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문제 정의
- acutatum으로 동정하였다. C. 에 의한 고주 탄저병은 노지에서만 발생하여 수확기 열매에 피해를 주기 때문에 방제도 노지고추를 중심으로 이루어지고 있는 특성으로 볼 때 고추 유묘에 탄저병을 일으킨 균은 유묘 뿐아니라 성묘 및 열매에도 강한 병원성을 가지고 있어 고추 육묘과정에서부터 탄저병이 감염되어 피해가 확산될것이 우려되므로 초기감염에 주의하여 탄저병 방제지도가 필요할 것으로 판단되어 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- 3일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 1.5 m/ microtube에서 동결건조한 균사체를 마쇄한 뒤 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer) 를 이용하여genomic DNA를 주줄하였다. Collectotrichum acutatum 특이적 primer 인 Calnt(GGGGAAGCCTCTCGCGG), C.
- 5 m/ microtube에서 동결건조한 균사체를 마쇄한 뒤 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer) 를 이용하여genomic DNA를 주줄하였다. Collectotrichum acutatum 특이적 primer 인 Calnt(GGGGAAGCCTCTCGCGG), C. gloeosporioides 특이적 primer인 CgInt(GGCCTCCCG- CCTCCGGGCGG)와 C. coccodes 특이적 primer인 Cclnt (TCTCCCCGTCCGCGGGTGGX 이용하였으며 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 쌍으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응액은 2 ul의 DNA, 2.
- coccodes 특이적 primer인 Cclnt (TCTCCCCGTCCGCGGGTGGX 이용하였으며 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 쌍으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응액은 2 ul의 DNA, 2.5 U Taq polymerase (Takara, Japan), 100 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 각각의 dNTP 0.2 mM, primer 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 B로 조절하였다. PCRe Takara PCR thermal cycler MP(Takara, Japan)를이용하였으며, 94℃에서 4분간 pre-denaturation을 실시하였고, denaturation, annealing, elongation 단계를 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분간을 30회 반복하였다.
- 2 mM, primer 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 B로 조절하였다. PCRe Takara PCR thermal cycler MP(Takara, Japan)를이용하였으며, 94℃에서 4분간 pre-denaturation을 실시하였고, denaturation, annealing, elongation 단계를 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분간을 30회 반복하였다. 마지막 elongation 단계는 7TC에서 7분간 실시하였다.
- 마지막 elongation 단계는 7TC에서 7분간 실시하였다. 각각의 프라이머에 대해 반응시킨 후 증폭된 PCR 산물은 1.2% agarose에 전기영동하고 염색 후 생성된 band 크기를 비교하였다. 또한 유묘에서 분리된 병원균 1개와 고추잎에서 분리된 C.
- 고추 유묘에서 분리한 병원균의 병원성을검정하기 위해, 독야청청' 품종을 플라스틱 플러그판에파종한 다음 30일묘, 60일묘, 90일묘로 생육단계를 나누어 묘령에 따라 각각의 식물체를 직경 8, 12, 20cm 크기의 플라스틱 포트에 정식한 후 사용하였다. 순수분리한병원균은 PDA배지에 6일간 배양후 균총표면에 형성된포자를 살균수를 붓고 4겹의 거어즈에 걸러내고 IxlO6 conidia/m/ 농도로 포자현탁액을 만들어 분무접종하였다.
- 그러나노지고추 재배를 위해 농가포장에서 직접 육묘중인 고추유묘에 탄저병이 발생하여 피해를 준 것은 매우 이례적인 일이다’ 처음에는 유묘의 신초가 수침상으로 썩는 증상으로 미루어 과도한 고온다습 환경에 의한 생리장해로인식하였다 . 그러나 병반으로부터 탄저병균이 분리되었기에 유묘탄저병으로 보고되어 있는 C. coccodes으로 추정하였다. 분리된 병원균은 배양상에서도 검은색 균핵을 다수 형성하는 것으로 알려진 (Simmonds, 1965) C.
- 접종한 후 식물체는 24시간동안 dew-chamber(다솔기기, DS-53C)에 두어 포화습도를 유지한 후 25~3(TC의 온실에 두고 병징을 관찰하였다. 또한 고추열매에 대한 병원성 검정을 위하여 풋고추와 붉은고추를 30% 알콜로 표면소독하고 플라스틱 용기(20x15x8 cm)에 담았다. 열매표면의 물기가 마른 후 곤충표본제작용 핀(6호)으로 과실당 2군데씩 상처를 준 뒤 포자현탁액을 10 ul씩 점적 접종하였다.
- 배양적 특징을 가지고 동정하기 위해 PDA 위에 옮겨 25, >C 항온기에서 4일간 배양 후 균총의 색깔과 형태, 균핵의 형성유무 등을 조사하였다. 또한 광학현미경 (Zeiss, Germany) 하에서 포자의 형태적 관찰은 분생포자의 크기, 모양 등을 관찰하였다.
- gloeosporioides 2개, 난에서 분리된 G cingulata 2개의 균주에 대한 유전적 다양성 분석을 위해 primer rTSl(TCCGIAGGTGA- ACCTGCGG)와 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하여 ITS 영역을 증폭하였고 MegAlign 프로그램의 Clustal W 방법을 이용하여 유연 관계도를 작성하였다. 또한 유묘 분리균의 염기서열을 NCBI database의 blast search를 통해 기존에 알려진 탄저병균들의 염기서열을 비교하였다.
- 2% agarose에 전기영동하고 염색 후 생성된 band 크기를 비교하였다. 또한 유묘에서 분리된 병원균 1개와 고추잎에서 분리된 C. acutatum 1개, 열매에서 분리된 C. acutatum 13개 및 난과 살구에서 분리된 C. gloeosporioides 2개, 난에서 분리된 G cingulata 2개의 균주에 대한 유전적 다양성 분석을 위해 primer rTSl(TCCGIAGGTGA- ACCTGCGG)와 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하여 ITS 영역을 증폭하였고 MegAlign 프로그램의 Clustal W 방법을 이용하여 유연 관계도를 작성하였다. 또한 유묘 분리균의 염기서열을 NCBI database의 blast search를 통해 기존에 알려진 탄저병균들의 염기서열을 비교하였다.
- 이처럼 종특이적 프라이머를 이용한 PCR법은 Kim 등(2009)에 의해서도 감과 고추에서 분리한 탄저병균을 동정하기에 효과적으로 사용된 바 있다. 또한 유묘에서 분리한 균주과 이미 알려진 18개의 탄저병균의 ITS 영역의 염기서열을 분석하여 병원균간의 다양성을 분석한 결과 크게 3개 그룹으로 나누어졌다(Fig. 3). 분리균주는 대부분의 고추 열매 등에서분리된 C.
- 분리된 병원균을 형태적 .배양적 특징을 가지고 동정하기 위해 PDA 위에 옮겨 25, >C 항온기에서 4일간 배양 후 균총의 색깔과 형태, 균핵의 형성유무 등을 조사하였다. 또한 광학현미경 (Zeiss, Germany) 하에서 포자의 형태적 관찰은 분생포자의 크기, 모양 등을 관찰하였다.
- 병원균의 유전학적 동정을 위해탄저병균을 감자액체배지(PD broth, Difco)에 접종하고 25℃에서 3일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 1.
- 신초가 말라죽는 피해증상이 발생하였다. 본 연구에서는 병든 고추 유묘의 병반으로부터 분리하여, 균학적, 분자생물학적 특징 및 병원성 검정 결과를 바탕으로 C. acutatum으로 동정하였다. C.
- 순수분리한병원균은 PDA배지에 6일간 배양후 균총표면에 형성된포자를 살균수를 붓고 4겹의 거어즈에 걸러내고 IxlO6 conidia/m/ 농도로 포자현탁액을 만들어 분무접종하였다. 접종한 후 식물체는 24시간동안 dew-chamber(다솔기기, DS-53C)에 두어 포화습도를 유지한 후 25~3(TC의 온실에 두고 병징을 관찰하였다.
- 또한 고추열매에 대한 병원성 검정을 위하여 풋고추와 붉은고추를 30% 알콜로 표면소독하고 플라스틱 용기(20x15x8 cm)에 담았다. 열매표면의 물기가 마른 후 곤충표본제작용 핀(6호)으로 과실당 2군데씩 상처를 준 뒤 포자현탁액을 10 ul씩 점적 접종하였다. 접종 후 281 항온기에 두고 병징발생 여부를조사하였다.
- 열매표면의 물기가 마른 후 곤충표본제작용 핀(6호)으로 과실당 2군데씩 상처를 준 뒤 포자현탁액을 10 ul씩 점적 접종하였다. 접종 후 281 항온기에 두고 병징발생 여부를조사하였다.
- 순수분리한병원균은 PDA배지에 6일간 배양후 균총표면에 형성된포자를 살균수를 붓고 4겹의 거어즈에 걸러내고 IxlO6 conidia/m/ 농도로 포자현탁액을 만들어 분무접종하였다. 접종한 후 식물체는 24시간동안 dew-chamber(다솔기기, DS-53C)에 두어 포화습도를 유지한 후 25~3(TC의 온실에 두고 병징을 관찰하였다. 또한 고추열매에 대한 병원성 검정을 위하여 풋고추와 붉은고추를 30% 알콜로 표면소독하고 플라스틱 용기(20x15x8 cm)에 담았다.
대상 데이터
- 2008년 4월 중순 경기도 화성시의 노지고추 재배농가에서 육묘중인 고추 품종, 독야청청, 유묘의 잎에 수침상의 점무늬증상이 형성되고 신초가 말라죽는 피해증상이 발생하였다(Fig. 1A). 잎 가장자리로부터 흑갈색의 잎이 썩으면서 마르는 증상을 보였고 오래된 병반 중앙부는 갈색으로 변하여 말랐다(Fig.
이론/모형
- ITS-based phylogenetic tree of the isolate from pepper seedlings and other Colletotrichum isolates. The dendrogram was constructed using cluster analysis with the UPGMA.
성능/효과
- 이들 결과를 바탕으로 유묘에서 분리한 균은 Collectotrichwn acutatimi으로 동정하였다. 고주 유묘에서 분리한 균주를 고추 묘 생육단계별로 병원성 검정한 결과 유묘 뿐 아니라 식물체 전 생육기에 잎 탄저병 증상을 나타내었으며 또한 고추 열매에서도 강한 병원성을 나타내었다.
- 이상의 결과로 볼 때 유묘에서 분리된 균주는 일반고추포장에서 발생하는 탄저병균과 동일한 것으로 단지 육묘상에서 탄저병 감염이 이루어진 것으로 추정되었다. 따라서 유묘 분리균은 유묘 뿐 아니라 고추 전생육기에 걸쳐 잎과 신초 그리고 일반 탄저병균처럼 열매에 까지 강한 병원성을 나타냈다.
- 9% 이병엽율을 나타내었다. 또한붉은고추와 풋고추에 접종하여 병원성 검정을 한 결과를보면 각각 75.4%와 82.2%의 이병과율을 나타내었다(Fig. 1F, G). 이상의 결과로 볼 때 유묘에서 분리된 균주는 일반고추포장에서 발생하는 탄저병균과 동일한 것으로 단지 육묘상에서 탄저병 감염이 이루어진 것으로 추정되었다.
- 병든 유묘로부터 분리한 균을 PDA 배지에 배양한 후 균총의 색깔과 형태, 포자의 모양과 크기를 관찰한 결과(Table 1) 균총의 색깔은 처음에는 핑크색 띄나 차츰 회색으로 변하였고(Fig. II), 분생포자는 오렌지 색의 분생자층에 다량 형성하였고, 격막이 없고 투명하며, 방추형으로 양끝이 약간 뾰족한 형태로서, 크기는 8.1-17.0x2.0-3.8um였다(Fig. 1H). 생장최적온도 25-27<>C로서C.
- 병원균의 분자생물학적 동정을 위해 고추유묘에서 분리한 균주를 Collectotrichum acutatum 특이적 primer인 Calnt(GGGGAAGCCTCTCGCGG)과 C. gloeosporioides 특이적 primer인 CgInt(GGCCTCCCG- CCTCCGGGCGG)와 C. coccodes 특이적 primer인 Cclnt (TCTCCCCGTCCGCGGGTGGX 이용하여 PCR 분석한 결과 CaINT에서만 496 bp의 증폭 산물을 얻어 C. acutatum 으로 동정하였다(Fig. 2). 또한 유묘에 탄저병을 일으키는 것으로 보고된 C.
- 본 시험에서 분리된 균주 뿐 아니라 일반적인 탄저병 균도 고추 유묘에 병원성을 나타내는지에 대한 검토를 위해 고추 및 다른 기주에서 분리된 탄저병균 19개 균주를 가지고 독야청청 유묘에 대한 병원성을 검정한 결과 고추에서 분리된 탄저병균은 고추유묘에서도 모두 병원성을 나타낸 것으로 조사되었다(Table 3). 특히 고추열매 뿐 아니라 노지에서 재배중인 성숙한 고추잎에 암갈색으로 병반이 형성되며 잎가장자리부터 수침상으로 썩는 증상에서 분리했던 C.
- IB). 신초와 여린 잎은 수침상으로 물러썩는 피해를 나타내었으며 병든 식물체로부터 병원균을 분리한 결과 핑크색 내지 회색을 띤 균총을 형성하는 탄저병균을 분리하였다. 국내의 고추 탄저병균으로는 C.
- acutatum에 특이적인 프라이머인 CaINT에서만 496 bp의 증폭산물을 얻었다. 이들 결과를 바탕으로 유묘에서 분리한 균은 Collectotrichwn acutatimi으로 동정하였다. 고주 유묘에서 분리한 균주를 고추 묘 생육단계별로 병원성 검정한 결과 유묘 뿐 아니라 식물체 전 생육기에 잎 탄저병 증상을 나타내었으며 또한 고추 열매에서도 강한 병원성을 나타내었다.
- 1F, G). 이상의 결과로 볼 때 유묘에서 분리된 균주는 일반고추포장에서 발생하는 탄저병균과 동일한 것으로 단지 육묘상에서 탄저병 감염이 이루어진 것으로 추정되었다. 따라서 유묘 분리균은 유묘 뿐 아니라 고추 전생육기에 걸쳐 잎과 신초 그리고 일반 탄저병균처럼 열매에 까지 강한 병원성을 나타냈다.
- 이상의 결과를 볼 때 유묘탄저병균은 유묘를 새롭게 침입하는 특이한 변이종이 아니라 실제로 고추포장에서 발생하는 탄저병과 동일한 균이며 일반적으로 탄저병이 수확기 고추 열매에만 피해를 준다는 인식과는 달리 유묘및 전 생육기에서도 감염이 이루어져 피해를 나타낼 수있는 것으로 판단되었다. 지금까지 국내에서 C.
- acutatum도 고추 유묘에 병원성을 나타내었다. 이에 비해 난에서 분리된 Glomerella cingulata 1종이 약한 병원성을 보였을 뿐 나머지 균주는 병원성이 없는 것으로 조사되었다(Table 3). 임과 이(2004)도 참깨 등 6종의 기주에서 분리된 각종 탄저병균을 고추 열매에 접종한 결과 고추분리균인 C.
- 8 |im이며 생장최적온도 25-27。。이다. 종 특이적 프라이머를 이용하여 고추 유묘에서 분리한 균을 동정한 결과 C. acutatum에 특이적인 프라이머인 CaINT에서만 496 bp의 증폭산물을 얻었다. 이들 결과를 바탕으로 유묘에서 분리한 균은 Collectotrichwn acutatimi으로 동정하였다.
- 나타낸 것으로 조사되었다(Table 3). 특히 고추열매 뿐 아니라 노지에서 재배중인 성숙한 고추잎에 암갈색으로 병반이 형성되며 잎가장자리부터 수침상으로 썩는 증상에서 분리했던 C. acutatum도 고추 유묘에 병원성을 나타내었다. 이에 비해 난에서 분리된 Glomerella cingulata 1종이 약한 병원성을 보였을 뿐 나머지 균주는 병원성이 없는 것으로 조사되었다(Table 3).
후속연구
- 따라서 본 시험에서 분리된 균은 유묘 뿐 아니라 성묘 및 열매에도 강한 병원성을 가지고 있어 고추 육묘과정에서부터 탄저병이 감염되어 피해가 확산될 것이 우려되므로 초기감염에 주의하여 탄저병 방제지도가 필요할 것으로 판단되었다.
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