[논문]자연동(自然銅)의 투여가 인체의 뼈모세포 활성과 생쥐 정강이뼈 골절에 미치는 영향

황지혜; 안지현; 김진택; 안상현; 김경호; 조현석; 이승덕; 김은정; 김갑성

[국내논문] 자연동(自然銅)의 투여가 인체의 뼈모세포 활성과 생쥐 정강이뼈 골절에 미치는 영향
Effects of Administration of Pyritum on Activation of Osteoblast Cells in Human Body & on Tibia Bone Fracture in Mice 원문보기

大韓鍼灸學會誌= The journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society, v.26 no.2, 2009년, pp.159 - 170

Abstract ▼ AI-Helper

Backgrounds and Objectives: A fracture means a loss of continuity in the substance of bone. Bone differs from other musculoskeletal tissue due to its ability to repair and heal itself without leaving a scar. The cutter head has multinucleated osteoclast cells to resorb the dead bone. The tail, with its conical surface, is lined with osteoblast cells laying down new bone. The conjugation of fracture is a unique biological process regulated by a complex array of signaling molecules and proinflammatory cytokines. Pyritum, one of the important prescriptions in the oriental medicine, has been used for conjugation fracture. The purpose of this study is to evaluate the effects of administration of Pyritum on activation of osteoblast cells in human body & on tibia bone fracture in mice. Materials and Methods : Four weeks aged 30 female DBA mice were used for this study. They were divided three groups, normal group, control group(fracture elicitate mice: FE group) and experimental group(Pyritum administered mice group after fracture elicitation : PA group). Left tibia bones of mice in FE and PA groups were fractured by bone cutters. MG-63 cells in human body th Pyritum in the ratio of 1 mg/m${\ell}$, and the cells were further incubated for 24 hours. Activation of osteoblast was identified using osteopontin, FGF in vitro test. In vivo test, regeneration of fractured tibia through the morphological changes was observed, and also activation of inflammation through NF-${\kappa}$B p65, iNOS, COX-2, osteoblast through osteopontin, FGF and osteoblast's proliferation in each group was measured. Results and Conclusions : 1. In vitro test for activation of osteoblast cells in human body by Pyritum, osteopontin and FGF production were remarkably increased in Pyritum treated MG-63 cells. 2. In regeneration of fractured tibia by Pyritum, fractured area in external tibia morphology was decreased more in the PA group than that of the FE group. Osteogenesis in fractured area was increased more in the PA group than that of the FE group. Also, endochodrial ossification in central area of fracture and osteoid in lateral area of fracture were increased more in the PA group than those of the FE group. 3. In activation of inflammation by Pyritum administered, activation of NF-${\kappa}$B p65, increase of iNOS and COX-2 production were higher in the PA and the FE groups than those of the control group. Especially, the PA group showed higher activation and increase than those of the FE group. 4. In activation of osteoblast by Pyritum, increase of osteopontin, FGF and osteoblast's proliferation were higher in the PA and the FE groups than those of the control group. Especially, the PA group showed higher increase and proliferation than those of the FE group.

주제어

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문제 정의

消瘀血, 續筋骨의 효능을 갖는다는 自然銅의 골절에 대한 치료효과를 조사하기 위해 행해진 본 연구는 MG-63 세포를 이용하여 自然銅이 뼈모세포 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 인위적으로 생쥐 종아리뼈 골절을 유발한 후 골절부위의 형태변화, 뼈 모세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였고, 골절부위의 순차적으로 일어나는 염증반응 변화를 염증 전사인자 NF-kB와 염증효소인 iNOS와 COX-2의 골절부위 내 분포변화를 통해 면역조직 학적으로 관찰하였다.
이에 저자는 自然銅의 골절에 대한 효과를 조사하기 위하여 인체의 MG-63 세포를 이용하여 뼈 모세포 활성에 미치는 영향, 인위적으로 생쥐 정강이뼈 골절을 유발한 후 골절부위의 형태변화, 뼈모세포 활성에 미치는 영향 및 골절부위에 순차적으로 일어나는 염증반응 변화를 염증 전사인자 NF-kB와 NF-kB에 의해 활성되는 염증효소인 iNOS와 COX-2의 골절 부위 내 분포변화를 통해 면역조직학적으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

가설 설정

A : Activation of NF-kB p65 (arrow, NF-kB p65 im munohistochemistry, xlOOO).

제안 방법

그리고 1차 항체인 mouse anti mouse NF-kB p65(l : 500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse iNOS(l: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 rabbit anti mouse COX-2(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4 °C humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체 인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 biotinylated goat anti rabbit IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4〔C humidified chamber에서 24시간 link 하였다. ABC에 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 후 DAB에서 발색시킨 후, hematoxylin(Sigma, USA)으로 대조염색하여 광학 현미 경 으로 관찰하였다.
Avidin biotin complex(ABC, DAKO, Denm询k) 에 1 시간동안 실온에서 반응시킨 후 0.05% 3, 3'- diaminobenzidine(DAB, Sigma, USA)과 0.01% HC₁ 이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
in vitro 에서 自然銅 투여 량은 MTT assay 결과 10 岫皿까지 세포생존율의 변화가 관찰되지 않았으므로 1회 투여량을 1.0m衫戒로 결정하였다.
自然銅 투여가 골절에 대한 치료효과를 조사하기 위해 본 연구는 MG-63 세포를 이용하여 自然銅이 인체의 뼈모세포 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 인위적으로 생쥐 정강이뼈 골절을 유발한 후 골절 부위의 형태학적 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
自然銅을 실험군(PA)군에 50mg/Wday^ 비율로 1회 Irrwl회/1일을 생리식염수 0.1ml에 녹여서 intubation tube를 이용하여 투여하였다.
自然銅이 뼈모세포의 osteopontin과 fibroblast growth factor(FGF) 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 MG-63 세포를 이용한 면역조직화학을 실시하였다.
골절 유발 제21일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% neutral buffered formalin으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 정강이뼈를 decalcification solution(BBC, UK) 에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5伽 두께로 연속절편을 만들었다.
안쪽 (anterio-medial) 피부를 절개하여 정강이뼈의 앞모서리를 확인한 다음 bone cutters (FST, Canada) 사용하여 발목쪽 1/3 지점의 정강이뼈에 골절을 유발하였다. 골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드 (Kinesio, Japan)로 고정하였다. 골절 유발 3일 후 발쪽 부위를 조사하여 괴사 증후가 없는 것을 선별하여 실험에 사용하였다.
골절부위의 외부형태적 변화를 영상분석 하기 위해 정강이뼈 주변의 근육을 제거한 후 정강이뼈를 x4 배율로 촬영하였다. Optimas 5.
01%의 proteinase K(DAKO, Denmark)가 포함된 normal goat serum에 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 1차 항체인 mouse anti mouse BrdU(l : 50, Amersham, UK)에 4°C incu bation chamber내에서 72시간 반응시켰고, 이후 동일한 과정으로 면역조직학적 염색을 실시하였다.
Mayers hematoxylin(Sigma, USA)에 5분간 핵 염색한 후 pHoxine 용액(Sigma, USA) 30분간 반응시켰다. 그런 다음 tartrazine 용액(Sigma, USA)에서 분별 후 광학현미경으로 관찰하였다
억제하였다. 그리 고 1 차 항체 인 mouse anti mouse osteo- pontin(l: 100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse b-FGF(l : 100, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4°C humidified chamber■에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체 인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l: 50, DAKO, Denmark) 에 4 °C humidified chamber 에서 1 시간 link 하였다.
우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1: 20, DAKO, Denmark) 에서 12시간 동안 반응 시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse NF-kB p65(l : 500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse iNOS(l: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 rabbit anti mouse COX-2(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4 °C humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체 인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 biotinylated goat anti rabbit IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4〔C humidified chamber에서 24시간 link 하였다. ABC에 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 후 DAB에서 발색시킨 후, hematoxylin(Sigma, USA)으로 대조염색하여 광학 현미 경 으로 관찰하였다.
그리고 1차 항체인 mouse anti mouse osteopontin(l: 100, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4°C 에서 1 시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리 고 1 차 항체 인 mouse anti mouse osteo- pontin(l: 100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse b-FGF(l : 100, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4°C humidified chamber■에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체 인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l: 50, DAKO, Denmark) 에 4 °C humidified chamber 에서 1 시간 link 하였다.
적출된 정강이뼈를 decalcification solution(BBC, UK) 에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5伽 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin-Eosin법으로 염색하여 표본을 제작하였다.
역할을 한다. 본 실험에서는 自然銅 처리 후 골절 부위에 순차적으로 일어나는 염증반응 변화를 염증 전사인자 NF-kB와 염증효소인 iNOS와 COX-2의 골절 부위 내 분포변화를 통해 면역조직학적으로 관찰하였다. 골절부위내 전염증효소(IL-1, IL-6, TN 頂-a)의과도한 증가는 IkB kinase로 알려진 IKK(IKKa, 를활성화시켜 IkB protein의 serine residue를 인산화시킴으로써 불활성화된 상태로 세포질에 존재하는 NF- kB의 세포내 작용을 유도하며, 그 결과 골절부위에서 NF-kB 활성은 증가된다36節.
본 실험에서는 自然銅을 贱紅하여 米醋에 담금질하는 과정을 7회 반복한 후 水飛한 침전물을 사용하였다. 煨紅하면 황철석질 自然銅은 자류철석 으로 전환되므로 새로운 결정입자의 경계면이 생기고 동시에 As, S가 흩어져 없어지며, 이것은 분쇄와 치료 효과를 발휘하는데 유리하다고 알려져 있다.
그런 다음 binary morphology에서 invert 기능을 선택하여 골절부위를 intensity 180-200 으로 전환. 부각시 킨 다음, Histogram을 통해 동일 영역의 pixel을 계수하였다.
뼈모세포에서 생성되는 osteopontin과 성장물질 FGF의 골절부위내 분포변화를 조사하기 위해 mouse anti osteopontin(l : 50, Santa Cruz Biotec)항체와 mouse anti FGF(1 : 200, Santa Cruz Biotec) 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
FGFs는 20-35kDa으로 osteogenesis의 중요한 조절자로, 성숙 뼈 모세포의 세포분열을 촉진시킬뿐만 아니라, alkaline phophatase(ALP), Osteocalcin, Osteopontin 등과 같은 다양한 matrix protein 생성에 관여한다4’汕 본 실험 에서 FGF 양성 반응세포가 증가하였고 세포분열 중인 뼈모세포도 증가하였다. 세포분열중인 뼈 모세포의 확인은 thymidine analogue인 BrdU®를 통해 이루어졌다.
실험은 무처치한 정상군(NOR), 정강이뼈 골절 유발군(fracture eHcitate: FE) 및 정강이뼈 골절 유발 후 자연동 투여군(Pyritum administered : PA)으로분류하였으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
안쪽 (anterio-medial) 피부를 절개하여 정강이뼈의 앞모서리를 확인한 다음 bone cutters (FST, Canada) 사용하여 발목쪽 1/3 지점의 정강이뼈에 골절을 유발하였다. 골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드 (Kinesio, Japan)로 고정하였다.
염 증유발유전자들을 조절하는 전사인자 NF-kB, 염증 효소인 iNOS와 COX-2의 골절부위내 분포를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1: 20, DAKO, Denmark) 에서 12시간 동안 반응 시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다.
우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1: 20, DAKO, Denmark) 에서 12시간 동안 반응 시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse NF-kB p65(l : 500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse iNOS(l: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 rabbit anti mouse COX-2(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4 °C humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체 인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 biotinylated goat anti rabbit IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4〔C humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
stain법을 실시하였다. 우선 조직을 Wrights stain solution(Sigma, USA) 에 30분간 반응 후 stop buffer를 처리한 다음 관찰하였다.
영향을 조사하였다. 인위적으로 생쥐 종아리뼈 골절을 유발한 후 골절부위의 형태변화, 뼈 모세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였고, 골절부위의 순차적으로 일어나는 염증반응 변화를 염증 전사인자 NF-kB와 염증효소인 iNOS와 COX-2의 골절부위 내 분포변화를 통해 면역조직 학적으로 관찰하였다.
실시하였다. 적출된 정강이뼈를 decalcification solution(BBC, UK) 에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5伽 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin-Eosin법으로 염색하여 표본을 제작하였다.
한편 뼈모세포의 세포분열 조사를 위해 항 BrdU 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였는데, 우선 정강이뼈를 적출하기 5시간 전, 3시간 전, 1시간 전에 생리식염수에 녹인 S-bromo-Z-deoxyuridine (BrdU; Sigma, USA) 50板kg을 복강주사하였다. 얻어진 연속절편은 4°C와 37°C의 2N HC₁ 용액에서 각각 20분씩 반응시켜 DNA-denaturation을 일으켰다.

대상 데이터

自然銅(PyHtum)은 동국대학교 한의과대학 분당한방병원 조제실에서 購入하여 精選한 후 煨紅하여 自然銅 500g당 米醋 250ml의 비율로 米醋에 담금질하는 과정을 7회 반복한 후 분쇄하여 곱게 가루로 만들고 혼탁함이 제거될 때까지 水飛하여 남은 침전물을 사용하였다과).
골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드 (Kinesio, Japan)로 고정하였다. 골절 유발 3일 후 발쪽 부위를 조사하여 괴사 증후가 없는 것을 선별하여 실험에 사용하였다.
Korea)에서 구입하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ incubator(Sanyo, Japan) 에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA) 가 함유된 DEbecco's modified Eagles medium(DMEM, Welgin, Korea)을사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/i也 penicillin(Sigma, USA), 100/zg/m£ streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.
인체 뼈모세포인 MG-63 세포는 Korean CeU Line Bank(KCLB; Korea)에서 구입하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ incubator(Sanyo, Japan) 에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA) 가 함유된 DEbecco's modified Eagles medium(DMEM, Welgin, Korea)을사용하여 배양하였다.
태령 4주된 DBA 암컷 생쥐(오리엔트, 대한민국)를고형사료(삼양, 대한민국)와 물을 충분히 공급하면서 무균사육 장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 20g 된 생쥐를 선별하여 사용하였다.

데이터처리

면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2(Optima Co, USA)를 이 용한 영 상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000(SPSS INC, USA)을 통해 student-t test로 유의성을 검증하였다.
2(Optima Co, USA)를 이 용한 영 상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000(SPSS INC, USA)을 통해 student-t test로 유의성을 검증하였다.

이론/모형

골절부위에 뼈 기질 생성 변화를 조사하기 위해 Phloxine-tartrazine 염색법을 실시하였다. Mayers hematoxylin(Sigma, USA)에 5분간 핵 염색한 후 pHoxine 용액(Sigma, USA) 30분간 반응시켰다.
골절부위에 연골성 뼈 발생 변화를 조사하기 위해 Wrights stain법을 실시하였다. 우선 조직을 Wrights stain solution(Sigma, USA) 에 30분간 반응 후 stop buffer를 처리한 다음 관찰하였다.

성능/효과

1.自然銅을 처치한 인체의 MG-63 세포에서 osteopontin과 FGF의 생성이 증가되었다.
이렇게 유리된 NF-kB는핵으로 들어가 target 유전자의 NF-kB binding site (consensus sequence: 5'-GGGpuNNPyPyCC-3') 에 결합하여 염증관련유전자의 발현을 유도하는데3®, 특히 NO 생성에 관련된 iNOS와 prostagladin 생성에 관련된 COX-2 유전자 발현을 일으킨다. 골절부위의 iNOS 발현 증가는 NO에 의한 혈관투과성 증가를 유도하여 39) 혈관붕괴로 인해 hypoxia 상태인 골절 부위에 。2 공급을 향상시킴으로써 osteoblast, chondroblast, adipocytes, myoblast 등과 같은 mescenchymal stem cell-기원세포의 이주를 증진시켜4® 골절부위의 remodeling 을 유도한다⑴ 본 실험에서 골절부위의 iNOS 생성 증가와 혈관신생성의 증가도 관찰되었다. 한편 유도성 동종효소(inducible isoform)로 섬유 모세포와 대식세포를 포함한 여러 세포에서 발현되는 COX-2”由는 성장인자와 mitogen에 유도되어 pros tagladin 분비 지속을 통해 bone healing관여하는데气 non-steroidal anti-inflammatory drug(NSAID) 인 COX- 2 저해제는 골절환자의 5-10%에서 치료 지연을 일으키고 46), 실제 생쥐 골절모델에서 골 생성을 억제하였다 47).
2. 自然銅을 투여한 생쥐 종아리뼈 골절부위에서연골성 뼈 발생과 뼈기질 생성이 증가하였다.
3. 뼈기질 주변에서 뼈모세포의 활성 중 osteopontin 과 FGF 양성반응이 증가하였으며 BrdU 반응 또한 증가하였다.
4. 골절부위에서 NF-kB의 활성 증가를 통한 염증반응 지표인 iNOS와 COX-2 양성반응도 증가하였다.
FGF의 생성은 정상군(NOR)의 267±€/200, 000particles 에 비하여 대조군(FE)은 1356±26/200, 000p articles로 증가하였으며, 대조군(FE)에 비하여 실험군(PA)은 6748±39/200, 000particles로서 유의성 (p<0.05) 있는 증가를 나타내었다(Table. 2).
FGF의 양성반응은 골절부위 주변의 골 성조 직과 인근 염증발생부위에 관찰되었고, 세포질 가장자리에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 FGF 양성반응은 정상군(NOR)에 비해 대조군(FE)과 실험군(PA)에서 모두 증가하지만, 특히 실험군(PA)에서 더 큰 증가를보였다(Fig.
MG-63 세포에서 관찰되는 FGF 양성 반응은 세포질 가장자리에서 강하게 나타났으며, 自然銅 처치 MG-63 세포군에서 증가한 것으로 측정되었다. 自然銅 처치 MG-63 세포군의 FGF 양성반응이 自然銅 무처치 MG-63 세포군 (1315+15/100, 000 particles) 에비해 127%(2990±13/100, 000 particles)로서 유의성 (p< 0.
MG-63 세포에서 관찰되는 osteopontin 양성 반응은 핵주변 세포질에서 강하게 나타났으며, 自然銅 처치 MG-63 세포군에서 증가한 것으로 측정되었다. 自然銅 처치 MG-63 세포군의 osteopontin 양성반응이 自然銅 무처치 MG-63 세포군(649±7/100, 000 particles) 에 비해 154%(1651+14/100, 000 particles)로서 유의성 (p<0.
NF-kB p65 활성 조사에서 정상군(NOR)의 213±6/ lOQOOOpardcles에 비하여 대조군(FE)은 885±14/100, 000 particles 및 실험군(PA)은 3561±55/100, OOO particles로 모두 증가하였으며, 특히 실험군이 대조군(FE)에 비하여 유의성 (p<0.05) 있는 증가를 나타내었다(Table. 1).
osteopontin 생성은 정상군(NOR)의 141+6/200, 000 particles에 비하여 대조군(FE)은 797+9/200, 000 par- ticles로 증가하였으며, 대조군(FE)에 비하여 실험군 (PA)은 1953+47/200, 000 particles로서 유의성 (p<0.05) 있는 증가를 나타내었다(Table. 2).
처치 MG-63 세포군의 osteopontin 양성반응이 自然銅 무처치 MG-63 세포군(649±7/100, 000 particles) 에 비해 154%(1651+14/100, 000 particles)로서 유의성 (p<0.05) 있게 증가하였다(Fig. 1-B, D).
自然銅 처치 MG-63 세포는 세포질 가장자리가 잘발달된 것으로 관찰되었으며, 활성된 형태의 세포 수도 自然銅 무처치 MG-63 세포군에 비해 증가된 것으로 관찰되었다(Fig. 1-A).
또한 自然銅을 투여한 생쥐 정강이뼈 골절부위에서 연골성뼈발생과 막성뼈발생으로 인한 뼈기질 생성이 증가하였고, 뼈기질 주변에서 뼈모세포의 활성(osteopontin 과 FGF 양성반응 증가)와 증식 (BrdU 반응 증가) 이일어났다. 또한 골절부위에서 NF」kB의 활성(NF나出 P65 양성반응 증가)을 통한 염증반응 증가(iNOS와 COX-2 양성반응 증가)도 확인되었다.
또한 自然銅을 투여한 생쥐 정강이뼈 골절부위에서 연골성뼈발생과 막성뼈발생으로 인한 뼈기질 생성이 증가하였고, 뼈기질 주변에서 뼈모세포의 활성(osteopontin 과 FGF 양성반응 증가)와 증식 (BrdU 반응 증가) 이일어났다. 또한 골절부위에서 NF」kB의 활성(NF나出 P65 양성반응 증가)을 통한 염증반응 증가(iNOS와 COX-2 양성반응 증가)도 확인되었다. 自然銅은 NF- kB 활성을 통한 염증반응과 뼈모세포 활성을 통해서 뼈 기질 생성을 유도하여 골절부위 골생성에 효과가 있을 것으로 기대된다.
배지를 제거한 후 vascular rinse와 10% neutral buffered formalin으로 고정을 실시하고, Slide를 blocking serum인 10% nonnal goat serum(l : 20, DAKO, Denmark)에서 1 시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다.
한편 유도성 동종효소(inducible isoform)로 섬유 모세포와 대식세포를 포함한 여러 세포에서 발현되는 COX-2”由는 성장인자와 mitogen에 유도되어 pros tagladin 분비 지속을 통해 bone healing관여하는데气 non-steroidal anti-inflammatory drug(NSAID) 인 COX- 2 저해제는 골절환자의 5-10%에서 치료 지연을 일으키고 46), 실제 생쥐 골절모델에서 골 생성을 억제하였다 47). 본 실험에서 COX-2 생성 증가가 관찰되었다. 뼈형성(bone formation)은 mescenchymal stem cell이 뼈모세포(osteoblast)로 분화, 성숙됨으로써 시작되는데, 그 과정에 fibroblast growth factor(FGF) family와 receptors(FGFR)가 참여하게 된다.
또한 osteopontin-/- mice에서 NF-kB 활성 억제와 그에 따른 anti-apotosis factor의 생성 억제한다37) 는결과로 미루어 osteopontin은 골절조직내 염증 활성에도 관여하는 것으로 생각된다. 본 실험에서 osteo- pontin은 뼈 생성 지역에서 증가하였다.
세포분열중인 뼈모세포에서 관찰되는 BrdU의 양성반응은 정상군(NOR) 의 102±7/200, 000particles에 비하여 대조군(FE) 은 536±7/20O, 00Oparticles로 증가하였으며, 대조군(FE)에 비하여 실험군(PA)은 1910土 24/200, OOOparticIes로서 유의성 (p<0.05) 있는 증가를 나타내었다(Table. 2).
염증 효소인 iNOS의 생성 조사에서 정상군(NOR) 의 197±9/100, 000par击사 es 에 비하여 대조군 (FE) 은 1774±26/100, 000particles 및 실험군(PA)은 4946+95/ lOQOOOparticles로 모두 증가하였으며, 특히 실험군 이대 조 군(FE)에 비하여 유의성(p<0.05) 있는 증가를 나타내었다 (Table. 1).
영상분석에서 COX-2 양성반응은 골절부위에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 COX-2 양성반응은 대조군에 비해 FE군과 PA군에서 모두 증가하지만, PA군에서 더 큰 증가를 보였다(Fig.
영상분석에서 NF-kB p65 세포의 양성반응은 골절 부위에서 광범위하게 관찰되었으며, 특히 핵과 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응을 나타내었다(Fig. 3-A).
영상분석에서 iNOS 양성반응은 골절부위에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 iNOS 양성반응은 대조군에 비해 FE군과 PA군에서 모두 증가하지만, PA군에서 더 큰 증가를 보였다 (Fig.
보였다. 이러한 osteopontin 양성반응은 정상군 (NOR)에 비해 대조군(FE)과 실험군(PA)에서 모두 증가하지만, 특히 실험군(PA)에서 더 큰 증가를 보였다(Fig. 4-A).
이상의 실험결과에서 自然銅 처리한 MG-63세포에서 osteopontin과 FGF의 생성이 증가하였다. 또한 自然銅을 투여한 생쥐 정강이뼈 골절부위에서 연골성뼈발생과 막성뼈발생으로 인한 뼈기질 생성이 증가하였고, 뼈기질 주변에서 뼈모세포의 활성(osteopontin 과 FGF 양성반응 증가)와 증식 (BrdU 반응 증가) 이일어났다.
비해 이러한 뒤틀림은 적었다. 한편 골절 유합 부위를 영상분석 결과, PA군은 FE군(3467±35/100, 000 particles) 에 비해 골절 유합부위가 41%(2033+18/00, 000 particles) 감소한 것으로 측정되었다(Fig. 2-A).
한편 염증 효소인 C0X-2의 생성 조사에서 정상군 (NOR)의 295+9/100, 000particles°11 비하여 대조군(FE) 은 3911±42/100, 000particles 및 실험군(PA)은 5562±W 100, 000partides로 모두 증가하였으며, 특히 실험군 이대 조 군(FE)에 비하여 유의성(p<0.05) 있는 증가를 나타내었다 (Table. 1).

후속연구

또한 골절부위에서 NF」kB의 활성(NF나出 P65 양성반응 증가)을 통한 염증반응 증가(iNOS와 COX-2 양성반응 증가)도 확인되었다. 自然銅은 NF- kB 활성을 통한 염증반응과 뼈모세포 활성을 통해서 뼈 기질 생성을 유도하여 골절부위 골생성에 효과가 있을 것으로 기대된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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