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문제 정의
- 유산균종 중 Lactobacilli속 균주들은 동서양의 발효식품에서 발견되는 주요한 발효균주로 잘 알려져 있다. 따라서, 우리나라의 대표적인 발효식품인 김치 등 채소류의 주발효 균주로 많이 알려진 Lactobacillus plantarum(L. plantarum) 균주를 청국장의 품질개선용 균주로 활용하고자 하였다. 즉, B.
- 특히, 발효 또는 조리과정 중에 발생되는 특유한 이취는 청국장에 대한 소비감소의 주요 원인 중 하나이며, 이러한 청국장의 이취를 제거하고 품질을 개선하기 위하여, 녹차, 유카추출물, 홍삼 등을 첨가한 청국장 제조에 대한 연구(7,8)와 쑥 추출물을 사용하여 청국장의 향을 개선(9)하고자 하는 노력이 있었다. 본 연구는 이러한 청국장의 품질적 단점을 보완할 목적으로 청국장의 제조에 유산균주를 도입하고자 하였다. 유산균은 인간이 오랫동안 이용해온 유익한 미생물로 김치, 발효유제품 등의 식품에서 중요한 발효작용을 수행한다.
제안 방법
- γ-GTP 측정용 키트(AM-158, Asan Pharmaceutical Co., Ltd. Seoul, Korea)로 γ-GTP 활성도를 측정하였다(Protocol sheet 05-03-25, Asan Pharmaceutical Co., Ltd.).
- 10분 후 시료를 잘 혼합하여 60분 이내에 635 nm에서 흡광도(Spectrophotometer, V-570, Jasco, Tokyo, Japan)를 측정하였으며, 주어진 검량선과 비교하여 γ-GTP의 활성도(U/g)로 나타내었다.
- B. subtilis 균주와 L. plantarum 균주를 혼합배양한 청국장의 이화학적 특성을 조사하였다. 증자대두에 접종하여 48시간 동안 배양한 단일균주에 의한 청국장과 접종방법에 따라서 혼합배양에 의한 청국장의 품질특성을 Table 1에 나타내었다.
- B. subtilis 균주의 접종량은 3.9×105 CFU/g이었으며, L. plantarum은 5×107 CFU/g으로 조절하여 접종하였다.
- B. subtilis로 단일배양한 청국장과 L. plantarum과 혼합배양한 청국장의 향과 기호성에 대한 관능평가를 실시하였다(Table 2). 관능평가 결과 L.
- B. subtilis와 L. plantarum의 혼합배양으로 청국장을 제조할 때 L. plantarum의 생육도를 증가시킬 수 있는 방법을 모색하기 위하여 먼저 증자대두에 L. plantarum을 접종하여 배양을 시작하고, 일정시간이 지난 다음 B. subtilis를 접종하여 실험하였다(Fig. 3). L.
- L. plantarum의 접종량을 2×107 CFU/g으로 하여 증자대두에 접종하고 4, 8, 12시간 동안 배양한 후 B. subtilis를 3.9×105 CFU/g 접종하여 배양을 계속하였다.
- 관능검사는 식품공학과 학생 15명을 선발하여 관능검사 요령을 교육시킨 후 실시 하였다. 관능검사 항목은 구수한 향, 암모니아취, 요구르트 향, 전체적 기호도 등을 5점 척도법으로 실시하였다. 각 시험구별로 1점은 ‘매우 나쁘다’, 2점은 ‘나쁘다’, 3점은 ‘보통이다’, 4점은 ‘좋다’, 5점은 ‘매우 좋다’로 평가하였다.
- plantarum은 5×107 CFU/g으로 조절하여 접종하였다. 접종방법은 증자대두에 B. subtilis 균주를 단독 접종하거나(Fig. 1), B. subtilis 균주와 L. plantarum 균주를 동시접종(Fig. 2)하여 배양 실험을 수행하였다.
- Daejeon, Korea)하였다. 종균으로 배양된 L. plantarum 유산균주는 실험방법에 따라서 접종하였다.
- plantarum) 균주를 청국장의 품질개선용 균주로 활용하고자 하였다. 즉, B. subtilis 균주와 L. plantarum 균주를 청국장의 혼합배양에 이용하였으며, 배양방법을 달리한 청국장의 제조 중에 일어나는 두 균종의 분포변화와 이에 따른 청국장의 화학적, 관능적 품질에 미치는 영향을 조사하였다.
- 즉, B. subtilis의 접종량을 3.9×103 CFU/g 및 3.9×102 CFU/g 정도로 매우 낮게 조절하여 L. plantarum과 증자대두에 동시에 접종하여 혼합배양하였다(Fig. 4).
- Azocasein을 이용한 중성 protease의 분석은 Prestidge 등(17)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 시료 5g을 증류수로 혼합한 후 거즈로 여액과 대두를 분리하였고 분리된 여액을 최종적으로 25 mL가 되도록 증류수로 정용하였다. 거즈로 거른 여액은 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리(Centrifuge, Mega-17R, Hanil Science Industrial, Daejeon, Korea)하였으며 상징액을 분석시료로 사용하였다.
- 대두를 수세한 후 4℃에서 24시간 동안 수침하였다. 증류수에 불린 대두는 물을 뺀 후 250 mL의 삼각플라스크에 50 g씩 담고 autoclave(DA-AC-60, Dong-A Scientific Corp., Shiheung, Korea)를 이용하여 121℃에서 30분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench에서 50℃로 냉각시킨 후 종균으로 배양된 B.
- 05 N 황산용액 25 mL를 넣고 증류액이 70 mL 정도에 이르도록 받은 후 증류수로 100 mL로 맞추었다. 증류한 시료 100 mL를 500 mL 삼각플라스크에 옮기고 메틸레드-브롬크레졸그린 혼합지시액 3-4방울을 넣은 다음 용액의 색이 자회색(pH 4.8)이 나타날 때까지 소요된 0.05 N NaOH 용액의 양으로부터 암모니아태 질소의 농도를 계산하였다.
- 증자대두에 B. subtilis 균주와 L. plantarum 균주를 접종하여 청국장을 제조하였다. B.
- 청국장 5g을 증류수를 이용하여 혼합 진탕한 후 거즈를 이용하여 대두를 걸러낸 후 잔류여액의 최종량을 50 mL가 되도록 맞추었다. 정용한 시료액에 0.
- 청국장에 접종한 B. subtilis 균주와 L. plantarum 실험균주의 생균수 측정은 청국장 1 g을 멸균된 생리식염수(0.8% NaCl)로 희석하여 측정하였다. B.
- 청국장의 pH는 시료 1g을 증류수 10 mL에 현탁시켜 잘 혼합한 후 pH meter(915PDC, Istek, Seoul, Korea)로 측정하였다.
대상 데이터
- 관능검사는 식품공학과 학생 15명을 선발하여 관능검사 요령을 교육시킨 후 실시 하였다. 관능검사 항목은 구수한 향, 암모니아취, 요구르트 향, 전체적 기호도 등을 5점 척도법으로 실시하였다.
- subtilis)를 사용하였으며, nutrient broth (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)배지에서 30℃, 약 24시간 동안 배양하여 종균으로 사용하였다. 유산균은 L. plantarum ATCC 8014 균주(이하 L. plantarum)를 사용하였으며, 0.05%의 L-cysteine(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 MRS (Difco Laboratories)배지에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 종균으로 사용하였다.
- 청국장용 균주는 본 실험실에서 분리하여 보관중인 B. subtilis CKB 균주(이하 B. subtilis)를 사용하였으며, nutrient broth (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)배지에서 30℃, 약 24시간 동안 배양하여 종균으로 사용하였다. 유산균은 L.
데이터처리
- 시료들 사이의 통계적 유의성은 Student’s two tail t-test로 분석하였다.
이론/모형
- Azocasein을 이용한 중성 protease의 분석은 Prestidge 등(17)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 시료 5g을 증류수로 혼합한 후 거즈로 여액과 대두를 분리하였고 분리된 여액을 최종적으로 25 mL가 되도록 증류수로 정용하였다.
- 암모니아태 질소 함량은 수질오염 공정 시험방법(19)의 암모니아태 질소 중화적정법으로 측정하였다. 시료 5g을 증류수와 혼합 진탕한 후 거즈로 여액과 대두를 분리하였다.
- 청국장의 아미노태 질소는 Formol 적정법(18)으로 측정하였다. 청국장 5g을 취하여 증류수 250 mL에 현탁시킨 후 여과액 10 mL를 100 mL 삼각플라스크에 취하고, 0.
성능/효과
- 3(B))후 균수는 1.3-1.5×108 CFU/g으로 증가하였으며, B. subtilis를 접종한 이후에도 L. plantarum의 생균수는 감소하지 않고 증가하는 경향으로 48시간째 2-4×108 CFU/g까지 증가하였다.
- 4(B)) B. subtilis의 생육은 초기 생균수 3.9×102 CFU/g에서 24시간 배양 후 9×108 CFU/g으로 증가하여 접종량을 3.9×103 CFU/g으로 조절하여 수행한 앞의 실험 결과와 유사한 생육도를 보였다.
- 4(B)), B. subtilis의 생육은 24시간 배양 후 초기 접종균수인 3.9×103 CFU/g에서 9×108 CFU/g으로 증가하였으며, 96시간째는 1.2×109 CFU/g에 이르렀다.
- B. subtilis 균주 단독배양에 의한 청국장의 protease의 활성도는 177 U/g으로 In 등(8)의 연구 결과처럼 제일 높게 나타났으며, L. plantarum을 8시간 배양한 후 B. subtilis를 접종하여 혼합배양한 청국장의 protease의 활성도는 136 U/g, B. subtilis의 접종량을 3.9×102 CFU/g으로 조절하여 L. plantarum과 혼합배양한 청국장의 protease의 활성도는 110 U/g으로 유산균주와 혼합배양한 청국장이 B. subtilis 균주 단독배양 청국장에 비해 낮게 나타났다.
- B. subtilis 균주를 단독으로 접종하였을 때, B. subtilis 균주의 생육은 초기 접종량 3.9×105 CFU/g에서 12시간 배양 후 1.1×109 CFU/g으로 빠른 증식을 보였으며, pH는 초기 6.5에서 시작하여 24시간 후 급격히 증가한 후 96시간째는 pH 7.7에 이르렀다(Fig. 1).
- B. subtilis 균주와 L. plantarum을 동시에 접종하여 혼합배양한 경우(Fig. 2)에 B. subtilis의 생균수는 B. subtilis 단일배양의 생균수 변화 경향과 유사하여, B. subtilis의 생육에 큰 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. L.
- 28% 이상 함유되도록 명시되어 있다. B. subtilis 단일균주로 배양한 청국장의 아미노태 질소 함량은 0.44%이었으며, L. plantarum과 혼합배양한 청국장의 아미노태 질소함량은 각각 0.48%와 0.46%로 유산균과의 혼합배양으로 아미노태 질소함량에는 큰 영향을 미치지 않았다. 암모니아태 질소는 청국장을 기피하게 만드는 청국장의 불쾌취중의 한 성분(23)인데, 단독배양이 75.
- L. plantarum의 생육은 초기 접종량인 2×107 CFU/g에서 24시간 배양 후 1.3×108 CFU/g으로 증가하였으나, 그후 점차 감소하여 96시간째 2.2×107 CFU/g으로 감소하였다.
- L. plantarum의 생육은 초기 접종량인 5×107 CFU/g에서 혼합배양한 48시간 후 2.8-6.5×106 CFU/g, 96시간째는 9×105-2.1×106 CFU/g으로 배양시간의 경과에 따라서 생균수가 오히려 감소하였다.
- plantarum과 혼합배양한 청국장의 향과 기호성에 대한 관능평가를 실시하였다(Table 2). 관능평가 결과 L. plantarum을 혼합배양한 경우가 단일균주 배양에 의한 청국장과 비교할 때 풍미에서 높은 점수를 얻었으며, 특히 B. subtilis 균주의 접종량을 조절하여 L. plantarum과 혼합배양한 청국장의 경우는 전체적인 기호성에서 유의성 있는 높은 점수를 받았다. 이러한 결과로 보아 청국장을 제조할 때 L.
- plantarum의 생육을 억제(11,20)시키는 것으로 보인다. 그러나, pH의 변화는 B. subtilis를 단독으로 접종한 경우와 달리 B. subtilis와 L. plantarum 균주를 혼합배양했을 때는 초기 pH가 6.2에서 배양 96시간 동안 pH 7.2까지 매우 완만한 증가를 보여 유산균의 생육 진행을 간접적으로 분석할 수 있었다.
- 단일균주에 의한 청국장의 γ-GTP 활성도는 1.11 U/g으로 유산균주 혼합배양 청국장보다 높은 활성도를 나타내었다.
- 3(C))는 청국장의 상태에 이르지 못하게 된다. 따라서 혼합배양으로 청국장의 품질개선하기 위하여 먼저 L. plantarum을 일정시간 동안 배양한 후에 B. subtilis를 접종하는 방법으로 특정의 배양 목표를 달성할 수 있을 것으로 생각되었다.
후속연구
- plantarum과 혼합배양한 청국장의 경우는 전체적인 기호성에서 유의성 있는 높은 점수를 받았다. 이러한 결과로 보아 청국장을 제조할 때 L. plantarum의 혼합배양으로 그의 생육을 적절히 조절하고 통제한다면, 청국장의 이취 및 품질개선에 기여할 것으로 생각된다.
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