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문제 정의
- 이러한 논의 중 APP 형질전환 초파리를 활용한 치매치료제 개발은 아직 미미하고 이를 직접 이용한 효과 실험은 현재까지 이루어진 바가 없다. 따라서 APP를 분자생물학적으로 조작한 초파리에 대하여 연구해 보는 것은 극히 중요하다고 생각하여 본 연구 실험을 진행하게 되었다.
- 또한 항산화34,35), 면역기능강화36,37) 등의 약리적효능과 중추신경계의 작용으로 학습 및 기억에 관한 작용이 보고38)되고 있지만 치매 초파리 모델을 통한 紅蔘의 작용에 관한 연구는 아직 없었다. 이에 저자는 紅蔘水抽出物(Ginseng Radix Rubra Water Extract, RGE)을 APP(Amyloid precursor protein) 형질 전환한 초파리를 이용하여 초파리의 생존률, 비행 상승 능력, 비행횟수를 정상군과 RGE를 투여한 그룹과 비교 관찰한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- APP로 형질 전환된 초파리에서 紅蔘 水抽出物을 이용하여 신경세포의 세포사 유도에 대한 억제와 신경세포 보호효과를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5 Cm의 여과지에 5% 과당을 첨가하고 산화적 스트레스를 주기 위해 100 μM의 H2O2를 첨가하였다. 紅蔘 水抽出物을 0, 10, 50, 100, 500 ㎍/ml 농도별로 처리하고 또한 50 ㎍/ml농도로 15일간동안 생존수를 관찰하였다.
- 초파리 사육을 위해 과당 600 g, yeast extract 120 g, 옥수수전분 420 g, bokinin 20 ml, propionic acid 30 ml, agar 60 g을 물 6 L에 녹여서 멸균하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 형질 전환 초파리모델은 야생형인 Drosophila melano gaster W18에 UAS-GAL4 시스템을 통해서 뇌신경세포에 잘 발현되도록 형질 전환된 elav-GAL4와 세포사멸에 관여하는 UAS-GRIM 초파리를 순차적으로 교배시킨 후 이를 다시 APP-GAL4 초파리와 교차교배를 시킨 다음 치매형질 전환모델인 APP-GAL4/UAS-GRIM을 작제하여 유전적으로 잘 발현되는지 그 유무를 RT-PCR를 수행하여 유전자 염기서열을 확인한 후 정확한 치매모델용 초파리를 선정하여 본 紅蔘 水抽出物을 대상으로 치매 치료제 유효성을 검정하였다.
- 초파리의 climbing speed는 야생형인 Drosophila melanogaster W18과 세포사멸이 민감하게 반응하도록 형질 전환된 APP-GAL4/UAS-GRIM 초파리 성체 3-day-old-females을 대상으로 18 cm-long vials에서 수행하였다. 실온에서 1시간동안 환경에 적응 시킨 다음 초파리가 완전히 바닥에 앉아 있는 시점을 기준으로 실시하였고 climbing time은 시작부위에서 15 cm 말단부위까지 5번 이상 도달하는 것으로 5회 반복실험을 수행하였다. Flight assay는 3일된 암컷과 30일된 암컷을 대상으로 Pesah방법을 적용하여 수행하였다.
- 이에 저자는 APP로 형질 전환된 초파리에서 정상군, APP 형질 전환군 그리고 APP 형질 전환군에 紅蔘水抽出物을 50 ㎍/ml 농도로 처리한 실험군으로 구별하여 생존율과 비행능력, 비행횟수에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 초파리의 climbing speed는 야생형인 Drosophila melanogaster W18과 세포사멸이 민감하게 반응하도록 형질 전환된 APP-GAL4/UAS-GRIM 초파리 성체 3-day-old-females을 대상으로 18 cm-long vials에서 수행하였다. 실온에서 1시간동안 환경에 적응 시킨 다음 초파리가 완전히 바닥에 앉아 있는 시점을 기준으로 실시하였고 climbing time은 시작부위에서 15 cm 말단부위까지 5번 이상 도달하는 것으로 5회 반복실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (VS-9108 MS, vision scientific Co.), light microscope (Olympus), confocal immunofluorescence microscope (Olympus), Scanning Electron Microscope (FESEM / EDS, JEOL JSM-6300 F/ LINKeXL) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 紅蔘 水抽出物(이하 RGE)은 원광대 한의과대학에서 사용 중인 紅蔘 1 Kg을 엄선하여 세말한 다음 적당량의 3차 증류수 5,000 mL를 첨가하여 65℃에서 8시간 열탕을 가한 다음 식힌 후 RGE 600 g중에서 동결건조 하여 150 g을 회수하여 사용 전 -80℃에 보관하여 3차 증류수로 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 초파리는 세포사멸이 민감하게 반응하도록 형질 전환된 APP-GAL4/UAS-GRIM 초파리를 대상으로 수컷 25마리를 2.5 Cm X9.5 Cm의 플라스틱 바이알에 정사각형 1.5 Cm의 여과지에 5% 과당을 첨가하고 산화적 스트레스를 주기 위해 100 μM의 H2O2를 첨가하였다.
- 실험에 사용된 시약은 DMEM배지, fetal bovine serum (FBS), penicillin /streptomycin, trypsin (Gibco BRL), Ethanol (Merck, Germany), anti-Alexa Fluor 568 mouse IgG 및 ECL kit는 Amershrm pharmacia에서, 2차 항체인 FITC, Alexa Fluor 568은 Molecular Probe사에서 구입하였고, 시약은 모두 특급 및 일반시약을 사용하였다.
데이터처리
- (n>10) 단 통계는 T-test를 사용하였으며 유의수준(P)은 0.05로 정해 P<0.05는 유의한 것으로 판단하였다.
- 실험결과는 평균± 표준편차로 나타내었으며 처리에 대한 결과의 유의성 검정은 student's t-test로 분석하였고, p<0.05인 경우, 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- 실온에서 1시간동안 환경에 적응 시킨 다음 초파리가 완전히 바닥에 앉아 있는 시점을 기준으로 실시하였고 climbing time은 시작부위에서 15 cm 말단부위까지 5번 이상 도달하는 것으로 5회 반복실험을 수행하였다. Flight assay는 3일된 암컷과 30일된 암컷을 대상으로 Pesah방법을 적용하여 수행하였다. (n>10) 단 통계는 T-test를 사용하였으며 유의수준(P)은 0.
성능/효과
- 1. 紅蔘 水抽出物은 p<0.005 범위 내에서 APP로 형질 전환된 초파리에 대한 억제효과로 인해서 유의성 있게 개체 생존율을 증가시켰다.
- 2. 紅蔘 水抽出物는 APP로 형질 전환된 초파리에서 신경계 손상에 의한 상승능력을 증가시켰다.
- 3. 紅蔘 水抽出物는 APP로 형질 전환된 초파리에서 비행횟수의 운동장애를 유의성 있게 억제하였다.
- 30일이 경과한 후에는 야생형인 정상군에서 4회인데 반해 대조군의 경우 약 16±1회로 비행횟수가 늘어남을 알 수 있고, 紅蔘 水抽出物 처리군은 9±1회로 대조군에 비해 큰 변화를 보였다(p<0.005)(Fig. 3).
- APP-grim 형질전환 초파리군의 비행능력에 대한 紅蔘 水抽出物의 효과를 조사하기 위해 Flight assay를 수행한 결과 비행시간 10분 동안 정상군은 평균적으로 비행횟수가 3회 정도이며 대조군의 경우 약 17±1회인데 반해 紅蔘水抽出物 처리군은 7±1회로 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다(p<0.005).
- APP-grim 형질전환 초파리군의 비행능력에 대한 紅蔘 水抽出物의 효과를 조사하기 위해 초파리의 상승능력을 관찰한 결과 비행정도가 최초 3일에서 정상군을 100%로 환산하였을 때, 대조군의 경우 약 11±2%인데 반해 紅蔘水抽出物 처리군은 82±3%로 유의성 있게 증가하였고(p<0.005), 30일이 경과한 후에는 대조군의 경우 약 6±1%인데 반해 紅蔘 水抽出物 처리군은 79±3%로 30일 경과에는 약간의 감소하는 변화를 보였다(p<0.005)(Fig. 2).
- APP-grim으로 형질 전환된 초파리에 있어서 신경세포사멸로 인한 개체 생존의 치명적손상에 대한 紅蔘 水抽出物의 효과에 대해 야생형 초파리 정상군과 APP -grim 형질전환 초파리 대조군 APP-grim 형질전환 초파리에 H2O2 처리한 대조군 그리고 紅蔘 水抽出物 50 ㎍/ml로 처리한 실험군의 생존율을 15일간 관찰한 결과 개시 전에는 각각 25마리였으나 15 일경과 후에는 정상군은 19±0.5마리로 나타났고, 대조군인 APP/GRIM은 3±0.5마리, APP/GRIM와 H2O2 동시 처리군에서는 2±0.5 마리였으며 紅蔘 水抽出物 처리군은 17±0.5마리였는데 특히 紅蔘 水抽出物이 p<0.005 범위내에서 유의성 있게 APP 형질전환 초파리에 대해 억제효과로 인해 개체 생존율을 증가시켰다(Fig. 1).
- 따라서 부작용이 적으며, 효능이 좋고, 원인적 치료까지 가능한 새로운 기억력 개선 및 치매치료제를 개발하는 것이 절실히 요구되는 현실이다. 결론적으로 이런 단점들을 보완한, 오랜 기간 지속적으로 부작용 없이 독성이 낮고 강력한 콜린신경계통 증진효과를 가지며 감퇴된 학습과 기억력을 개선시켜줄 수 있는 뇌보호 및 뇌기능향상에 도움을 주는 소재로 천연물제제를 개발하는 것은 매우 가치 있는 일이라 할 수 있다.
- 따라서 일정 높이에서 정상군은 체공시간이 길고 APP 형질전환 초파리군은 짧은데 APP 형질전환 초파리군에서 紅蔘 水抽出物의 효과에 대한 체공시간을 조사하기 위해 초파리의 상승능력을 관찰한 결과 비행정도가 최초 3일에서 정상군 100% , 대조군 약 11±2%인데 반해 紅蔘 水抽出物 처리군은 82±3%로 유의성 있게 증가하였고(p<0.005), 30일이 경과한 후에는 대조군 약 6±1%인데 반해 紅蔘 水抽出物 처리군은 79±3%로 약간의 감소하는 변화를 보였다(p<0.005)(Fig. 2).
- 야생형 초파리 정상군과, APP-grim 형질전환 초파리 대조군, 대조군에 H2O2동시처리군, 紅蔘 水抽出物 50 ㎍/ml로 처리한 실험군의 생존율을 15일간 관찰한 결과 개시전에는 각각 25마리였으나 실험 초기경우부터 정상군은 22±0.5 마리로 나타났고, 대조군인 APP/GRIM은 17±0.5마리, APP/GRIM와 H2O2 동시 처리군에서는 10±0.5마리였으며 15일경과 후에는 정상군은 19±0.5마리로 나타났고, 대조군인 APP/GRIM은 3±0.5마리, APP/GRIM와 H2O2동시 처리군에서는 2±0.5 마리였으며 紅蔘 水抽出物을 처리한 실험군은 17±0.5마리였는데 특히, 紅蔘 水抽出物이 p<0.005 범위 내에서 유의성 있게 APP 형질전환 초파리에 대한 억제효과로 인해 개체 생존율을 증가시켰다(Fig. 1).
- 이에 초파리의 Flight assay를 관찰한 결과 비행시간 10분간 평균 비행횟수가 정상군 3회, 대조군 약 17±1회인데 반해 紅蔘 水抽出物처리군은 7±1회로 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다(p<0.005).
후속연구
- 또한 ginsenoside 일부 성분이 AD의 원인으로 추정되는 Aβ에 대한 신경독성에 대한 보호효과68가 밝혀지고 최근의 연구에서는 紅蔘의 non-saponin계열 일부 성분이 중추신경세포기능에 미치는 영향이 보고69) 되는 상황에서 독성과 부작용이 화학약물에 비해 적고 임상적 효능이 우수한 천연 한약재인 紅蔘에 대한 항치매효과에 대한 실험적 고찰이 요구된다.
- 이상의 결과와 같이 APP 형질전환 초파리를 이용하여 만든 신경손상 모델에서 紅蔘 水抽出物의 신경보호효과를 관찰한 결과 紅蔘水抽出物이 APP 형질전환 초파리의 생존율을 높이고 손상된 신경계에 따른 상승능력과 비행횟수의 운동장애를 유의성 있게 억제하여 신경독성에 대한 보호, 치료효과가 있는 것으로 나타나 치매를 포함한 퇴행성 뇌질환에 임상응용의 중요한 근거가 될 수 있을 것으로 사료되며, 향후 다른 단일 약재 및 복합처방과의 비교실험을 통해 치매에 효과적인 치료제개발을 위한 지속적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 연구결과를 종합하여 보면 紅蔘 水抽出物은 APP로 형질전환 된 초파리에서 신경세포의 세포사를 억제하고 신경세포를 보호하므로, 뇌세포의 사멸에 의한 알츠하이머 치매를 포함한 다양한 퇴행성 뇌질환에 대해서도 임상적 근거가 가능할 것으로 사료된다.
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