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문제 정의
- simplex, Contracaecum type A, type C' 과 outgroup으로 Goezia spp. 의 I8S rDNA의 PCR product에 대한 RFLP를 시행하여 감별진단법으로서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.
제안 방법
- Germany)를 이용하여 분리하였다. 18S rDNA를 증폭하기 위하여 두 개의 시 발체(conserved primers, forward): 5'-GCGAACGGCTCATTACAACA-3' 및 (reverse) :5'-GGTTC AAGCCACTGCGATTA-3'를 사용하였으며 (PreMix ver.2.0, TaKaRa, Japan), PCR 조건은 94℃ 5분(1 cycle), 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1 분 (30 cycle), 72℃ 10분 (1 cycle) 으로 시행하였다.(Mastercycler Personal, Eppendorf, Germany).
- 본 실험에서는 생선회로 즐겨먹는 숭어, 아나고, 도다리, 고등어, 참돔 등 5종의 해산어류에서 분리한 고래회충과 유충을 감별 진단하기 위하여 18S rDNA를 PCR로 증폭한 다음 RFLP 를 시행하였다. 18S rDNA는 rDNA cistron 가운데 염기 서열상의 극심한 변이를 보이는 ITS-1 이나 ITS-2에 비해 비교적 가까운 종 사이의 분류학적 위치를 밝히는 유용한 도구로 인정받고 있다[6, 10, 12].
- 증폭된 DNA (1 μg)을 각각의 제한효소로 처리하였다. 제한효소 사용은 제조사(Promega, Madison, WI, USA)의 지시 에 따랐으며, 37℃ 4시간 동안 처리 한 후 1% TBE gel에 전개하여 ethidium bromide로 염색하였다.
- simplex는 5종의 어류 모두에서 발견되었으며, Contracecum type A는 두 종(고등어, 도다리)에서, Contracaecum type C'은 참돔 한 종에서만 볼 수 있었다. 종 동정을 위해서는 10% 포르말린으로 고정한 다음 증류수로 여러 번 세척하고 알코올-글리세린 용액에서 투명화 한 후 글리세린-젤리로 봉입하여 표본을 제작하여 현미경 하에서 동정하였다 [2].
- 증폭된 18S rDNA 단편들은 제 한효소 Taq I, Hinfl, Hha I, Alu I, Dde I, HflelH, Sau96 I 및 Sau3A I 로처리하였다. 증폭된 DNA (1 μg)을 각각의 제한효소로 처리하였다.
대상 데이터
- 숭어, 도다리, 고등어, 아나고, 참돔 등 5종의 어류의 복강, 위벽/ 장벽, 간 등에서 A. simplex 제 3기 유충, Contracaecum 및 Goezia 유충을 분리하여 0.9% 생리식염수에 세척한 후 실험에 사용하였다. A.
- 유충의 Genomic DNA는 QIAamp® DNA Mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리하였다. 18S rDNA를 증폭하기 위하여 두 개의 시 발체(conserved primers, forward): 5'-GCGAACGGCTCATTACAACA-3' 및 (reverse) :5'-GGTTC AAGCCACTGCGATTA-3'를 사용하였으며 (PreMix ver.
이론/모형
- 수집 된 유충 가운데 가장 높은 빈도로 발견되는 3종 즉, A. simplex L3, Contracaecum type A 및 C 그리고 outgroup으로 Goezia 유충을 Chai 등(1986)의 분류에 준하여 확인하였다[2]. A.
성능/효과
- 18S rDNA PCR 산물은 A. simplex, Contracaecum type A, type C 및 Goez讪에서 모두 2 kb 이하로 나타났다(Fig. 2). Taq 1 제한효소로 처리한 18S rDNA PCR product는 세 개의 뚜렷한 분획으로 전개되었는데 A.
- simplex L3, Contracaecum type A 및 C 그리고 outgroup으로 Goezia 유충을 Chai 등(1986)의 분류에 준하여 확인하였다[2]. A. simplex 유충은 길이 15-25 mm, 두께 0.4 - 0.5 mm 정도의크기로 형태는 뚜렷한 boring tooth와 단순한 모양의 게실 (ventriculus) 및 꼬리 부분의 전형적인 mucron으로 확인 할수 있었다(Fig. 1A, B, C). Contracaecum type A는 길이 6-10 mm, 두께 0.
- A. simplexe ITS-1 이나 ITS-2 PCR-RFLP에서 Haelll 에 의해 두 가지 패턴으로 나뉘어져 ITS의 다형성 (polymorphism) 으로 보고되 기도 하였으나 본 실험에 사용한 5종의 해산어류에서 수집한 A. simplex 모두에서 제한효소 종류에 상관없이같은 pattern을 보여 18S rDNA 염기서열이 ITS에 비해 변이정도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다[25]. 분류학적 out- group인 Goezia 의 경우에는 사용한 8종의 제한효소 모두에서 A.
- 9% 생리식염수에 세척한 후 실험에 사용하였다. A. simplex는 5종의 어류 모두에서 발견되었으며, Contracecum type A는 두 종(고등어, 도다리)에서, Contracaecum type C'은 참돔 한 종에서만 볼 수 있었다. 종 동정을 위해서는 10% 포르말린으로 고정한 다음 증류수로 여러 번 세척하고 알코올-글리세린 용액에서 투명화 한 후 글리세린-젤리로 봉입하여 표본을 제작하여 현미경 하에서 동정하였다 [2].
- ID, E, F). Contracaecum type C'은 길이 5-13 mm, 두께 0.1 - 0.2 mm 크기로 형태학적 특징으로는 boring tooth 및 interlabia를 볼 수 있었으며 심하게 꼬여 있는 생식원기 및 mucrono] 없는 꼬리 부분을 확인할 수 있었다(Fig. 1G, H, I). Goez讪는 Goeziidae과(family Goeziidae)에 속하는 종으로 길이 20-30 mm, 두께 0.
- 3 Hae I). Dde 1 제한효소의 경우에는 Contracaecimi Type C'은 A. simplex 와 완전히 다른 분획들을 보였으나 Contracaecum Type A의 경우에는 두 가지 패턴을 보였는데한 경우에서는 A. #와 구분되지 않았고 나머지에서는 Contracaecum type C'과 동일한 양상을 보였다(Fig. 3 Dde I). 제한효소 Hae # 도 400 bp 가량의 분획으로 A.
- 3 Hae Ⅲ). Sau% 1과 Sau3A I는 A. sim- plex와 ContracnecwH 과의 구분에는 적합하지 않은 것으로 나타났다(Fig. 3 Sau96 I 및 Sau3A I).
- auctunie 구분할 수 있었으나 두 종의 Contracaecimi 구분되지 않았다고 보고하였다[24]. 그러나 본 실험에서는 #/T이 A. #와 Contracaecum type C'의 구분에는 적당하나 Contracaecum type A와의 분류에는 적당하지 않은 것으로 나타났다. Contracaecum 속(genus)의 분류 체계의 일환인 type A 및 type C 등의 명칭은 연장숙주인 해산어류에서 발견되는유충의 형태에 근거한 것으로 여러 자매종이 섞여 있을 가능성 이 매우 크다.
- 특히 기생충의 숫자가 매우 적거나 충체의 일부만으로 진단하여야 할 경우 매우 유용한 수단이 될 수 있을 것으로 보여진다(4)18]. 본 실험에서도 18S rDNA는 제한효소 Hinf 1, Alu 1, Hha I, Dde 1 및 Hae #로 A. simplex와 Contracaecum type C을 쉽 게 구별할 수 있었다. 그러나 Contracaecum type A는 사용한 8종의 제 한효소 가운데 Taq I, Hinf I, Alu I 및 Dde I을 사용한 경우 두 가지 패턴을 보였는데 이들 가운데는 A.
- simplex 모두에서 제한효소 종류에 상관없이같은 pattern을 보여 18S rDNA 염기서열이 ITS에 비해 변이정도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다[25]. 분류학적 out- group인 Goezia 의 경우에는 사용한 8종의 제한효소 모두에서 A. simplex 및 Contracaecum type A와 C'과 완전히 다른패턴을 보여 Anisakis나 과의 분류학상의 거리를 알 수 있었다.
- simplex 종복합체의 자매종확인에도 유용한 것으로 밝혀졌다[3, 14]. 뿐만 아니라 PCR- RFLP 분석은 채집 장소에 무관하게 A. simplex 종 내에서 동일한 패턴을 보여 종구분에 유용한 것으로 드러났다μ이. 그러나고래회충유충증은 A.
- 그러나 본 연구의실험대상인 # type A 및 C'은 해산어류내에 기생하는 유충 상태로 정확한 종 동정은 성충에 대한 자료등이추가되기 전에는 매우 어려울 것으로 보인다. 이번 실험에서 Contracaecum type A로 분류된 유충들은 몇몇 형태적 특징은동일하나 연장숙주의 종류를 달리하는 종복합체이거나 자매종들이 혼합되어 있는 것으로 추정된다.
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