 500 mm) 에 silica gel을 충진 후 n-Hexane: EtOAc= 16 :l-0:l(v/v)의 용리액 비율로 진행하여 총 7개의 최종분획충을 분리하였다. 이 중 n-Hexane: EtOAC(16:1-0: 1, v/v), n-Hexane : EtOAc (8:1, v/v), n-Hexane: EtOAc(41, v/v), n-HexaneeEtOAc (2:1, 、v/v)의 용매 조건에서 얻은 분획물에 대해 Preparative HPLC를 이용하여 분리 - 정제를 진행한 결과 5가지 지표물질을 분리하여 각각 con坦ound-l~co-n坦ound-5로 명명하였다(Scheme 1).
- 이어 paraffin infiltration과정을 거친 후 paraffin block을 제작하여 section 작업을 통해 슬라이드를 제작하였다 Jfematoxylin (Heidenhain's), Safranin O 및 Fast green F* CF 사용하여 삼원염색을 하였고(Table 3), Permount®로 봉입하고 6시간 동안 건조한 후 광학현미경하에서 조직의 특성을 관찰하고 측정하여 그 내용을 촬영하였다.
- 주줄 물을 여과한 후 농축하여 MeOH extract 약 319 g을 얻은 뒤, 이를 증류수로 현탁하고 n-Hexane, CHCI3, EtOAc, n-BuOH 순으로 용매분획을 진행하였다. 분획층 가운데 양이 가장 많은 CHCb충 농축물(42 g)로 Open Column Ch顶omatngraphy를 진행하였다.
- 채취된 대상 식물체는 실험실 조건에서 일정하게 건조과정을 거침으로써 건조과정 중의 변화를 관찰하였다. 또한 표본 한약재에 대하여 건조 상태의 관찰을 자연조건에서 실시하였고, 식물체와 표본 한약재 모두 외부적인 관능검사 个준을 보강하기 위해서 확대경과 stereoscope 를 이용하여 정확도를 높였다.
- 이 중 표본 한약재는 24시간 동안 水浸하였다. 탈수는 Lang's butanol series를 수정한 방법에 따라 진행시켰으며 각 단계는 8시간 간격으로 하였다(Table 2).
대상 데이터
- 2006년 6월부터 2008년 9월까지 3개 대상 한약재의 기본 시료를 중국과 한국에서 재배되고 있거나 야생으로 생육하고 있는 식물체를 직접 채취하였고, 채취하기 힘든 약재는 유통 중인 약재를 제약회사를 통해 구입한 후 동정하여 사용하였다(Table 1). 실험에 사용된 식물체와 한약재는 일부 확증표본을 제작하여 우석대학교 한의과대학 본초학교실에 보관하였다.
- 3種 朮類 한약재를 표준한약재로 선정하여, 외 . 내부형태와 이화학 패턴을 통한 분류학적 기준을 설정한 바는 다음과 같다.
- 추출물 농축에는 질소농축기 (N-EVAP™111, OA-SYS)가 사용되었다. HPLC는 Agilent 1200 series로 columne Phenomenex Luna Cis (250 mm><4.6 mm i.d., 5(m)을 사용하였다. 구조 동정에는 400/600 MHz FT/NMR (JNM-EX400, JEOL Ltd) 을 사용하였다.
- 이런 면에서 저자는 朮類 한약재 중 백출(白朮) 且 macrocephala, 가는잎삽주(茅蒼朮財. lancea, 삽주(關蒼朮)4 japonica 3種을 선택하였으며, 실험결과를 바탕으로 이에 대한 각각의 검색기준을 작성하였는 바 그 내용은 다음과 같다.
- 1를 주입하였다. 검출기는 DAD를 사용하였다 UV 파장은 각성분이 적절하게 검출될 수 있는 240 nm로 설정하였다.
- %, Samchun, Kore劫을 사용하였다. 기기분석에는 HPLC등급의 MeOH, CH3CN, DW (이상 100%, JT Baker, 〃S4)을 사용하였다. 지표물질 분리 .
- 줄지어진 導管은 內部에 이르러 木部纖 維와 함께 쐐기 모양의 다발을 이루었다. 기다란 이등변삼각형의 모양으로, 木部纖維가 수 십여 개의 導管을 감싸고 있는 형상으로 조밀한 放射狀 環形을 이루었다. 중심에는 髓가 존재하였다 油室은 全層에 걸쳐 散在하여있고 그 크기와 모양이 다양하였다 薄壁細胞에는 草酸 鈣針晶이 드문드문 존재하고 菊淮이 少數 존재하였다 (Fig.
- 본 연구대상인 朮類 한약재는 한방에서 다용되는 한약재로서, 위에 언급된 전반적인 내용을 포괄하는 한약재 중의 하나이다. 이런 면에서 저자는 朮類 한약재 중 백출(白朮) 且 macrocephala, 가는잎삽주(茅蒼朮財.
- 약 3kg의 삽주(關蒼朮)4 japonice충북 제천시) 根莖 을 분쇄하여 추출용 MeOH로 2회 추출하였다. 주줄 물을 여과한 후 농축하여 MeOH extract 약 319 g을 얻은 뒤, 이를 증류수로 현탁하고 n-Hexane, CHCI3, EtOAc, n-BuOH 순으로 용매분획을 진행하였다.
- 외부 및 내부 형태 관찰을 위하여 Stereo-scope (ZEISS, German。), McrosccpeOilKDN, 间an), Fhotosajs (Reichert jung, USA)를 사용하였고, 사용된 시약 및 용매는 1등급 제품을 사용하였다.
- , 그리고 국내에서 白朮 또는 蒼朮로 유통되고 있는 삽주(關蒼朮)4 japonica 血.의 根莖을 대상으로 하였다. 蒼朮로 유통되는 다른 종인 만주삽주(北蒼朮)4 chinensis (DC.
- 이화학 패턴 분석을 위하여 추출 용매는 MeOH (99.5%, Samchun, 屈rea)을 사용하였고, 용매 분획에는 낮은 극성 순서대로 n-Hexane, CHCI3, EtOAc, n-BuOH (이상 99.%, Samchun, Kore劫을 사용하였다. 기기분석에는 HPLC등급의 MeOH, CH3CN, DW (이상 100%, JT Baker, 〃S4)을 사용하였다.
- 지표물질 분리 . 정제에는 silica gel 60 (MERCK) 과 precoated Kieselgel 60 F254 (Merck), 그리고 Preparative HPLC (LC-9104, GEL W251-252, JAI)를 사용하였다. 추출물 농축에는 질소농축기 (N-EVAP™111, OA-SYS)가 사용되었다.
- 정제에는 silica gel 60 (MERCK) 과 precoated Kieselgel 60 F254 (Merck), 그리고 Preparative HPLC (LC-9104, GEL W251-252, JAI)를 사용하였다. 추출물 농축에는 질소농축기 (N-EVAP™111, OA-SYS)가 사용되었다. HPLC는 Agilent 1200 series로 columne Phenomenex Luna Cis (250 mm><4.
성능/효과
- 1종류 가는잎삽주(茅蒼朮)4 lamea 분석결과, 전체적인 약재의 dromatograme 삽주4 j零onica의 chromatogranl 보다는 白朮4 macrocephala의 chromatogram과 약간 유사한 패턴을 보였고, atractylaiolide HI 와 atractylenolide I만 검출되었다. 하지만 白朮4 macrocepl項!酒는 달리 茅蒼 朮4 脸<泌에서는 머무름 시간 20 min 이후 36 min 이후, 49 min 이후에 negative peak가 나타나는 것이 특징이었고, 머무름 시간 30.
- 2종류 삽주4 japonic這 분석한 결과 머무름 시간 13.8 min, 20.1 min, 26.7 min, 39.5 min, 42.0 min에 해당하는 peak에 대해 각각의 UV spectrum을 확인한 결과, 모두 지표물질로 확인되었다. 두 약재의 chromatograirbcr 서로 유사한 패턴을 나타냈다.
- 5종류 백출(白朮)4 macrocephala 분석결과, 白朮 4 mamcephald사천성, 섬서성, 절강성, 호북성)의 chromatogram 은 서로 유사한 패턴을 보였고, atractylenolide DI 와 atractylenolide [이 검출되었다. 그러나 白朮4 macrooephala (흑룡강성)은 나머지 白朮 시료와 약간 다른 패턴을 보였고, 5가지 지표물질을 모두 함유하고 있었다.
- 투명한 갈색 오일형태, compound-5(16 mg)는 불투명한 누런색 오일형태를 나타냈다. NMR 구조 분석결과 compound-1, ~2, -3는 각각 atractylenolide I, atractylenolide ID, diacetyl-atractylodiol로 동정되어 기존 문헌에서 밝혀진 화학구조와 일치하였고% compound-4 -5는 기존 문헌에서 밝혀진 구조가 아니었기 때문에 구조를 동정하지 않고 진행하였다. Atractylenolide I, atractylenolideID, diacetylatractylodiol 의 화학구조는 Scheme 2와 같다.
- 있었다. 質은 堅實하고, 斷面은 纖維性을 보였으며, 黃白色 또는 灰白色으로 여러 개의 橙黃色 또는 褐黃色 의 油室이 산재되어 있었다 그리고 橫斷面에 形成層으로 추정되는 環이 비교적 잘 보였고, 放射狀 배열이 뚜렷하게 보였으나 皮層의 폭이 中心部보다 작았다(Fig. 6).
- 산재되어 있었다. 그리고 橫斷面에는 形成層으로 추정되는 環이 뚜렷하게 보였고, 이 環을 중심으로 中心部 와 皮層이 비슷한 폭으로 구분이 비교적 잘 되었으며 放 射狀 배열이 잘 보였다(Fig. 5).
- 그러나 白朮4 macrooephala (흑룡강성)은 나머지 白朮 시료와 약간 다른 패턴을 보였고, 5가지 지표물질을 모두 함유하고 있었다. 그리고 중국 내륙지방에서 채취한 白朮 시료와는 달리, 東北部 지역인 흑룡강성에서 채취한 白朮의 경우 東北部 지역에 역시 분포하는 朮類 한약재인 A japonica, A koreana 둥과의 혼종 가능성을 고려해 볼 수 있었다. 또한 白朮 역시 약재간에 약간의 패턴차이가 있는 것으로 보아 한약재의 산지별, 재배환경별로 차이가 존재하는 것으로 판단하였다.
- 이 중 白朮4 macrocepl]而I사천성, 섬서성, 절강성, 호북성) 의 chromatogram에는 5가지 지표물질 중 atractylenolide M 와 atractylenolide I 에 해당하는 머무름 시간의 peak가 검출되었고 이를 UV spectrum으로 확인한 결과 지표 물질과 같은 wavelenetli를 나타내어 이 2가지 물질이 함유된 것을 알 수 있었다. 나머지 지표물질에 대해 각 시료의산顶omatogram에서 비슷한 머무름 시간을 보이는 peak의 UV spectrum°l 지표물질과 다르게 나타나 compound-4, -5, diacetyl-atractylodiole 위 시료에 함유되지 않은 것을 알 수 있었다. 그리고 머무름 시간 30.
- 4 ir面!에서 두드러지는 peak를 보였다. 다 만두 약재의 dmomatogram에서 지표물질에 해딩하는 peak 및 지표물질 외 peak의 면적값이나 양상이 약간 다른 것은 산지별, 재배환경별 차이에 기인하는 것이라 판단하였다.
- 두 약재의 chromatograirbcr 서로 유사한 패턴을 나타냈다. 다만 삽주4 jex)nica (전북 진안군) 의 ctaiHogram에서는 삽주4 jex)nica (충북 제천시)보다 corrpound-5가 매우 작은 면적값을 보였고 atractylenolide DI 역시 삽주4 j* aponic 전북 진안군)에서 1/3정도 작은 면적 값을 보였다. Diacetyl-atractyloEiol의 경우 삽주4 japonice층북 제천시)보다 삽주4 japo成以전북 진안군) 에서 3배 정도 큰 면적값을 보였다.
- 그리고 중국 내륙지방에서 채취한 白朮 시료와는 달리, 東北部 지역인 흑룡강성에서 채취한 白朮의 경우 東北部 지역에 역시 분포하는 朮類 한약재인 A japonica, A koreana 둥과의 혼종 가능성을 고려해 볼 수 있었다. 또한 白朮 역시 약재간에 약간의 패턴차이가 있는 것으로 보아 한약재의 산지별, 재배환경별로 차이가 존재하는 것으로 판단하였다.
- 백출(白朮)A macrocephala, 가는잎삽주(茅蒼朮)」4 lancea 모두 皮層에 木質化 된 纖維束이 없었으나, 백출(白朮)4 macroce-pha団和: 維管束과 導管이 쐐기 모양으로 放射 狀 排列을 이루고 維管束이 中心部에 밀집되어 있는 반면, 가는잎삽주(茅蒼朮)4 lancea는 導管과 維管束이 서로 반복적으로 배열되어 皮層까지 길게 이어지는 모양을 나타냈고 그 두께가 가늘었다. 삽주(關蒼朮)4 japonica 는 皮層에 木質化 된 纖維束이 있었고 維管束이 확연하게 두꺼웠으며 그 간격이 좁았다.
- macrocephala(흑룡강성)을 제외한 나머지 4종류 白朮의 사iromatograme 서로 유사한 패턴을 나타냈다. 이 중 白朮4 macrocepl]而I사천성, 섬서성, 절강성, 호북성) 의 chromatogram에는 5가지 지표물질 중 atractylenolide M 와 atractylenolide I 에 해당하는 머무름 시간의 peak가 검출되었고 이를 UV spectrum으로 확인한 결과 지표 물질과 같은 wavelenetli를 나타내어 이 2가지 물질이 함유된 것을 알 수 있었다. 나머지 지표물질에 대해 각 시료의산顶omatogram에서 비슷한 머무름 시간을 보이는 peak의 UV spectrum°l 지표물질과 다르게 나타나 compound-4, -5, diacetyl-atractylodiole 위 시료에 함유되지 않은 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 이에 대한 해결점은 당연히 처음 단계의 구분(자연 상태에서 기원 식물의 형태 구분)을 전제로 하며, 이어서 실제 한약재로 사용되는 약용 부위에 대한 명확한 설정이 요구된다. 아울러 지표 물질 및 생리 활성을 내타내는 물질 등을 활용한 객관적인 추가 자료가 필요하다고 보겠다. 따라서 이러한 내용의 최종결과물인 검색 key는 현실적인 필요성이 있다고 볼 수 있다.
- 이상 내용은 3種 朮類 한약재의 감별 기준으로 활용될 수 있을 것이며, 향후 세부적인 성분 패턴실험과 생물학적 효능 실험 및 추가적인 種의 朮類 한약재에 대한 연구에 기초자.료로 활용되어짐으로써 한약재의 객관화에 도움이 될 것으로 사료된다.
- 한편 일부 유통중인 한약재 중 만주삽주(北蒼朮)4 났dnensis의 경우, 여러 정황상 삽주(關蒼朮)4 japonica 와 근연관계인 것으로 추정되므로 추후 A lam比a와 A chin-ensis, A 谕)onica의 3種 간 비교 및 4 japonica 의 구근과 신근에 대한 비교연구도 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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