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문제 정의
- 본 연구에서는 紫花前胡, 白花前胡, 峨參으로 기원이 확인된 약재 및 시중에서 ‘전호’로 유통되는 약재에 대해 약재 외부형태 비교, chromatographic fingerprint를 이용한 이화학적 비교 등의 방법을 이용하여 각각의 차이점을 밝히고 전호류 약재의 올바른 사용에 대한 필요성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- Chromatographic analysis를 위한 분석은 C18 컬럼을 통해 진행하였고, 이동상은 acetonitrile:water로 선택하였다. Peak sharpness가 유지되고 tailing이 생기지 않아 buffer 및 acidic agent는 사용하지 않았다.
- Chromatographic fingerprint를 작성하기 위해 기원 약재와 유통 약재의 chromatogram pattern을 확인하였다. 각각의 chromatogram에서 분리도 1.
- 2 μΩ으로 제조하여 사용하였다. HPLC 분석에는 acetonitrile과 water (각각 HPLC-grade, J.T. Baker Inc., NJ, USA)를 사용하였다.
- Peak sharpness가 유지되고 tailing이 생기지 않아 buffer 및 acidic agent는 사용하지 않았다. 각 약재별 선택 peak의 최대 흡수파장이 대부분 260~320 nm 사이에 존재하였고, peak별 흡수파장의 차이가 많이 나타났기 때문에 각 peak의 평균치에 근접한 280 nm를 기준 파장으로 설정하여 peak를 선택하였다.
- 각각의 chromatogram에서 선정된 peak들 중에서 모든 chromatogram에서 동일한 retention time에 공통적으로 발견되고 UV 흡수스펙트럼도 유사한 17.6min의 peak를 'reference peak'로 선정하고, 이 peak를 기준으로 하여 상대 머무름시간 (relative retention time, RRT)과 상대피크면적 (relative peak area, RPA)를 계산하였다.
- 각각의 약재를 analytical grinder (IKA A10, Germany)를 이용하여 분쇄한 후 standard test sieve (#18, Daihan science, Korea)에 통과시켜 얻은 균일한 크기의 약재 분말 500 mg을 취하여 추출용 methanol 5 mL로 추출하였다. 추출은 초음파추출 (Sonicator, Hwashin Tech Powersonic 420, Korea)을 이용하여 1 시간동안 진행하였고, 추출이 끝난 후 추출액을 1차 여과한 후 건조시켰다.
- 그리고 각 약재의 군집 분류는 ‘R (ver. 2,13.2)'과 'SYSTAT 10 (SPSS Inc., USA)'을 이용하여 각각 주성분 분석 (principal component analysis, PCA)와 계층적 군집분석(hierarchical cluster analysis, HCA)을 통해 진행되었다.
- 기기분석은 autosampler (SIL-20A), binary pump(LC-20AD), UV detector (SPD-10A), column oven(CTO-20A), degasser (DGU-20As) 등이 장착된 high-performance liquid chromatography (HPLC, LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 통해 진행되었다. 분석 결과는 LC solution (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 처리하였다.
- 기기분석은 autosampler (SIL-20A), binary pump(LC-20AD), UV detector (SPD-10A), column oven(CTO-20A), degasser (DGU-20As) 등이 장착된 high-performance liquid chromatography (HPLC, LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 통해 진행되었다. 분석 결과는 LC solution (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 처리하였다. 분석에는 Phenomenex Luna C18 (4.
- 산출된 RRT와 RPA를 통해 기원 약재와 유통 약재 간의 동등상관성을 분석하였다. 분석에는 피어슨 상관계수가 사용되었다.
- 선택된 peak들 중에서 모든 시료에서 가장 특징적으로 검출되는 peak를 선정하여 ‘reference peak'로 정한 후, 이에 대한 상대 머무름시간 (relative retentime, RRT)와 상대 피크 면적 (relative peak area, RPA)를 계산하였다.
- 기원 약재인 紫花前胡, 白花前胡, 峨參은 외부 및 내부 형태학적 분류 실험으로 정확하게 동정된 약재를 사용하였다. 유통약재는 약업사, 제약회사, 한약방, 한약국 등 한약 판매상을 통해 구하여 이를 산지 및 외형에 따라 구분하였다 (Table 1).
- 6 × 250 mm, 5μm, Torrance, CA, USA) 컬럼이 사용되었다. 이동상 조성은 water (A) : acetonitrile (B)로 하였고, 기울기용리(gradient elution)을 통해 분석을 진행하였다. 이동상 조성 비율은 (A) : (B) = 0 : 5 (0-5min); 50 : 50 (5-30min 까지 유지); 10 : 90 (30-35min)로 하였다.
- 각각의 약재를 analytical grinder (IKA A10, Germany)를 이용하여 분쇄한 후 standard test sieve (#18, Daihan science, Korea)에 통과시켜 얻은 균일한 크기의 약재 분말 500 mg을 취하여 추출용 methanol 5 mL로 추출하였다. 추출은 초음파추출 (Sonicator, Hwashin Tech Powersonic 420, Korea)을 이용하여 1 시간동안 진행하였고, 추출이 끝난 후 추출액을 1차 여과한 후 건조시켰다. 건조시킨 추출물에 HPLC-grade methanol 2 mL을 첨가하여 용해시킨 뒤 용액을 0.
대상 데이터
- 紫花前胡의 chromatogram 상에서 선정조건에 부합하는 10개의 peak (retention time 3.17, 16.49, 17.66, 24.45, 30.12, 30.60, 31.22, 33.56, 34.41, 36.52min)들을 선택하였다. 白花前胡에서는 retention time 3.
- 본 실험에 사용된 약재는 기원 약재와 시중 유통 약재로 구분하였다. 기원 약재인 紫花前胡, 白花前胡, 峨參은 외부 및 내부 형태학적 분류 실험으로 정확하게 동정된 약재를 사용하였다. 유통약재는 약업사, 제약회사, 한약방, 한약국 등 한약 판매상을 통해 구하여 이를 산지 및 외형에 따라 구분하였다 (Table 1).
- 본 실험에 사용된 약재는 기원 약재와 시중 유통 약재로 구분하였다. 기원 약재인 紫花前胡, 白花前胡, 峨參은 외부 및 내부 형태학적 분류 실험으로 정확하게 동정된 약재를 사용하였다.
- 분석에는 Phenomenex Luna C18 (4.6 × 250 mm, 5μm, Torrance, CA, USA) 컬럼이 사용되었다.
- 추출에는 methanol (99.5%, Samchun, Seoul, Korea)을 사용하였고, 증류수는 초순수제조기 (Milli-Q, Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 18.2 μΩ으로 제조하여 사용하였다.
데이터처리
- 기원 약재에 부여된 점수와 유통 약재에 부여된 점수를 각각 동등상관계수인 피어슨 상관 계수 (pearson correlation coefficient, r)를 통해 계산하여 기원 약재와 유통 약재 간의 동등상관정도를 분석하였다.
이론/모형
- 산출된 RRT와 RPA를 통해 기원 약재와 유통 약재 간의 동등상관성을 분석하였다. 분석에는 피어슨 상관계수가 사용되었다. 그리고 각 약재의 군집 분류는 ‘R (ver.
성능/효과
- 834%의 범위를 나타내어, RRT와 RPA 모두 생약 (한약) 제제의 성분 프로파일 설정 가이드라인7)에서 제시한 정밀성 5% 이내의 범위를 충족하는 것으로 나타났다.3) 동등 상관관계 및 군집 분석 피어슨 상관계수를 이용하여 기원약재와 유통약재의 상관관계를 분석한 결과, 시료 5, 6은 紫花前胡와 각각 0.98, 0.99 이상의 상관관계를 보였고, 시료 2는 白花前胡와 0.99이상, 시료 10은 白花前胡와 0.98 이상의 상관관계를 보였으며, 시료 11은 峨參과 0.96 이상, 시료 13과 19는 峨參과 각각 0.98 이상, 시료 22는 峨參과 0.97 이상, 그리고 나머지 시료 12, 14-18, 20-21은 모두 峨參과 0.99 이상의 상관관계를 보였다. 시료 7번은 峨參과 0.
- Chromatographic fingerprint 분석에서 紫花前胡와 白花前胡, 峨參 모두 다른 점이 확인되었고, 동등성 분석과 군집 분석을 통해 유통 약재 중 중국산 및 중국산으로 추정되는 4개 약재가 각각 紫花前胡, 白花前胡와 유사한 것으로 나타났다. 그리고 한국산 및 한국산으로 추정되는 12개의 약재는 峨參과 동등한 수준으로 유사성이 인정되었다.
- 紫花前胡와 白花前胡, 峨參 모두 외부 형태적으로 다른 점이 확인되었고, 유통 약재 중에서는 중국산 및 중국산으로 추정되는 약재 2개의 약재가 각각 紫花前胡, 白花前胡와 유사하였고, 한국산 및 한국산으로 추정되는 12개의 약재는 峨參과 동등한 수준으로 유사성이 인정되었다.
- 하지만, 紫花前胡의 表皮가 黃褐色-褐色이고 斷面이 白黃色으로, 이는 白花前胡의 表皮가 黑褐色-灰黃色이고 斷面이 黃褐色인 것으로 차이가 있었다. 그리고 紫花前胡는 質이 柔軟하고 절단하기 쉬우며 皮層에 黃褐色의 油點이 다량 존재하는 반면, 白花前胡는 質이 비교적 단단하고 잘 절단되지 않은 특징을 보였다. 峨參의 경우 表皮가 灰色-灰褐色이고 斷面이 類白色이며 절단할 때 하얀 가루가 생기는 것이 紫花前胡와 白花前胡와의 차이점으로 볼 수 있었다 (Fig.
- 기원 약재로 선정된 紫花前胡, 白花前胡, 峨參의 약재 외부 형태 기준은 크게 表皮, 斷面, 약재의 質, 香味 등으로 구분할 수 있었다. 紫花前胡와 白花前胡의 경우 形成層의 형태가環紋으로 명확하고, 中心柱가 黃色으로 명확히 구분되는 공통적인 특징을 가지고 있었다.
- 기원약재와 유통약재간의 동등상관계수를 피어슨 상관분석을 통해 살펴본 결과, 시료 5는 紫花前胡와 0.65이상으로 다른 시료에 비해 가장 유사한 상관관계를 보였고, 시료 2는 白花前胡와 0.79이상으로 유사한 상관관계를 보였다. 시료 11-22는 峨參과 상관관계 1을 보여 동등한 것으로 나타났다(Fig.
- 약재의 외부형태를 비교한 결과에서 볼 수 있듯이, 중국 산지로 표시되어있거나 중국산으로 추정되는 전호는 시료 7을 제외하면 峨參과의 유사성은 전혀 없는 것으로 나타나 紫花前胡 또는 白花前胡로 볼 수 있었으나, 약재 특징을 항목별로 비교한 결과 시료의 대부분이 기원약재인 紫花前胡나 白花前胡와 유사하지 않아 중국에서 수입되는 전호의 경우 약재 혼용이나 오용의 가능성이 높은 것으로 볼 수 있었다. 반면에 한국 산지로 표시되어 있거나 한국산으로 추정되는 전호는 峨參과 동등한 수준으로 유사점이 보였고, 紫花前胡나 白花前胡와는 유사점이 전혀 발견되지 않아서 모두 峨參으로 판단할 수 있어서 최소한 국내산 전호 유통에 있어서는 他種 약재의 혼입이나 오용의 가능성이 낮은 것으로 판단할 수 있었다. 그리고 紫花前胡와 白花前胡의 유사성은 외부 형태상 어느 정도 인정되었으나 이들 ‘前胡’류 약재와 峨參과의 유사성은 전혀 발견되지 않았다.
- 상대표준편차 (relative standard deviation, RSD)를 이용하여 선택된 peak의 RRT와 RPA에 대한 정밀도 (precision)을 구한 결과, RRT에 대한 정밀도는 0.026~0.471%의 범위를 나타내었고, RPA에 대한 정밀도는 5개의 peak가 5.197~6.006%의 범위를 나타내는 것을 제외하면 모두 0.416~4.834%의 범위를 나타내어, RRT와 RPA 모두 생약 (한약) 제제의 성분 프로파일 설정 가이드라인7)에서 제시한 정밀성 5% 이내의 범위를 충족하는 것으로 나타났다.3) 동등 상관관계 및 군집 분석 피어슨 상관계수를 이용하여 기원약재와 유통약재의 상관관계를 분석한 결과, 시료 5, 6은 紫花前胡와 각각 0.
- 약재의 외부형태를 비교한 결과에서 볼 수 있듯이, 중국 산지로 표시되어있거나 중국산으로 추정되는 전호는 시료 7을 제외하면 峨參과의 유사성은 전혀 없는 것으로 나타나 紫花前胡 또는 白花前胡로 볼 수 있었으나, 약재 특징을 항목별로 비교한 결과 시료의 대부분이 기원약재인 紫花前胡나 白花前胡와 유사하지 않아 중국에서 수입되는 전호의 경우 약재 혼용이나 오용의 가능성이 높은 것으로 볼 수 있었다. 반면에 한국 산지로 표시되어 있거나 한국산으로 추정되는 전호는 峨參과 동등한 수준으로 유사점이 보였고, 紫花前胡나 白花前胡와는 유사점이 전혀 발견되지 않아서 모두 峨參으로 판단할 수 있어서 최소한 국내산 전호 유통에 있어서는 他種 약재의 혼입이나 오용의 가능성이 낮은 것으로 판단할 수 있었다.
- 유통 약재의 경우 중국 산지 또는 중국산으로 추정되는 약재는 紫花前胡 또는 白花前胡로 확인된 약재의 숫자가 매우 적었고, 약재 간 편차가 심하게 나타나 중국에서 前胡류 약재를 수입할 때는 정확한 약재의 감별과 약재 품질관리에 신중을 기해야 할 필요성이 제기되었다. 그리고 한국 산지 또는 한국산 전호의 경우 모두 峨參으로 확인되어 품질 균질성이나 동등성 면에서는 중국산보다 월등하게 높게 나타났지만 峨參 은 紫花前胡나 白花前胡와 외부형태나 chromatogram상에서 차이를 보이는 것으로 나타났기 때문에 前胡와는 상당히 다른 방향으로 약효가 발휘될 가능성이 농후하다.
- 그리고 시료 3과 8, 4, 9는 가장 멀리 떨어진 거리를 형성하여 기원 약재와의 연관성은 보이지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 군집을 분류하면 [시료 3,8], [白花前胡-1, 2, 10], [紫花前胡, 5, 6], [峨參, 1, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22] 등으로 군집이 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 7).
- 그리고 한국산 및 한국산으로 추정되는 12개의 약재는 峨參과 동등한 수준으로 유사성이 인정되었다. 이화학적 분석 결과 역시 외부 형태학적 감별 결과에서처럼 紫花前胡, 白花前胡와 峨參의 관련성은 없는 것으로 확인되었고, 유통 약재에서도 前胡로 판단되는 약재와 峨參으로 확인된 약재 간에 유사성이 전혀 없는 것으로 확인되었다.
- 이화학적 분석 결과, 중국 산지로 표시되어 있거나 중국산으로 추정되는 약재는 외부 형태적 감별에서의 결과와 마찬가지로 약재 간 편차가 심하게 나타났고, 기원 약재와의 관련성이 큰 약재가 적었다. 특히 시료 3, 4, 7의 경우 전혀 군집을 형성하지 못했고, 이 중 시료 7은 오히려 峨參과 유사한 것으로 나타나 세 약재 모두 비록 前胡로 유통되지만 前胡가 아닐 확률이 높은 것으로 나타났다.
- 주성분분석 (principal component analysis, PCA)를 통해 기원 약재와 유통 약재의 군집분석을 시행한 결과, 紫花前胡와 시료 6이 가장 가까운 군집을 형성하고 시료 5가 이 둘과 근접한 형태의 군집을 이루었다. 白花前胡는 시료 1, 2, 8, 9, 10과 군집을 이루었고, 峨參은 시료 11-22와 조밀한 군집을 이루는 것으로 나타났다.
- 이화학적 분석 결과, 중국 산지로 표시되어 있거나 중국산으로 추정되는 약재는 외부 형태적 감별에서의 결과와 마찬가지로 약재 간 편차가 심하게 나타났고, 기원 약재와의 관련성이 큰 약재가 적었다. 특히 시료 3, 4, 7의 경우 전혀 군집을 형성하지 못했고, 이 중 시료 7은 오히려 峨參과 유사한 것으로 나타나 세 약재 모두 비록 前胡로 유통되지만 前胡가 아닐 확률이 높은 것으로 나타났다. 따라서 중국에서 수입되는 前胡를 약용으로 사용할 경우 약재에 대한 감별을 정확히 하여오용하지 않도록 주의가 필요하다.
- 이러한 기준을 바탕으로 유통 약재인 시료 1부터 22까지의 chromatogram 상에서도 선정 기준에 부합하는 peak들을 선정하였다. 패턴 확인 결과 시료 1-10까지는 각 시료별로 상이한 chromatogram 패턴을 보여 약재간에 유사성이 높지 않은 것으로 나타났고, 시료 11-22까지는 약재 간에 서로 비슷한 패턴이 나타나 유사성이 높은 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
- 따라서 중국에서 수입되는 前胡를 약용으로 사용할 경우 약재에 대한 감별을 정확히 하여오용하지 않도록 주의가 필요하다. 한국 산지로 표시되거나 한국산으로 추정되는 전호의 경우 기원 약재와의 상관성이 매우 높게 나타나고 시료 간 편차 또한 매우 적게 나타나서 유통 약재는 모두 峨參으로 인정할 수 있었고, 또한 품질 관리의 측면에서는 균질성과 동등성이 확보되었다. 하지만 峨參은 전호의 기원종인 紫花前胡와 白花前胡와의 유사성이 전혀 없는 다른 종류의 약재로 확인되었다.
후속연구
- 이상의 내용을 바탕으로 전호류 약재를 비교한 결과, 峨參이 前胡로 사용되는 것은 반드시 지양되어야 하고, 중국에서 수입되는 前胡류 약재는 정확한 약재 감별과 품질 관리를 통해 前胡 본래의 약효가 임상에서 정확히 발휘될 수 있도록 해야 할 것으로 사료된다.
- 그리고 한국 산지 또는 한국산 전호의 경우 모두 峨參으로 확인되어 품질 균질성이나 동등성 면에서는 중국산보다 월등하게 높게 나타났지만 峨參 은 紫花前胡나 白花前胡와 외부형태나 chromatogram상에서 차이를 보이는 것으로 나타났기 때문에 前胡와는 상당히 다른 방향으로 약효가 발휘될 가능성이 농후하다. 추후 약효에 관한 생물학적 활성이나 임상적 연구가 뒷받침되어야 할 필요성이 있지만, 본 연구 결과만으로도 충분히 峨參이 전호로 사용 되지 않아야 할 근거가 제시되었다고 판단할 수 있다.
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