[논문]돼지 난포 발달 시 과립막 세포에서 발현되는 단백질의 변화

채인순; 장동민; 정희태; 양부근; 박춘근

[국내논문] 돼지 난포 발달 시 과립막 세포에서 발현되는 단백질의 변화
Changing Proteins in Granulosa Cells during Follicular Development in Pig 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.33 no.3, 2009년, pp.183 - 187

채인순 (강원대학교 동물생명과학대학) , 장동민 (차의과학대학 줄기세포연구실) , 정희태 (강원대학교 수의학부대학) , 양부근 (강원대학교 동물생명과학대학) , 박춘근 (강원대학교 동물생명과학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

This study analyzed change of proteins in granulosa cells during the porcine follicuar development by proteomics techniques. Granulosa cells of the follicles, of which the diameter is $2{\sim}4\;mm$ and $6{\sim}10\;mm$, were collected from ovary of slaughtered pig that each follicle of diameter $1{\sim}4\;mm$ and $6{\sim}10\;mm$. We extracted glanulosa cell proteins by M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent. Proteins were refined by clean-up kit and quantified by Bradford method until total protein was $200{\mu}l$. Immobilized pH gradient(IPG) strip used 18 cm, $3{\sim}10\;NL$. SDS-PAGE used 10% acrylamide gel. After silver staining, Melanie 7 and naked eye test were used for spot analyzation. Increasing proteins in glanulosa cell of $6{\sim}10\;mm$ follicle were 7 spots. This spots were analyzed by MALDI-TOF MS and searched on NCBInr. In results, 7 spots were similar to zinc/ling finger protein 3 precursor (RING finger protein 203), angiomotin, heat shock 60 kDa protein 1 (chaperonin) isoform 1 (HSP60), similar to transducin-like enhancer protein 1 (TLE 1), SH3 and PX domains 2A (SH3PXD2A). Those proteins were related with transfer between cells. Increase of proteins has an effect on follicular development.

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AI 본문요약
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문제 정의

않았다. 따라서 난포 생성 동안 과립막 세포의 증식, 분화 및 성숙을 조절하는 메커니즘의 이해를 증진시키기 위하여 본연구에서는 돼지에서 난포 생성에 관여하는 단백질 인자들을 프로테오믹스 기법을 이용하여 확인하고자 하였다.
본 연구는 돼지난소의 난포 발달단계에 따라 과립 막 세포에서 발현되는 단백질의 변화를 확인하기 위해 수행되었다. 연구에서 돼지 난소의 난포 직경은 체외성숙 및 수정에 일반적으로 이용되는 미성숙 난자를 포함하는 2~4 ㎜와 난소 내에서 난포의 발달이 이루어져 배란을 준비하는 6〜10 ㎜로 설정하였다.

제안 방법

운반하였다. 난포액은 10 ml 주사기에 18G 주사침을 이용하여 직경 2~4 ㎜의 종속난포와 6~10 ㎜의 우세난포로부터 각각 흡입, 회수하였다. 이를 70 pm filter를 이용하여 난자를 제거하고, 10부간 800 g로 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
Qean-up kit(Amersham Biosciences, 80-6484-51, USA) 를 이용해 단백질을 정제하여 Bradford 법을 이용하여 총 단백질량이 200 ug/iil가 되도록 정량하여 Rehydra tion buffer(GE Healthcare, 71-5025-42AE, Sweden) 녹여 총 250 μ1가 되도록 하였다. 이것을 18 cm인 NL 3~ 10의 IPG strip(Amersham Biosciences, 17-1234-01, Swe- den)을 이용하여 20°C에서 16시간 동안 흡수시켰다.
이것을 18 cm인 NL 3~ 10의 IPG strip(Amersham Biosciences, 17-1234-01, Swe- den)을 이용하여 20°C에서 16시간 동안 흡수시켰다. Iso electric Focusing(IEF)는 Protean IEF cell(BioRad)을 이용하여 250 V에서 2시간, 8, 000 V에서 3시간, 8, 000 V에서 60, 000 Vhr까지 채우는 방법으로 시행하였다. IEF가끝난 IPG strip을 equilibration buffer[1.
SDS-PAGE 는 10% acrylamide gel 에 IPG strip 을 sample 로 이용하여 150 V에서 10분간, 3QmA에서 10시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 silver staining kit(GE Healthcare, 17-1150-01, Sweden)을 이용하여 염색한 후' 이미지 분석프로그램인 Melanie 7로 spots를 분석하고, 육안으로 검토하였다.
Gel을건조시키기 위해 100% acetonitrile(ACN)에 5분간 침지한 후, ACN을 제거하고 20~30분간 speed-vac하였다.
8), promega sequencing grade modified trypsin 20 p g/ml] 20 pl를 30분간 완전히 흡수시킨 후 37°C에서 16~24시간 동안 배양하였다. 그 후 Gel 조각을 0.1% trifluroacetic add(TFA) 35 μ1에 넣고 60분간 진탕 혼합하여 상층 액을 회수하는 작업을 2회 반복하였고, 회수된 두 상층액을 혼합하여 speed-vac으로 완전히 말려 펩타이드를 추출하였다. 그 후, 0.
0.1% TFA, acetonitrile 혼합액과 0.1% TFA, acetoni trile, 물 혼합액으로 Zip-Tip(Zip-Tip C₁₈, millipore)을세척하였고, 0.1% TFA, 물 혼합액으로 ZipTip을 평형 시킨 후 0.1% TFA 10 ill에 녹인 샘플을 피펫팅으로 빠르게 ZipTip을 통과시켜 resin으로 샘플이 붙게 하였다. 그 후 0.
MALDI-TOF 는 applied biosystems voyager system 4372를 이용하였으며, 모든 결과는 matrix로 alpha-cya- no-4-hydroxycinnamic acid를 이 용해 reflector-positive mode로 얻었다. MALDI-TOF를 통해 얻어진 스펙트럼을 이용하여 MOSCOT program으로 NBCInr에서 database 검색을 실시하였다.
얻었다. MALDI-TOF를 통해 얻어진 스펙트럼을 이용하여 MOSCOT program으로 NBCInr에서 database 검색을 실시하였다.
난포의 발달단계에 따른 돼지난포 과립막 세포의 단백질 패턴을 확인하기 위해 이차원 전기영동을 실시한 후 Melanie 7과 육안 검토를 통해 이미지 분석을 하였다(Fig. 1). 그 중 종속난포에서 보다 우세난포에서 많이 발현된 Spots 7개를 선별하여 MALDI-TOF를 이용해 단백질을 동정하였다.
1). 그 중 종속난포에서 보다 우세난포에서 많이 발현된 Spots 7개를 선별하여 MALDI-TOF를 이용해 단백질을 동정하였다. 그 결과, similar to zinc/ling finger protein 3 precursor(RING finger protein 203), angiomotin, heat shock 60kDa protein l(chaperonin) isoform l(HSP60), si milar to transducin-like enhancer protein 1(TLE1) 및 SH3와 PX domains 2A(SH₃PXD2A)으로 확인되었다(Ta- ble 1).
또한 펩타이드 서열을 확인하기 위해 MALDI- TOF에서 나온 스펨트럼을 이용해 Mascot에서 NCBInr의 database를 검색하였고, score 값을 통해 spot No. 6’과 가장 상응하는 단백질이 TLE1 임을 확인하였다. 이 단백질 spot은 peptide mass mapping을 확인하였을 때 전체 peptide 절편의 15.

대상 데이터

도축 직후의 돼지에서 난소를 회수하여 37°C의 생리식염수에 침적하여 2〜3시간 이내에 실험실로 운반하였다. 난포액은 10 ml 주사기에 18G 주사침을 이용하여 직경 2~4 ㎜의 종속난포와 6~10 ㎜의 우세난포로부터 각각 흡입, 회수하였다.

성능/효과

그 중 종속난포에서 보다 우세난포에서 많이 발현된 Spots 7개를 선별하여 MALDI-TOF를 이용해 단백질을 동정하였다. 그 결과, similar to zinc/ling finger protein 3 precursor(RING finger protein 203), angiomotin, heat shock 60kDa protein l(chaperonin) isoform l(HSP60), si milar to transducin-like enhancer protein 1(TLE1) 및 SH3와 PX domains 2A(SH₃PXD2A)으로 확인되었다(Ta- ble 1).
연구에서 돼지 난소의 난포 직경은 체외성숙 및 수정에 일반적으로 이용되는 미성숙 난자를 포함하는 2~4 ㎜와 난소 내에서 난포의 발달이 이루어져 배란을 준비하는 6〜10 ㎜로 설정하였다. 각각의 난포에서 채취한 과립막 세포의 단백질을 이차원 전기영동을 통해 분리하고 MALDI-TOF를 이용해 동정하여 NCBInr에서 database를 검색한 결과' 우세난포에서 증가하는 경향을 보인 7개 spot들은 similar to zinc/ling finger protein 3 precursor(EJNG finger protein 203), angiomotin, heat 아lock 60kDa protein 1 (chaperonin) isoform l(HSP60)z similar to transducin-like enhancer protein 1(TLE1) 및 SH₃와PX domains 2A(SH₃PXD2A) 단백질로 확인되었다. 이 우세난포에서 증가된 단백질들은 대체적으로 세포 이동과 관련되어 있었다.

후속연구

따라서, 이상의 증가된 단백질들의 난소 내에서 기능에 대한 기존의 보고는 없었지만 연구의 결과로 보아 이 단백질들이 난포의 발육과 연관되어 있는 것으로 생각되며, 앞으로의 연구에서 이 단백질들의 난소 난포 내에서의 기능을 연구해야 할 것이다.

참고문헌 (21)

Buscarlet M, Stifani S (2007): The 'Marx' of Grougho on development and disease. Trends Cell Biol 17:353-361

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Chen G, Courey AJ (2000): Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression. Gene 249:1-16

상세보기
Downs S (1995): The influence of glucose, cumulus cells, and metabolic coupling on ATP levels and metiotic control in the isolated mouse oocyte. Dev Biol 167:502-512

상세보기
Dube JL, Wang P, Elvin J, Lyons KM, Celeste AJ, Matzuk MM (1998): The bone morphogenetic protein 15 gene is X-linked and expressed in oocytes. Mole. Endocrinol. 12:1809-1817

상세보기
Eppig JJ, Wigglesworth K, Pendola F, Hirao Y (1997): Murine oocytes suppress expression of luteinizing hormone receptor messenger rionucleic acid by granulosa cells. Biol Reprod 56:976-984

상세보기
Eppig JJ, Wigglesworth K, Pendola FL (2002): The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development. Proceedings of the National Academy of Science. 99(5):2890-2894

상세보기
Erickson CF, shimasaki S (2001): The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors. Fertil. Steril. 76(5):943-949

상세보기
Fisher AL, Caudy M (1998): Groucho proteins: transcriptional co-repressors for specific subsets of DNA-binding transcription factors in vertebrates and invertebrates. Genes Dev 12:1931-1940

상세보기
Hansen TJ, Bross P, Westergaard M, Nielsen MN, Eiberg H, Borglum AD, Mogensen J, Kristiansen K, Bolund L, Niels G (2003): Genomic structure of the human mitochondrial chaperonin genes: HSP60 and HSP10 are localized head to head on chromosome 2 separated by a bidirectional promoter. Human Genetics 112:71-77

상세보기
Hsueh AJW, McGee EA, Hayashi M, Hsu SY (2000): Hormonal regulation of early follicle development in the rat ovary. Mole Cellular Endocrinol 163:95- 100

상세보기
Joazeiro CA, Weissman AM (2000): Ring finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity. Cell 102: 549-552

상세보기
Koll H, Guiard B, Rassow J, Ostermann J, Horwich A, Neupert W, Hartl FU (1992): Antifolding activeity of HSP60 couples protein import into the mitochondrial matrix with export to the intermembrane space. Cell 68:1163-1175

상세보기
Matzuk MM, Burns KH, Viveiros MM, Eppig JJ (2002): Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science 296:2178-2180

상세보기
Otsuka F, Yao Z, Lee T, Yamamoto S, Erickson GF, Shimasaki S (2000): Bone morphogenetic protein-15. Identification of target cells and biological functions. J Biol Chem 275(50):39523-39528

상세보기
Parkhurst SM (1998): Groucho: making its Marx as a transcriptional co-repressor. Trends Genet 14:130- 132

상세보기
Parrott JA, Skinner MK (1998): Thecal cell granulosa cell interactions involve a positive feedback loop among keratinocyte growth factor, hepatocyte growth factor, and kit ligand during ovarian follicuar development. Endocrinology 139(5):2240-2245

상세보기
Tisdall DJ, Fidler AE, Smith P, Quirke LD, Stent VC, Heath DA, McNatty KP (1999): Stem cell factor and c-kit gene expression and protein localisasion in the sheep ovary during fetal development. J Reprod Dev 116:227-291
Vanderhyden BC (1996): Oocyte-secreted factors granulosa cell steroidogenesis. Zygote. 4:317-321
Vargas-Parada L, Solis C (2003): Heat shock and stress response of Teania solium and T. crassiceps. Parasitology 211:583-588

상세보기
Vittorio C, Cesare M, Agrippino R, Marzia P, Chiara C, Carlo DM, Allan B, Anna M, Giuffrida S (2007): In vivo induction of heat shock proteins in the substantia nigra following L-DOPA administration is associated with increased activity of mitochondrial complex I and nitrosative stress in rat : regulation by glutathione redox state. Journal of Neyrochemistry 101(3):709-717

상세보기
Yoshida H, Takakura H, Kunisada T, Okamura H, Nishikawa S (1997): Step-wise requirement of c-kit tyrosine kinase in mouse ovarian follicle development. Dev Biol 184:122-137

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