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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 부정근의 유도조건을 확립하고 현탁배양을 통한 최적의 증식방법을 확립하고자 하였다. 또한 이는 경제적 가치가 인정이 되는 식물의 빠르고 효과적인 유전자원증식 및 보존의 측면과 이를 이용한 차세대 건강기능식품의 개발 및 원료공급의 측면에서 향후 상당한 기초자료로 활용이 가능 할 것으로 보여진다.
- 본 연구에서 홍경천의 부정근을 유도할 때 배양부위별 최적 IBA의 농도와 sucrose의 농도를 확립하였다. 또한 이를 바탕으로 250 mL플라스크를 이용한 최적 액체배양 조건을 확립하였다.
제안 방법
- 제조된 각각의 배지위에 잎, 줄기, 뿌리 조직을 10개씩 총 30개를 치상하였다. 4주간 배양한 후에 유도된 부정근의 수를 조사하였다.
- Sucrose의 농도는 30 g/L가 첨가되었을 때 잎, 줄기, 뿌리 절편에서 높은 유도율을 나타났다. 고체배지 조건에서 부정근의 유도율이 가장 우수한 조건을 기본으로 액체배양을 실시하였으며, 염의 농도에 따른 부정근의 증식조건을 조사하였다. 1/3MS 배지에서 홍경천의 부정근을 배양하였을 때 1/2MS, MS 액체배지조건보다 약 2배, 2.
- 액체배양은 새로운 배지 및 영양원의 첨가, 배지의 교체, 배양조직의 계대, 배양 중 시료채취 등이 용이하며 배양체의 생장 또한 빠른 장점이 있다. 따라서 MS 배지에 IBA는 5.0 mg/L sucrose는 30 g/L가 첨가된 배지조건에서 유도된 부정근의 증식을 위해 현탁배양을 시도 하였으며, 최적조건의 액체배양조건을 선발하고자 생체중 1 g의 부정근을 각각 MS, 1/2 MS, 1/3 MS 액체배지 100 ml에 접종하여 7주간 110 rpm으로 액체배양한 결과, 배양 초기에는 생육의 차이가 크게 나타나지는 않았으나 배양 3주가 지나게 되면서 급속한 대수생장을 보이기 시작하였다. 배양 7주 후에 대수 증식기가 완료되어 모든 샘플을 수확한 다음 생체중을 비교한 결과 MS 배지에서 7.
- 본 연구에서 홍경천의 부정근을 유도할 때 배양부위별 최적 IBA의 농도와 sucrose의 농도를 확립하였다. 또한 이를 바탕으로 250 mL플라스크를 이용한 최적 액체배양 조건을 확립하였다. 그렇지만 이러한 조건 확립은 실험실 규모의 부정근 생산조건밖에 되질 않는다.
- 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 기내 부정근의 생산 체계를 확립하였다. 먼저 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 0.1, 1.0, 3.0 및 5,0 mg/L의 IBA와 sucrose가 10, 30, 50 및 100 g/L가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 부정근의 유도율을 조사하였다. 부정근의 유도는 잎, 줄기 절편에서 IBA의 농도가 5.
- 발아 후 잎, 줄기, 뿌리가 정상적으로 자라난 유식물체를 실험의 재료로 사용하였는데, 잎은 1 × 0.5 cm 정도로 3등분 횡절단하여 사용하였고, 줄기는 엽병까지 제거한 후 1cm로 절단하여 사용하였다.
- 최적조건의 액체배지 조성을 선발하고자 고체배지에서 유도된 부정근 1 g을 취해서 고체배지 조건에서 부정근의 유도율이 가장 좋은 MS 배지에 IBA 5 mg/L, sucrose 30 g/L가 첨가된 배지와 IBA와 sucrose의 농도는 동일하지만 염의 농도를 각각 1/2 MS 및 1/3 MS로 희석한 액체배지 100 mL에 접종하였다. 배양용기는 250 mL의 삼각플라스크(Horex, Germany)를 사용하였고, 배양은 7주간 110 rpm으로 현탁배양 하였으며, 1주 간격으로 생중량과 건중량을 측정하여 각각 비교하였다.
- 배양조직과 IBA의 농도가 부정근 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해서 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 조직을 MS배지에 IBA를 0, 0.5, 1.0, 3.0 및 5.0 mg/L까지 다양하게 처리하고 sucrose는 30 g/L로 동일하게 처리한 다음 배양조직을 치상하여 부정근 유도 양상을 조사한 결과는 다음과 같다. 약 2주후부터 배양조직 비대와 동시에 부정근이 유도가 되기 시작하는데 특히 잎, 줄기 절편은 조직비대가 일어난 다음 부정근 유도 현상을 보였고 뿌리절편은 캘러스 형성이 없이 바로 부정근이 유도되는 현상을 보였다(Fig.
- 배양조직과 sucrose의 농도가 부정근 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해서 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 조직을 MS 배지에 IBA는 5.0 mg/L으로 동일하게 처리하고 sucrose의 농도는 0, 10, 30, 50 및 100 g/L로 다양하게 처리한 다음 배양조직을 치상하여 부정근 유도 양상을 조사한 결과는 다음과 같다. 각각의 배양절편체로부터 부정근은 배양 2주 후부터 유도되기 시작했다.
- 절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 Petri dish(SPL, South Korea)당 10개씩, 총 30개씩 각각 치상하였고 25 ± 3℃, 16시간 광주기, 1,900 Lux의 배양실에서 배양하였다. 실험에 사용한 모든 배지와 기구는 121℃, 1.5기압으로 20분간 고온･고압 멸균하여 플라스틱 Petri dish에 각각 30 mL씩 분주하여 실험에 사용하였다.
- 절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 Petri dish(SPL, South Korea)당 10개씩, 총 30개씩 각각 치상하였고 25 ± 3℃, 16시간 광주기, 1,900 Lux의 배양실에서 배양하였다.
- 0 mg/L를 다양하게 첨가하여 배지를 제조하였다. 제조된 각각의 배지위에 잎, 줄기, 뿌리 조직을 10개씩 총 30개를 치상하였다. 4주간 배양한 후에 유도된 부정근의 수를 조사하였다.
- 백두산에 자생하는 홍경천(Rhodiola sachalinensis)의 종자를 2002년 5월에 채집하여 실험의 재료로 사용하였다. 종자를 멸균한 다음 1/3MS배지에 20 g/L의 sucrose가 첨가된 배지위에 치상하여 발아를 유도하였다. 발아 후 잎, 줄기, 뿌리가 정상적으로 자라난 유식물체를 실험의 재료로 사용하였는데, 잎은 1 × 0.
- 최적조건의 액체배지 조성을 선발하고자 고체배지에서 유도된 부정근 1 g을 취해서 고체배지 조건에서 부정근의 유도율이 가장 좋은 MS 배지에 IBA 5 mg/L, sucrose 30 g/L가 첨가된 배지와 IBA와 sucrose의 농도는 동일하지만 염의 농도를 각각 1/2 MS 및 1/3 MS로 희석한 액체배지 100 mL에 접종하였다. 배양용기는 250 mL의 삼각플라스크(Horex, Germany)를 사용하였고, 배양은 7주간 110 rpm으로 현탁배양 하였으며, 1주 간격으로 생중량과 건중량을 측정하여 각각 비교하였다.
- 홍경천의 배양조직에 따른 IBA의 농도별 부정근 유도 조건을 알아내기 위해서 MS(Murashige and Skoog, 1962)배지에 gelrite 3.0 g/L, sucrose는 30 g/L를 첨가하고 IBA(Indole-3-butyric acid)를 0, 0.5, 1.0, 3.0 및 5.0 mg/L를 다양하게 첨가하여 배지를 제조하였다. 제조된 각각의 배지위에 잎, 줄기, 뿌리 조직을 10개씩 총 30개를 치상하였다.
- 홍경천의 배양조직에 따른 sucrose의 농도별 부정근 유도 조건을 알아내기 위해서 MS배지에 IBA는 3.0 mg/L를 첨가하고 sucrose를 0, 10, 30, 50 및 100 g/L를 다양하게 첨가하여 배지를 제조하였다. 제조된 각각의 배지위에 잎, 줄기, 뿌리 조직을 10개씩 총 30개를 치상하였다.
- 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 기내 부정근의 생산 체계를 확립하였다. 먼저 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 0.
대상 데이터
- 백두산에 자생하는 홍경천(Rhodiola sachalinensis)의 종자를 2002년 5월에 채집하여 실험의 재료로 사용하였다. 종자를 멸균한 다음 1/3MS배지에 20 g/L의 sucrose가 첨가된 배지위에 치상하여 발아를 유도하였다.
데이터처리
- 변인들의 집단간 차이를 알아보기 위해서 one-way ANOVA를 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan's multiple range test로 사후검증을 하였다.
성능/효과
- 고체배지 조건에서 부정근의 유도율이 가장 우수한 조건을 기본으로 액체배양을 실시하였으며, 염의 농도에 따른 부정근의 증식조건을 조사하였다. 1/3MS 배지에서 홍경천의 부정근을 배양하였을 때 1/2MS, MS 액체배지조건보다 약 2배, 2.5배의 부정근 생장량을 보였다.
- 각각의 배양절편체로부터 부정근은 배양 2주 후부터 유도되기 시작했다. Sucrose가 30 g/L 첨가된 배지에서 잎과 줄기의 부정근 유도수는 평균 46와 39개로 가장 높게 나타났고 뿌리절편은 sucrose가 50 g/L 첨가 되었을 때 평균 37개로 100 g/L의 첨가구보다 약 10배정도 많은 유도 개수를 나타냈다. 하지만 유도율은 잎, 줄기 그리고 뿌리절편 모두 sucrose가 30 g/L첨가된 배지에서 가장 좋았다.
- 0 mg/L 첨가된 배지에서 부정근 유도율이 가장 높았다. Sucrose의 농도는 30 g/L가 첨가되었을 때 잎, 줄기, 뿌리 절편에서 높은 유도율을 나타났다. 고체배지 조건에서 부정근의 유도율이 가장 우수한 조건을 기본으로 액체배양을 실시하였으며, 염의 농도에 따른 부정근의 증식조건을 조사하였다.
- 3개로 가장 많은 부정근 유도수를 나타냈고 줄기와 뿌리조직에서는 28과 16개로 잎 조직보다 2배가량 적은 유도 개수를 보이는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 그리고 잎, 줄기, 뿌리 절편 모두 IBA가 0.5 mg/L 첨가 될 때보다 1.0~5.0 mg/L까지 계속해서 부정근의 유도가 증가되었다(Table 1). 하지만 옥신을 첨가하지 않은 배지에서는 아무런 변화가 없었으며 쉽게 고사되는 경향을 보였다(Fig.
- 0 mg/L sucrose는 30 g/L가 첨가된 배지조건에서 유도된 부정근의 증식을 위해 현탁배양을 시도 하였으며, 최적조건의 액체배양조건을 선발하고자 생체중 1 g의 부정근을 각각 MS, 1/2 MS, 1/3 MS 액체배지 100 ml에 접종하여 7주간 110 rpm으로 액체배양한 결과, 배양 초기에는 생육의 차이가 크게 나타나지는 않았으나 배양 3주가 지나게 되면서 급속한 대수생장을 보이기 시작하였다. 배양 7주 후에 대수 증식기가 완료되어 모든 샘플을 수확한 다음 생체중을 비교한 결과 MS 배지에서 7.68 g, 1/2 MS배지에서는 12.11 g, 그리고 1/3 MS 배지에서는 생중량이 15.65 g으로 1/3 MS 배지에서 가장 양호한 결과를 보였다(Fig. 2A). 이는 초기 접종량의 15배 이상의 생장을 보인 것이며, 액체배양 조건에서는 1/3 MS배지에 5 mg/L의 IBA, 50 g/L의 sucrose를 첨가한 배지조건에서 홍경천의 부정근이 활발히 생장함을 보여주는 결과이다(Fig.
- 0 및 5,0 mg/L의 IBA와 sucrose가 10, 30, 50 및 100 g/L가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 부정근의 유도율을 조사하였다. 부정근의 유도는 잎, 줄기 절편에서 IBA의 농도가 5.0 mg/L일때 가장 높은 유도율을 보였으며, 뿌리 절편은 IBA 3.0 mg/L 첨가된 배지에서 부정근 유도율이 가장 높았다. Sucrose의 농도는 30 g/L가 첨가되었을 때 잎, 줄기, 뿌리 절편에서 높은 유도율을 나타났다.
- 0 mg/L까지 다양하게 처리하고 sucrose는 30 g/L로 동일하게 처리한 다음 배양조직을 치상하여 부정근 유도 양상을 조사한 결과는 다음과 같다. 약 2주후부터 배양조직 비대와 동시에 부정근이 유도가 되기 시작하는데 특히 잎, 줄기 절편은 조직비대가 일어난 다음 부정근 유도 현상을 보였고 뿌리절편은 캘러스 형성이 없이 바로 부정근이 유도되는 현상을 보였다(Fig. 1B,C). 배양 3주 후부터 육안으로도 식별이 가능한 길이와 굵기로 발달을 하였다.
- 이는 Toivonen and Rosenqvist(1995)가 보고한 결과 비슷한 양상을 보이는 것으로 sucrose 또한 부정근의 유도 및 증식에 중요한 인자로 작용이 된다고 판단이 된다. 이러한 결과들을 참고해보면 본 실험의 재료인 홍경천은 옥신 뿐 만 아니라 sucrose의 농도가 각기 다른 배양조직을 배양을 해서 부정근을 유도할 때 중요한 요인으로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 배양 3주 후부터 육안으로도 식별이 가능한 길이와 굵기로 발달을 하였다. 잎 조직에서 43.3개로 가장 많은 부정근 유도수를 나타냈고 줄기와 뿌리조직에서는 28과 16개로 잎 조직보다 2배가량 적은 유도 개수를 보이는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 그리고 잎, 줄기, 뿌리 절편 모두 IBA가 0.
- Sucrose가 30 g/L 첨가된 배지에서 잎과 줄기의 부정근 유도수는 평균 46와 39개로 가장 높게 나타났고 뿌리절편은 sucrose가 50 g/L 첨가 되었을 때 평균 37개로 100 g/L의 첨가구보다 약 10배정도 많은 유도 개수를 나타냈다. 하지만 유도율은 잎, 줄기 그리고 뿌리절편 모두 sucrose가 30 g/L첨가된 배지에서 가장 좋았다. 이러한 결과는 각기 조직마다 부정근의 유도시 필요로 하는 sucrose의 농도가 서로 다름을 의미한다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서는 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 부정근의 유도조건을 확립하고 현탁배양을 통한 최적의 증식방법을 확립하고자 하였다. 또한 이는 경제적 가치가 인정이 되는 식물의 빠르고 효과적인 유전자원증식 및 보존의 측면과 이를 이용한 차세대 건강기능식품의 개발 및 원료공급의 측면에서 향후 상당한 기초자료로 활용이 가능 할 것으로 보여진다.
- 그렇지만 이러한 조건 확립은 실험실 규모의 부정근 생산조건밖에 되질 않는다. 이러한 조건을 기반으로 생산규모를 확대해가는 노력이 이루어져야 할 것이며, 더 나아가 오랫동안 약용식물로 사용된 홍경천을 식품이나 대체의약품으로 개발하는데 중요한 식물재료로 사용될 것으로 생각되어진다.
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