반응표면분석 법을 이용한 Paracoccus sp.의 Astaxanthin 생산배지 최적화 Optimization of Medium for Astaxanthin Production by Paracoccus sp. Using Response Surface Methodology원문보기
Paracoccus sp.의 astaxanthin 생산성 증가를 위해 반응표면 분석법을 사용하여 최적의 배지조성을 설계하였다. Paracoccus의 성장 배지인 Marine Broth와 modified Blaszczyk 배지를 사용하여 astaxanthin 생산성을 측정한 결과 각각 0.39 mg/L, 0.40 mg/L의 astaxanthin 농도를 보였다. Modified Blaszczyk 배지의 조성을 각각 변수로 두어 가장 많은 영향을 주는 성분을 알아본 결과 $MgSO_4$와 yeast extract로 확인되었다. 중심합성계획법에 따라 $MgSO_4$ ($0.397{\sim}4.621$ g/L), yeast extract ($2.879{\sim}7.121$ g/L)를 달리하였을 때, astaxanthin 생상성에 대한 회귀식의 $R^2$은 0.894로 나타났고, 이에 따른 최대 생산량에 0.925 mg/L로 예상되었으며 이때의 $MgSO_4$와 yeast extract의 농도는 각각 2.83과 7.02 g/L로 나타났다. 이에 대한 확인실험 결과 2.83 $MgSO_4$ g/L, 7.02 yeast extract g/L에서 1.021 mg/L의 astaxanthin이 생산되었으며, 배지의 최적화에 따라 250% 이상의 생산성 증가가 확인되어졌다.
Paracoccus sp.의 astaxanthin 생산성 증가를 위해 반응표면 분석법을 사용하여 최적의 배지조성을 설계하였다. Paracoccus의 성장 배지인 Marine Broth와 modified Blaszczyk 배지를 사용하여 astaxanthin 생산성을 측정한 결과 각각 0.39 mg/L, 0.40 mg/L의 astaxanthin 농도를 보였다. Modified Blaszczyk 배지의 조성을 각각 변수로 두어 가장 많은 영향을 주는 성분을 알아본 결과 $MgSO_4$와 yeast extract로 확인되었다. 중심합성계획법에 따라 $MgSO_4$ ($0.397{\sim}4.621$ g/L), yeast extract ($2.879{\sim}7.121$ g/L)를 달리하였을 때, astaxanthin 생상성에 대한 회귀식의 $R^2$은 0.894로 나타났고, 이에 따른 최대 생산량에 0.925 mg/L로 예상되었으며 이때의 $MgSO_4$와 yeast extract의 농도는 각각 2.83과 7.02 g/L로 나타났다. 이에 대한 확인실험 결과 2.83 $MgSO_4$ g/L, 7.02 yeast extract g/L에서 1.021 mg/L의 astaxanthin이 생산되었으며, 배지의 최적화에 따라 250% 이상의 생산성 증가가 확인되어졌다.
This study was to optimize the medium components for astaxanthin production in Paracoccus sp. through surface response methodology. A screening test was first conducted on 5 medium components using a Plackett-Burman design, from which $MgSO_4$ and yeast extract were identified as the sign...
This study was to optimize the medium components for astaxanthin production in Paracoccus sp. through surface response methodology. A screening test was first conducted on 5 medium components using a Plackett-Burman design, from which $MgSO_4$ and yeast extract were identified as the significant factors affecting astaxanthin production. These significant factors were optimized by central composite design of experiments and response surface methodology, as 2.83 g/L $MgSO_4$ and 7.02 g/L yeast extract, respectively. The expected astaxanthin concentration with these optimized medium compositions were 0.925 mg/L. In flask culture, the experimentally obtained concentration of astaxantin was 1.021 mg/L, where it had been 0.4 mg/L before optimization.
This study was to optimize the medium components for astaxanthin production in Paracoccus sp. through surface response methodology. A screening test was first conducted on 5 medium components using a Plackett-Burman design, from which $MgSO_4$ and yeast extract were identified as the significant factors affecting astaxanthin production. These significant factors were optimized by central composite design of experiments and response surface methodology, as 2.83 g/L $MgSO_4$ and 7.02 g/L yeast extract, respectively. The expected astaxanthin concentration with these optimized medium compositions were 0.925 mg/L. In flask culture, the experimentally obtained concentration of astaxantin was 1.021 mg/L, where it had been 0.4 mg/L before optimization.
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문제 정의
하지만, 아직까지 Paracoocus를 이용한 astaxanthin의 생산성이 낮다는 단점이 있다. 따라서 본 논문에서는 astaxanthin의 생산성 향상을 위한 Paracoccus 배양의 최적화를 수행하였다.
반응표면분석은 전형적인 최적화 방법으로 일반적으로 여러 변수를 사용하여 최적 조건을 찾는 system(lO) 으로 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 효과를 측정하여 변수들의 최적값을 확인할 수 있는 분석법이다 따라서 본 연구는 Paracoccus를 이용한 astaxanthin 생산의 산업적 이용 가능성을 알아보기 위해 반응표면분석을 사용하여 astaxanthin의 최대 생산성을 보여주는 배지의 조성을 조사하였다.
제안 방법
무기염이 carotenoids 생성을 증가시킨다는 보고(17)에 따라 MgSd . 7H2O, (NH4)2SO4 과 질소원인 tryptone, yeast extract, 그리고 NaCl을 각각의 독립변수로 두어 astaxanthin 농도를 즉정하여 astaxanthin 농도에 영향을 주는 인자를 확인하였다.
0 g/L)을 고정시키고 MgSO4 . 7玦0와 yeast extract의 농도에 변화를 주어 steepest ascent experiment (SAE)를 측정하였다.
HryLC는 Agilent사 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)의 1200 series를 이용하였다 Columne Thermo® C-18, 250 x 4.6 mm, particle size; 5 pm column (Thermo electron coperation, USA)을 사용하였고 column 온도는 30℃ 로하였다 이동상으로는 dichloromethane, methanol, acetonitrile, w* ater 비율을 달리하여 용매 A (5 : 85 : 5.5 : 4.5, v/v) 와 용매 B (22 : 28 : 45.5 : 수5, v/v)로 하였다. 각각의 용매는 5분까지 용매 A를 100%로 하였고, 8분까지 용매 B를 100%로 점차적으로 올렸다.
MgSO4, yeast extract의 농도와 astaxanthin 생산량과의 관계를 파악하기 위해 Fig. 1과 같이 3차원 그래프 및 윤곽그래프로 표현하였다. 그림에서와 같이 yeast extract의 농도가 증가할수록 astaxanthin의 생산량이 증가하였으며, yeast extract 가 증가할수록 MgSQ 또한 증가하여야 astaxanthin의 생산성이 증가한다는 것을 알 수가 있었다.
각각의 용매는 5분까지 용매 A를 100%로 하였고, 8분까지 용매 B를 100%로 점차적으로 올렸다. 그 후 5분 동안 용매 B 의 비율을 100%로 유지한 다음 2분 동안 시작 할 때의 용매 비율과 같게 하였다 유속은 1 mL/min이었으며, DAD detector로 480 nm에서 분석하였다 표준곡선은 astaxanthin (Sigma)을 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였다.
Paracoccus sp. 의 astaxanthin 생산성 증가를 위해 반응표면 분석법을 사용하여 최적의 배지조성을 설계하였다. Paracoccus 의 성장 배지인 Marine Broth와 modified Blaszczyk 배지를 사용하여 astaxanthin 생산성을 측정한 결과 각각 0.
배지조성에 대한 실험계획은 중심합성계획 (Central composite design; CCD)(15) 을 사용하였다. 중심점 (Center Point; CP)을 잡기위해 steepest ascent experiment (SAE) 를 하였으며, SAE 결과 최대값을 얻었을 때의 변수를 중심점으로 하여 CCD 실험설계를 하였다. 12개의 실험군은 각각 3반복 하여 실험하였으며 이에 따른 모델식은 다음과 같다(식 1).
대상 데이터
8 g/L, MgSQf . 7H2O (DO Chemical co, Seoul, Republic of Korea) 0.5 g/L, tryptone (Difco) 0.25 g/L, yeast extract (Difco) 1 g/L, NaCl (DO Chemical Co) 2 g/L, (NHQSCZ (DO Chemical Co) 1 g/L의 조성을 사용하였다.
sp. N81106 (MBIC 01143, Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Iwate, Japan)을 사용하였다. 이 균주는 Marine Broth (Difco Laboratories, Sparks, MD, USA) 배지에 접종하여 30% glycerol에 현탁하여 -70℃ 에 보관하여 사용하였으며, Marine Agar (Difco) 배지를 이용하여 25℃에서 계대 배양하였다.
데이터처리
, Cary, NC)를 이용하였다(16). 실험결과를 분산분석, 모수추정, 능선분석과 정준분석 등을 이용하여 독립 변수에 대한 종속변수를 등고선 또는 삼차원 표면도로 나타내어 함수관계를 추정하고, 예측하여 최적화 하였다.
이론/모형
Astaxanthin 생산량의 측정은 HPLC (High Perforniance Liquid Chromatography)를 이용하였다. 배양액을 원심분리기 (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, German)를 사용하여 13, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상충액을 제거하고, methanol : dichloromethane (3 : 1)용액을 1 mL 첨가하여 20분간 sonication 하여 세포벽을 파쇄하여 색소가 용매에 추출되도록 한 다음 13, 000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 불순물이 제거된 용매층을 취하였다
Astaxanthin의 최대 생산성을 보여주는 배지 조성을 최적화하기 위해 반응표면분석법 (RSM)(13, 14)을 이용하였다. 배지조성에 대한 실험계획은 중심합성계획 (Central composite design; CCD)(15) 을 사용하였다.
반응표면분석을 위하여 SAS (Statical Analysis System, SAS International Inc., Cary, NC)를 이용하였다(16). 실험결과를 분산분석, 모수추정, 능선분석과 정준분석 등을 이용하여 독립 변수에 대한 종속변수를 등고선 또는 삼차원 표면도로 나타내어 함수관계를 추정하고, 예측하여 최적화 하였다.
배지조성에 대한 실험계획은 중심합성계획 (Central composite design; CCD)(15) 을 사용하였다. 중심점 (Center Point; CP)을 잡기위해 steepest ascent experiment (SAE) 를 하였으며, SAE 결과 최대값을 얻었을 때의 변수를 중심점으로 하여 CCD 실험설계를 하였다.
실험 설계는 Plackett-Bunnan의 방법(12)을 이용하여 설계하였으며, 각각 25 mL씩 250 mL baffled flask에 넣고 멸균한 후 균주를 접종하여 25℃에서 150 rpm으로 교반하여 3일간 배양하여 사용하였다.
이러한 modified Blaszczyk 배지를 최적화하기 위하여 반응표면 분석법을 이용하여 실험설계 하였다.
성능/효과
. 7H2O가 첨가되지 않고, tryptone 0.5 g/L, yeast extract 1.5 g/L, NaCl 3 g/L, (NHQzSQi 1.5 g/L가 첨가되었을 때였고 astaxanthin 생산량은 0.66 mg/L의 생산성을 보였다 가장 적게 생합성한 배지는 MgSO4 - 7氏0와 try戏tone 이 첨가되지 않은 yeast extract 0.5 g/L, NaCl 1 g/L, (NH4)2SO4 0.5 g/L의 조성을 가질 경우였으며, 이 때 astaxanthin 생산량은 0.26 mg/L을 보였다.
의 astaxanthin 생산성 증가를 위해 반응표면 분석법을 사용하여 최적의 배지조성을 설계하였다. Paracoccus 의 성장 배지인 Marine Broth와 modified Blaszczyk 배지를 사용하여 astaxanthin 생산성을 측정한 결과 각각 0.39 mg/L, 0.40 mg/J의 astaxnathin 농도를 보였다 Modified Blaszczyk 배지의 조성을 각각 변수로 두어 가장 많은 영향을 주는 성분을 알아본 결과 MgSQi와 yeast extract로 확인되었다. 중심합성계획법에 따라 MgSO4 (0.
1과 같이 3차원 그래프 및 윤곽그래프로 표현하였다. 그림에서와 같이 yeast extract의 농도가 증가할수록 astaxanthin의 생산량이 증가하였으며, yeast extract 가 증가할수록 MgSQ 또한 증가하여야 astaxanthin의 생산성이 증가한다는 것을 알 수가 있었다. 즉, astaxanthin 생산에 가장 많은 영향을 주는 변수는 yeast extract이 었으며, MgSC)4는 일정 농도에서 astaxanthin의 생산성을 증가시켜 주지만 일정 농도 이상의 MgSO4 첨가 시 astaxanthin 의 생산량이 줄어드는 결과를 얻었다
반응표면분 석으로 예측된 정상점을 안장점으로 능선분 석을 실시한 결과 astaxanthin의 최대 생산량은 0.925 mg/L 이였고 이때의 MgSC)4 및 yeast extract의 농도는 각각 2.83과 7.02 g/L으로 나타났다. 이에 따른 확인 실험을 수행한 결과 1.
02 g/L로 나타났다. 이에 대한 확인실험 결과 2.83 MgSO4 g/L, 7.02 yeast extract g/L에서 1.021 mg/L의 astaxanthin이 생산되었으며, 배지의 최적화에 따라 250% 이상의 생산성 증가가 확인되어졌다.
40 mg/J의 astaxnathin 농도를 보였다 Modified Blaszczyk 배지의 조성을 각각 변수로 두어 가장 많은 영향을 주는 성분을 알아본 결과 MgSQi와 yeast extract로 확인되었다. 중심합성계획법에 따라 MgSO4 (0.397-4.621 g/L), yeast extract (2.879—7.121 g/L)를 달리하였을 때, astaxanthin 생산성에 대한 회귀식의 R2은 0.894로 나타났고, 이에 따른 최대 생산량은 0.925 mg/L로 예상되었으며 이때의 MgSO4 와 yeast extract의 농도는 각각 2.83과 7.02 g/L로 나타났다. 이에 대한 확인실험 결과 2.
그림에서와 같이 yeast extract의 농도가 증가할수록 astaxanthin의 생산량이 증가하였으며, yeast extract 가 증가할수록 MgSQ 또한 증가하여야 astaxanthin의 생산성이 증가한다는 것을 알 수가 있었다. 즉, astaxanthin 생산에 가장 많은 영향을 주는 변수는 yeast extract이 었으며, MgSC)4는 일정 농도에서 astaxanthin의 생산성을 증가시켜 주지만 일정 농도 이상의 MgSO4 첨가 시 astaxanthin 의 생산량이 줄어드는 결과를 얻었다
측정 결과 astaxanthin을 가장 많이 생합성한 배지 조건은 MgSO4 . 7H2O가 첨가되지 않고, tryptone 0.
참고문헌 (17)
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