[논문]반응표면분석법을 이용한 Leuconostoc mesenteroides SRCM201425의 만니톨 생산배지 최적화

하광수; 신수진; 정성엽; 양호연; 임수아; 허주희; 양희종; 정도연

doi:10.5352/jls.2019.29.8.861

초록
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본 연구에서는 경제성 있는 생물학적 만니톨 고생산을 위해 선별균주의 만니톨 생산 최적화 배지조성을 RSM 방법을 이용하여 확립하고자 하였다. 먼저 김치로부터 분리된 10균주의 만니톨 생산량과 과당으로부터 만니톨 전환율 분석을 통하여 SRCM201425 균주를 선발하였으며, 선발균주는 16S rRNA 유전자 염기서열과 당 발효 분석을 통하여 Leuconostoc mesenteroides로 동정하였다. Plackett-Burman design (PBD)을 이용하여 만니톨 생산에 영향을 주는 배지 인자를 선별하기 위해 총 11개의 탄소원, 질소원, 무기원소의 영향을 조사하였으며, 통계학적 분석을 통하여 최종적으로 fructose와 sucrose, peptone을 선정하였다. 만니톨 생산을 위한 선별된 각 변수의 최적 농도를 결정하기 위한 방법으로 central composite design (CCD)과 반응표면 분석법을 이용하였으며, 최종적으로 CCD를 통해 만니톨 생산을 위한 배지 조성의 최적 농도는 fructose 38.68 g/l, sucrose 30 g/l, peptone 39.67 g/l으로 예측되었으며, 통계학적 분석을 통해 실험모델의 적합성을 확인하였다. 최종적으로 MRS 배지에서의 생산량의 약 20배의 만니톨을 생산할 수 있었으며, 100 g/l의 fructose가 포함된 MRS 배지 대비 97.46%의 만니톨을 생산하면서, 산업화시 기존 배지 대비 생산비용을 크게 절감할 수 있을 것으로 예상되었다. 본 연구를 통하여 만니톨 생산을 위한 배지 조성의 최적화를 확립하였으며, 만니톨을 생산하기 위한 방법으로 주로 사용되고 있는 고비용의 촉매환원 방법을 대체할 방법을 제시할 수 있는 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was undertaken to establish optimum medium compositions for cost-effective mannitol production by Leuconostoc mesenteroides SRCM201425 isolated from kimchi. L. mesenteroides SRCM21425 from kimchi was selected for efficient mannitol production based on fructose analysis and identified by i...

This study was undertaken to establish optimum medium compositions for cost-effective mannitol production by Leuconostoc mesenteroides SRCM201425 isolated from kimchi. L. mesenteroides SRCM21425 from kimchi was selected for efficient mannitol production based on fructose analysis and identified by its 16S rRNA gene sequence, as well as by carbohydrate fermentation pattern analysis. To enhance mannitol production by L. mesenteroides SRCM201425, the effects of carbon, nitrogen, and mineral sources on mannitol production were first determined using Plackett-Burman design (PBD). The effects of 11 variables on mannitol production were investigated of which three variables, fructose, sucrose, and peptone, were selected. In the second step, each concentration of fructose, sucrose, and peptone was optimized using a central composite design (CCD) and response surface analysis. The predicted concentrations of fructose, sucrose, and peptone were 38.68 g/l, 30 g/l, and 39.67 g/l, respectively. The mathematical response model was reliable, with a coefficient of determination of $R^2=0.9185$. Mannitol production increased 20-fold as compared with the MRS medium, corresponding to a mannitol yield 97.46% when compared to MRS supplemented with 100 g/l of fructose in flask system. Furthermore, the production in the optimized medium was cost-effective. The findings of this study can be expected to be useful in biological production for catalytic hydrogenation causing byproduct and additional production costs.

주제어

표/그림 (11)

표 Table 1. Variables showing medium components used in Plackett-Burman design and design matrix with the observed response (mannitol, g/l)
표 Table 2. Results of mannitol production by 10 isolates of Leuconostoc species in MRS supplemented with 100 g/l of fructose medium
그림 Fig. 1. The neighbor-joining tree derived from L. mesenteroides SRCM201425. The bootstrap values were calculated based on 1,000 replications to estimate the topological robustness.
표 Table 3. Biochemical profile of the API 50 CH of L. mesenteroides SRCM201425
그림 Fig. 2. (A) Time course profile of mannitol production by L. mesenteroides SRCM201425 in MRS broth and (B) MRS broth supplemented with 100 g/l of fructose. ●: Log CFU/ml, ○: fructose or glucose (g/l), ▲: Mannitol (g/l), △: pH.
표 Table 4. Statistical analysis of medium components on mannitol production as per Plackett-Burman design
그림 Fig. 3. One factor plot of the effects of each variable on mannitol production using Plackett-Burman design.
표 Table 5. Central composite design matrix with experimental values of mannitol production
그림 Fig. 4. Three dimensional response surface plots by response surface methodology showing (A) influence of fructose (X₁) & sucrose (X₂), (B) fructose (X₁) & peptone (X₃), (C) sucrose (X₂) & peptone (X₃).
표 Table 6. ANOVA for the experimental results of the central composite design (quadratic model)
그림 Fig. 5. Comparison of mannitol production in different media, MRS (basal medium), MRS supplemented with 100 g/l of fructose as well as comparing the model to actual. Data are presented as the mean ± SD of triplicates.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 전통발효식품인 김치로부터 만니톨 생산을 위한 균주를 선별하였으며, 만니톨을 포함한 polyhydric alcohol의 생산은 미생물의 종류나 배양조건에 따라 큰 차이를 나타내는 것으로 알려져 있으므로[19], 대량 생산시 생산비용 절감을 위해 최종 선발된 Leuconostoc mesenteroides SRCM201425 균주에서 만니톨을 생산하기 위한 통계학적 기법인 반응표면분석법을 이용하여 산업용 최적 배지조건을 확립하고자 하였다.

제안 방법

중심합성계획법에 의해 예측된 만니톨 생산을 위한 최적 배지에서의 만니톨 생산량을 검증하기 위해 모델에 의해 예측된 배지에 L. mesenteroides SRCM201425 균주를 접종하여 만니톨 생산량을 측정하였다. 배양액의 만니톨 함량을 측정한 결과 27.

대상 데이터

전국에서 미생물 분리를 위한 시료로 김치 40종을 수집하였으며, 수집한 김치 시료 1 g을 0.85% NaCl 용액 9 ml에 현탁하여 단계별로 희석하고, 희석액 100 μl을 MRS (Difco, Sparks,MD, USA) 배지에 도말하여 30℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 균주를 순수분리 하기 위해 배지 위에 형성된 광택을 띄는 백색 집락의 형태학적 차이를 이용하여 선별한 후 MRS 배지에 획선도말하여 다시 순수 분리하여 보관하였다.

데이터처리

는 각 독립변수간의 교호작용 계수를 나타낸다[14]. 회귀분석에 의한 모델식은 Design expert 11 program을 이용하여 예측하였고, 회귀분석에 의한 결과를 바탕으로 임계점 및 만니톨 생산을 위해 선별된 3개의 독립변수인 fructose,sucrose, peptone의 최적 농도를 예측하였으며, analysis of variance (ANOVA) 분석을 통하여 통계적 유의성을 검정하였다.

이론/모형

0 (EMBL-EBI, Hinxton, Cambridgeshire, UK)를 사용하였다. 계통도 분석에는 Mega 7.0.26 program을 이용한 근린결합법(neighbor-joining method)[13]을 사용하였으며, bootstrap 분석을 1,000회 시행하여 계통수의 신뢰도를 확보하였다. 또한 SRCM201425 균주의 당 이용성 패턴은 API 50 CHL kit (bioMérieux, MarcyI’Etoile, France)를 사용하여 분석하였다.
만니톨 생산에 영향을 주는 배지 성분을 선별하기 위해 통계학적 방법으로 Plackett-Burman Design (PBD)을 설계하였다. 미생물의 성장 또는 Leuconostoc mesenteroides 균주의 만니톨 생산에 영향을 주는 것[9, 12, 16, 17]으로 알려진 변수는 탄소원 4종(glucose, fructose, sucrose, molasses), 질소원 4종(yeast extract, peptone, tryptone, beef extract), 무기질 3종(KH₂PO₄,MgSO₄․7H₂O, MnSO₄․H₂O)으로 구성하였으며, 만니톨 생산에 주요한 효과가 있는 3개의 변수를 선별하기 위해 3개의 중심점을 포함한 15개의 실험구를 구성하였다.

성능/효과

수집한 40개의 김치시료로부터 이형발효균 중 10주의 Leuconostoc 속 균주를 분리하였으며, 분리균주의 fructose가 100 g/l의 농도로 포함된 MRS 배지에서 30℃, 150 rpm으로 30시간 배양하여 만니톨 생산량과, fructose로부터의 수율, 균주 성장에 따른 만니톨 생산량을 분석하였다(Table 2). 그 결과 균주마다 만니톨의 생산량과 fructose로부터의 전환율에 차이가 나타났으며, 분리한 Leuconostoc 속의 10 균주 중 Leuconostoc mesenteroides SRCM201425 균주가 만니톨의 생산량, 전환율 및 세포성장 대비 생산량에서 가장 우수한 것으로 나타났다. Otgonbayar의 연구결과[10]에 의하면 40 g/l의 fructose가 첨가된 MRS 배지에서 Leuconostoc 속의 만니톨 생산량은 23.
mesenteroides SRCM201425 균주를 접종하여 만니톨 생산량을 측정하였다. 배양액의 만니톨 함량을 측정한 결과 27.01±0.38 g/l로 MRS 배지에서의 생산량보다 약 20배의 만니톨이 생산되는 것으로 측정되었고, 예측된 값인 27.48±1.10 g/l의 오차범위 내에 존재하여 실측값이 예측값과 동일함을 확인하였으며, 100 g/l의 fructose를 첨가한 MRS배지에서의 만니톨 생산량과 거의 유사한 것으로 나타났다(Fig. 5). 이전의 연구결과[10]에 의하면 40 g/l의 fructose를 첨가한 MRS 배지에서 10종의 Leuconostoc 속의 균주가 23.
설정범위 내에서 sucrose와 peptone은 농도가 높아질수록 만니톨 생산량이 증가하는 것으로 나타났으나 fructose는 농도가 높아질수록 만니톨 생산이 증가하다 일정농도 이상에서는 다시 감소하는 것으로 나타났다. 중심합성계획법을 기반으로 만니톨 생산 증가에 영향을 주는 변수와 각 변수의 최적 농도를 예측하였고 모델에 의해 예측된 만니톨 최대 생산을 위한 배지조성의 농도는 fructose 38.68 g/l, sucrose 30 g/l, peptone 39.67 g/l로 나타났으며, 이때의 최대 만니톨 생산량은 27.48±1.10 g/l로 예측되었다.

후속연구

본 연구를 통해 fructose를 첨가한 MRS 배지에서의 생산비용 대비 약 30%-50%의 생산비용을 절감할 수 있을 것으로 예상되며, 대량생산시 생산비용 절감효과는 더 커질 것으로 판단된다. 향후 만니톨 생산을 위한 산업적 균주 개량과 만니톨 생산을 위한 배양 초기 pH, 배양 온도 등의 추가적인 물리적인 요인의 최적화를 수행을 통해 만니톨 생산량을 더욱 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	만니톨 생산의 한계점은?	만니톨은 다양한 채소와 과일 및 버섯에 소량으로 존재하는 육탄당의 알코올로 sucrose에 비해 50%의 당도를 가지며, 혈중 glucose의 농도를 증가시키지 않아 고혈압 환자를 위한 대체 감미료로 사용되고 있으며[9], 미국 Food and Drug Administration (FDA)에 의해 Generally Recognized as Safe (GRAS)로 승인되어 식품, 제약, 화학, 화장품 등 매우 광범위한 산업에 활용되고 있다[11, 16]. 통상 만니톨은 설탕 등을 가수분해하여 과당을 분리하고 이 과당을 고온고압하의 촉매 하에서 화학적으로 수소첨가하여 생산하고 있으며, 이러한 방법은 부산물로 솔비톨을 생성하여 순도 높은 만니톨의 생산이 어려우며, 솔비톨과의 분리 정제 공정이 필요하여 생산 단가가 높다는 한계를 가지고 있다[17]. 또한 최근 소비자의 화학합성 물질에 대한 기피현상과 천연물질에 대한 선호도가 높아지는 경향이 나타나고 있어, 이를 대체할 수 있는 미생물을 통한 만니톨생산은 화학 합성생산법의 대안으로 연구되고 있다[11].
	만니톨이란?	만니톨은 다양한 채소와 과일 및 버섯에 소량으로 존재하는 육탄당의 알코올로 sucrose에 비해 50%의 당도를 가지며, 혈중 glucose의 농도를 증가시키지 않아 고혈압 환자를 위한 대체 감미료로 사용되고 있으며[9], 미국 Food and Drug Administration (FDA)에 의해 Generally Recognized as Safe (GRAS)로 승인되어 식품, 제약, 화학, 화장품 등 매우 광범위한 산업에 활용되고 있다[11, 16]. 통상 만니톨은 설탕 등을 가수분해하여 과당을 분리하고 이 과당을 고온고압하의 촉매 하에서 화학적으로 수소첨가하여 생산하고 있으며, 이러한 방법은 부산물로 솔비톨을 생성하여 순도 높은 만니톨의 생산이 어려우며, 솔비톨과의 분리 정제 공정이 필요하여 생산 단가가 높다는 한계를 가지고 있다[17].
	미생물을 배양할 때 배지 최적화를 위해 사용되었던 고전적 방법인 일원배치법의 한계점은?	미생물이 생산하는 대사산물의 생산 효율은 다양한 물리적인 조건이나 배양 성분 및 농도, 배양시간 등에 의해 향상될 수 있으므로 미생물의 배양조건 확립이 필수적이다[5]. 배지 최적화를 위해 사용되었던 고전적 방법인 일원배치법(one factor at a time method)는 다른 변수의 농도는 일정하게 하고, 오직 하나의 변수 농도변화를 이용하기 때문에 연구에 오랜 시간이 소비되고 다양한 변수간의 상호작용을 파악하기 어려우며, 많은 비용이 필요하다는 한계를 가지고 있다[2]. 최근에는 이런 단점을 보완하기 위해 미생물 배양 및 배지 조성에 관하여 최적조건을 확립할 때 적은 실험 횟수로 결과를 쉽게 얻을 수 있는 반응표면분석법(RSM, response surface methodology)을 사용한다[7, 8].

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