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문제 정의
- 혹병이 매우 심하게 발생하였다. 본 연구에서는 혹 병균이 발생한 포도나무의 뿌리에서 선택배지를 이용하여 Agrobacterium 속 균을 분리하고 동정하여 포도나무 뿌리의 균 특성과 병 발생과의 관계를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 5 이상이며 Agrobacterium 속으로 동정된 35개 균주를 1차 선발하였다. 1차 선발된 분리균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 염기서열의 유사성으로 동정하고 한 시료에서 중복된 세균을 제거한 후 종 13개 균주를 Agrobacterium 속 균으로 확인하였다(Table 1).
- 생화학적인 반응을 조사하였다(Schaad 등, 2001). 3-ketolactose 생산, CaCQ가 첨가된 PDA에서 생장, pH 7.0에서의 운동성, malonic acid에서의 알칼리 생성, ferric ammonium citrate에서의 색소 발현, melezitose에서 산의 형성, citrate utilization 반응을 조사하였다.
- TT3, )가 사용되었다. PCR 반응액은 lM10ng/μl) 의 template DNA, 0.5U Taq polymerase (TaKaRa, Japan), dNTP 200 uM, 20 mM Tris- HC1 (pH8.0), 100 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween®20, 0.5% Nonidet P-40®, 50% glycerol, 각각의 primer를 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피 를 25μl로 조절 하였다. PCR 반응은 T Gradient Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하였으며, PCR 조건은 처음 94℃에서 1분간 pre-denaturation시킨 후 94℃ 에서 1분간 denaturation, 67℃에서 1분간 annealing, 72℃ 에서 1분 30초 extension하여 총 35 cycle 실시하였으며 최종 DNA 합성은 72℃에서 10분으로 하였다.
- 5% Nonidet P-40®, 50% glycerol, 각각의 primer를 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피 를 25μl로 조절 하였다. PCR 반응은 T Gradient Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하였으며, PCR 조건은 처음 94℃에서 1분간 pre-denaturation시킨 후 94℃ 에서 1분간 denaturation, 67℃에서 1분간 annealing, 72℃ 에서 1분 30초 extension하여 총 35 cycle 실시하였으며 최종 DNA 합성은 72℃에서 10분으로 하였다. 증폭 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하였다.
- 사용한 primer는 ERIC 1R (5'ATGTA- AGCTCCTGGGGATTCAC3'), ERIC 2 (5'AAGTAAGT- GACTGGGGTGAGCG3'), BOX AIR (5'CTACGGCAA- GGCGACGATGACG3')이었다. PCRe T Gradient Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하여 종 특이 PCR과동일한 반응액으로 수행하였다. PCR반응은 95℃에서 7분간 초기 denaturation 과정을 거친 후에 30 cyclesS.
- 95℃ 에서 1분, REP(52℃:에서 1분), BOXQeC에서 1분) 65℃ 에서분간의 반응을 거쳐 최종 extension 과정을 65℃에서 16분간 반응시켰다. PCR로 증폭된 증폭산물을 1.5% 의 agarose gel에 전기영동을 이용하여 증폭된 밴드를 관찰하였다.
- 종 특이적 primer를 이용한 PCR. Pulawska 등(2006) 이 사용한 Agrobacterium 종에 특이적인 primer를 이용하여 분리균을 동정하기 위하여 P* CR 수행하였다. PCR에사용한 분리균의 DNA는 GeneAll® Exgene™ Cell SV Cell DNA isolation mini kit(GENEALL BIOTECHNOLOGYCo.
- 뿌리 1 g을 흐르는 물에 깨끗이 씻어 멸균된 페이퍼타을 위에 놓고 물기를 제거한 후 70% 에탄올로 1분간 표면소독을 실시하였다. 멸균된 막자사발에 표면 소독된 뿌리 1 g과 5 ml의 멸균수를 넣고 마쇄한 후 상징액을 0.1m/채취하여 10배, 100배, 1000배로 희석하고, Schaad 등(2001)이 제시한 Agrobacterium vitis, A. tumefaciens, A. rhizogenes의 선택배지인 Roy and Sasser's medium, 1A, 2E에 도말하고 281에서 5일간 배양하였다. 각각의 배지에서 Agrobacteriimi속 균 특징적 콜로니를 선택하여 PDA와 선택배지에서 교호로 2회 스트리크하여단콜로니를 얻어 순수 배양하였다.
- 병원성 검정. 분리균을 PDA에 스트리크하여 2일간 배양 후 토마토 유묘와 포도 줄기에 침접종하고, 토마토는 3주 후에 포도나무에서는 5주 후 접종부위에 혹의 형성 유무를 조사하였다. 포도의 뿌리에서 병원성 검정은 PDA 배양배지에서 2일간 배양한 세균을 현탁하여 세균의 농도를 OD600에서 0.
- 분리균의 동정. 분리균의 지방산 분석은 Trypticase soy broth agar (TSBA)배지에 28<>C에서 2일간 배양 후에 MIDI Sherlock system(MIDI, USA)을 이용하여 지방산 분석을 통해 분리균을 동정하였다. 지방산 분석 결과 Agrobacterium 으로 동정된 균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고 이 염기서열을 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 분리 균을 동정하였다.
- 충북지방 포도 혹병 발생 포도원에서채집한 50여 점의 뿌리로부터 3종류의 Agrobacterium 선택배지를 이용하여 Agrobacterium의 특이적 콜로니를 보인 총 130개의 세균을 분리하였다. 분리된 130개의 균주의 지방산을 추출하여 MIDI system을 이용하여 동정하였다. MIDI 결과 유사도(similarity)가 0.
- 분리균의 지방산 분석은 Trypticase soy broth agar (TSBA)배지에 28<>C에서 2일간 배양 후에 MIDI Sherlock system(MIDI, USA)을 이용하여 지방산 분석을 통해 분리균을 동정하였다. 지방산 분석 결과 Agrobacterium 으로 동정된 균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고 이 염기서열을 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 분리 균을 동정하였다.
- 최근 혹병이 심하게 발생한 충북지방의 포도나무의 뿌리로부터 선택배지를 이용하여 Agrobacterinm속 세균을 분리하고 동정하였다. 분리균의 지방산 분석을 통한 MIDI 에 의한 동정, 16S rDNA 염기서열, 생화학적 특성, 종특이적 primer을 이용한 PCR 결과로 13개 분리균은 모두 A.
- 분리균의 동정. 충북지방 포도 혹병 발생 포도원에서채집한 50여 점의 뿌리로부터 3종류의 Agrobacterium 선택배지를 이용하여 Agrobacterium의 특이적 콜로니를 보인 총 130개의 세균을 분리하였다. 분리된 130개의 균주의 지방산을 추출하여 MIDI system을 이용하여 동정하였다.
- 분리균을 PDA에 스트리크하여 2일간 배양 후 토마토 유묘와 포도 줄기에 침접종하고, 토마토는 3주 후에 포도나무에서는 5주 후 접종부위에 혹의 형성 유무를 조사하였다. 포도의 뿌리에서 병원성 검정은 PDA 배양배지에서 2일간 배양한 세균을 현탁하여 세균의 농도를 OD600에서 0.1의 농도로 맞추었다. 포트에 심겨져 있는 포도를 뽑아 뿌리의 흙을 흐르는 물에 씻고, 뿌리 끝을 잘라 상처를 주어 1시간 동안 현탁액에 침지한 후에 다시 포트에 심어 접종하고, 접종 5주 후에 뿌리를 관찰하여 혹 형성 유무를 확인하였다.
- 1의 농도로 맞추었다. 포트에 심겨져 있는 포도를 뽑아 뿌리의 흙을 흐르는 물에 씻고, 뿌리 끝을 잘라 상처를 주어 1시간 동안 현탁액에 침지한 후에 다시 포트에 심어 접종하고, 접종 5주 후에 뿌리를 관찰하여 혹 형성 유무를 확인하였다.
대상 데이터
- 시료채집 및 세균의 분리. 2008-2009년 동안 충청북도 영동과 옥천 지역에서 포도나무 뿌리혹병이 발생한 MBA 와 거봉 포장에서 포도 뿌리를 무작위로 채집하여 총 50 점을 채집하였다. 뿌리 1 g을 흐르는 물에 깨끗이 씻어 멸균된 페이퍼타을 위에 놓고 물기를 제거한 후 70% 에탄올로 1분간 표면소독을 실시하였다.
- 4종류의 primer, UF f(5'GTAAGAAGCGAACGCAGG- GAACT3'), B1R r(5'GACAA TGACTGITCIACGCGIAA3'), B2R r(5'TCCGATACCTCCAGGGCCCCTCACA3), AvR r (5'AACTAACTCAATCGCGClAnAAC3, ), ArR r(5'AAAA- CAGCCACTACGACTGTC TT3, )가 사용되었다. PCR 반응액은 lM10ng/μl) 의 template DNA, 0.
- 분리된 130개의 균주의 지방산을 추출하여 MIDI system을 이용하여 동정하였다. MIDI 결과 유사도(similarity)가 0.5 이상이며 Agrobacterium 속으로 동정된 35개 균주를 1차 선발하였다. 1차 선발된 분리균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 염기서열의 유사성으로 동정하고 한 시료에서 중복된 세균을 제거한 후 종 13개 균주를 Agrobacterium 속 균으로 확인하였다(Table 1).
- Pulawska 등(2006) 이 사용한 Agrobacterium 종에 특이적인 primer를 이용하여 분리균을 동정하기 위하여 P* CR 수행하였다. PCR에사용한 분리균의 DNA는 GeneAll® Exgene™ Cell SV Cell DNA isolation mini kit(GENEALL BIOTECHNOLOGYCo., Ltd., Korea)를 이용하여 분리하였고, 분리된 DNA는 -2(rc에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 뿌리로부터 분리한 분리균의 유전적 특성을 비교하기 위해 Rademaker 등(1998)이 제안한 rep-PCR 을 실시하였다. 사용한 primer는 ERIC 1R (5'ATGTA- AGCTCCTGGGGATTCAC3'), ERIC 2 (5'AAGTAAGT- GACTGGGGTGAGCG3'), BOX AIR (5'CTACGGCAA- GGCGACGATGACG3')이었다. PCRe T Gradient Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하여 종 특이 PCR과동일한 반응액으로 수행하였다.
이론/모형
- Rep-PCR. 뿌리로부터 분리한 분리균의 유전적 특성을 비교하기 위해 Rademaker 등(1998)이 제안한 rep-PCR 을 실시하였다. 사용한 primer는 ERIC 1R (5'ATGTA- AGCTCCTGGGGATTCAC3'), ERIC 2 (5'AAGTAAGT- GACTGGGGTGAGCG3'), BOX AIR (5'CTACGGCAA- GGCGACGATGACG3')이었다.
성능/효과
- 1). 13개의 분리 균을 이용한 PCR에서는 모두 A. tumefacisis와 동일한 크기의 DNA가 증폭되었다(Fig. 1).
- 2). ERIC-PCR 결과(Fig. 2A) A. tumefaciens와 A. vitis의 표준균주로 사용한 4개의 균주들 사이에 가장 DNA 밴드패턴의 차이는 약 1.7kb 크기의 DNA 존재 여부로 나타났다. 즉 A.
- 모든 분리균은 토마토와 포도나무의 줄기와 뿌리에 병원성을 나타내지 않았다. Rep-PCR 결과 분리균은 A. 와 일부 유사성 이 있지만 전체적으로 병원균인 A. tumefaciens와 A. vitis와는 유사성이 낮았다. 이상의 결과는 충북 일부 지방의 MeA와 거봉에서 발생한 혹병을 일으키는 병원균은 토양이나 뿌리로부터 전반되지 않고 묘목을 통해서 전반되었을 가능성을 시사하고 있다.
- 2B). Rep-RCR의 결과는 ERIC-PCR의 결과에서 분리균과 표준균주와 일부 DNA 밴드의 유사성을 보여주고 있지만 전체적으로 포도나무 뿌리 분리균은 병원균인 A. mmejdciews나 A. vitis와는 유전적 유사성이 낮은 것으로 나타났다.
- tumefaciens는 분리되지 않았다. 모든 분리균은 토마토와 포도나무의 줄기와 뿌리에 병원성을 나타내지 않았다. Rep-PCR 결과 분리균은 A.
- 본 연구에서 혹병이 발생한 포도나무 뿌리에서 분리한Agrobacterium세균은 모두 비병원성 A. tumeJHcietis 로동정되었다. 일부 생화학적 특성이 전형적인 A.
- 분리균의 생화학적인 특성을 조사한 결과 포도나무 뿌리에서 분리된 13균주 모두 CaCQ가 첨가된 PDA 배지에서 산을 생성하지 않았으며, pH 7.0에서 운동성을 보였다. 또한 대부분의 균주가 3-ketolactose을 생산하였고, ferric ammonium citrate와 melezitose 이 용성 에서 양성 반응으로 나타났으며, malonic acid 이용성에서는 음성반응을 나타내었다(Table 2).
- 동정하였다. 분리균의 지방산 분석을 통한 MIDI 에 의한 동정, 16S rDNA 염기서열, 생화학적 특성, 종특이적 primer을 이용한 PCR 결과로 13개 분리균은 모두 A. tumejdciews로 동정되었으며, 포도나무 혹병균인 A.tumefaciens는 분리되지 않았다. 모든 분리균은 토마토와 포도나무의 줄기와 뿌리에 병원성을 나타내지 않았다.
- 뿌리로부터 분리된 분리균 13개의 유전적 유사성을 알아보기 위하여 ERIC primer와 BOX primer를 사용하여 rep-PCR실시한 결과 표준균주와 분리균 모두에서 0.5 Kb 에서 10 Kb의 범위에서 각각 다양한 크기의 DNA가 증폭되었다(Fig. 2). ERIC-PCR 결과(Fig.
- vitis로 동정되는 분리균은 없었다. 이 결과는 포도나무 혹병이 발생한 포도나무 뿌리에는 포도나무 혹병균인 A. 가 존재하지 않음을 암시하고 있다. 많은 연구를 통해 병원균 A.
- vitis와는 유사성이 낮았다. 이상의 결과는 충북 일부 지방의 MeA와 거봉에서 발생한 혹병을 일으키는 병원균은 토양이나 뿌리로부터 전반되지 않고 묘목을 통해서 전반되었을 가능성을 시사하고 있다.
- 또한 대부분의 균주가 3-ketolactose을 생산하였고, ferric ammonium citrate와 melezitose 이 용성 에서 양성 반응으로 나타났으며, malonic acid 이용성에서는 음성반응을 나타내었다(Table 2). 일부 분리균의 특성이 다른 반응을 보이는 예외는 있었지만 13개 모든 분리균은 A. tumefaciens 의 특성과 가장 유사하였다(Table 2).
- tumeJHcietis 로동정되었다. 일부 생화학적 특성이 전형적인 A. tumefaciens와 다른 균주가 있었지만 세균의 동정과 분류의 기준이되는 생화학적 특성의 양성 (positive) 또는 음성 (negative)의 의미가 일반적으로 전체 분리균의 80%가 보여주는 특성임을 감안하고(Schaad 등, 2001), Agrobacterium 종 특이적 PCR의 결과, 그리고 MIDI와 16S rDNA 결과를 모두 종합했을 때 분리균은 모두 A. tumefaciens로 동정 되었다. 포도나무 뿌리로부터 A.
- 분리균의 병원성 및 유전적 특성. 포도나무 뿌리에서 분리한 균의 병원성을 토마토 줄기, 포도 줄기 그리고 포도나무 뿌리에 접종하여 병원성을 확인한 결과 일부 분리 균이 토마토 줄기에서 분리균을 접종하지 않고 상처만 준 처리보다 접종부위가 약간 더 부푸는 아주 미약한 병원성을 보인 균주가 있었으나 이 균주을 제외하면 모든 균주는 전혀 혹형성을 유도하지 않았다. 토마토 유묘의 줄기에서 무접종 처리보다 약간 더 부푸는 반응을 유도한 경우도 병원균을 접종한 경우에서 보여주는 혹 조직이 전혀 생기지 않아서 모두 병원성이 없는 것으로 표시하였다(Data are not shown).
후속연구
- vitis는 토양에서 감염된 포도나무의 잔재 (grape tissue debris)에서 2년 동안 생존이 가능하며, 혹병이 발생한 포장에서 포도나무가 제거된 후에도 이들 잔재를 통한 전반 가능성을 있음을 보고하였다. 국내에서 포도나무 혹병은 대단위 거봉 재배지역인 천안과 안성에서 최초로 보고되었고 (정과 심, 1996), 현재도 가장 많이 발생하는 지역이므로 포도나무 혹병의 전반과정에 대해서는 앞으로 이 지역의 포장을 중심으로 보다 광범위한 토양 및 포도나무 뿌리에서의 병원균의 생태 파악이 필요하다고 생각된다.
- tumefaciens에 의한 뿌리혹병은 외국으로부터 도입된 도입 병으로 알려져 있다(이, 1996). 앞으로 비병원성 Agrobacterium 속 세균의 국내 토양 및 식물의 군권에서 분포와 병원성 Agrobacterium과의 관계에 대한 더 많은 연구가 필요하다고 판단된다.
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