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문제 정의
- 본 연구에서는 돼지난소의 난포 발달 동안 난포액으로부터 발현되는 새로운 단백질 인자들에 관하여 연구되었다. 서로 다른 발달 단계를 가진 난포로부터의 난포액에서 발현되는 단백질 윤곽(protein profiles)을 고해상도 2 차원 전기영동과 다양한 분석 장비를 이용해 비교 분석하였다.
- 본 연구는 돼지난소의 난포 발달 단계에 따라 난포액의 크기 별로 난포액의 단백질의 변화를 확인하기 위하여 수행되었다. 연구에서 돼지난소의 난포 직경은 크기별로 1~2 mm, 2—6 nun 및 6~10 mm로 설정하였다.
- 본 연구에서는 난포인자의 중요성과 세포 외 기질의 중요성이 부분적으로 연구되었다. 또한, 포유동물에 서의 난포 형성 과정에서 나타나는 변화가 분자적, 세포적 수준에서 검토되어, 이 연구를 통해서 (1) 난포액 내의 단백질의 확인, ⑵ 난포 크기 별 단백질의 변화, (3) 난포 성장의 세포 외 또는 세포 내 조절에 관련된 인자에 대한 정보를 얻을 수 있었다.
제안 방법
- 서로 다른 발달 단계를 가진 난포로부터의 난포액에서 발현되는 단백질 윤곽(protein profiles)을 고해상도 2 차원 전기영동과 다양한 분석 장비를 이용해 비교 분석하였다.
- 난포의 구분은 발정주기의 단계에 따라 Ireland 등(1980)에 의해 제시된 것처럼 형태적으로 구분하였다. 난포는 크기에 따라 1—2 mm, 2~6 mm, 6~10 mm로나누었으며, 18-gage 주사침이 장착된 일회용 주사기를 이용해 난포액을 흡입하는 방법으로 난자를 회수하여 샘플을 제작하였다. 난포액은 37°C water baih에서 10분간 침지하여 상층액을 회수한 뒤 3, 000 rpm이에서 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
- Clean-up kit(Amereham Biosciences, 80-6484-51, USA) 를 이용해 단백질을 정제하여 Bradford법을 이용하여 총단백질량이 200 iig/ul가 되도록 정량하여 Rehydration buffer(GE Healthcare, 71-S)25-42AE, Sweden)에 녹여 총 250 ill가 되도록 하였다. 이것을 18 cm인 NL 3-11 의 IPG strip(A, ersham Biosdences, 17-1234-01, Sweden) 을이 용하여 20°C에서 16시간 동안 흡수시켰다.
- 이것을 18 cm인 NL 3-11 의 IPG strip(A, ersham Biosdences, 17-1234-01, Sweden) 을이 용하여 20°C에서 16시간 동안 흡수시켰다. Isoelectric Focusing(IEF)는 Protean IEF cell(Bio-Rad)을 이용하여 250 V에서 2시간, 8, 000 V에서 3시간, 8, 000 V에서 60, 000 Vhr까지 채우는 방법으로 시행하였다. IEF가 끝 난 IPG strip을 equalibration buffer[1.
- Gel을건조시키기 위해 1(X)%(ACN)에 5분간 침지한 후, ACN을제거하고 20~30분간 speed-vac하였다.
- 8), promega equendng grade modified trypsin 20 Ug/ml] 20 ul을 30분간 완전히 흡수시킨 후, 37°C 에서 16〜24시간 동안 배양하였다. 그 후, Gel 조각을 0.1% trifluroace- tic add(TFA) 35 µl에 넣고 60분간 진탕 혼합하여 상층 액을 회수하는 작업을 2회 반복하였고, 회수된 두 상층 액을 혼합하여 speed-vac으로 완전히 말려 펩타이드를 추출하였다. 그 흑, 0.
- 0.1% TFA, acetonitrile 혼합액과 0.1% TFA, acetoni trile, 물 혼합액으로 Zip-Tip(Zip-Tip C18, milipore)을세척하였고, 0.1% TFA, 물 혼합액으로 ZipTip을 평형 시킨 후, 0.1% TFA 10 ul에 녹인 샘플을 피펫팅으로 빠르게 Zip-Tip을 통과시켜 resin으로 샘플이 붙게 하였다. 그 후 0.
- 1% TFA 10 ul에 녹인 샘플을 피펫팅으로 빠르게 Zip-Tip을 통과시켜 resin으로 샘플이 붙게 하였다. 그 후 0.1% TFA, 물의 혼합액으로 Zip-Tip을 세척하였고, ZipTip으로부터 샘플을 alpha-cymo^hydroxydnnamic add(0.3% TFA, 50% acetonitrile) 1.8 µl에 용해하여 MAL- DI-TOF에 이용하였다.
- MMLDI-TOF 는 applied biosystems voyager system 4372를 이용하였으며, 모든 결과는 matrix로 alpha-cya- no4-hydroxydriiianiic add를 이용해 reflector-pc^itive mo- de로 얻었다. NALDI-TOF를 통해 얻어진 스펙트럼을 이용하여 MOSCOT program으로 NBCIm에서 database 검색을 실시하였다.
- 얻었다. NALDI-TOF를 통해 얻어진 스펙트럼을 이용하여 MOSCOT program으로 NBCIm에서 database 검색을 실시하였다.
- 난포의 발달 단계에 따른 난포액 내의 단백질 패턴을 확인하기 위해 이차원 전기영동을 실시하였다. 난포의 직경을 1~2 iran, 2~6 nun 및 6~10 nun 난포 크기 별 난포액을 각각 채취하여 동결건조를 통해 농축 후 단백질양을 200 ug/iil로 정량하여 18cm, NL 3~11 IPG ships을이용해 등전첞 전기영동을 실시하였고, 12% aaylamide gel로 SDS-PAGE를 수행하여 Coomassie blue staining 하였다.
- 위해 이차원 전기영동을 실시하였다. 난포의 직경을 1~2 iran, 2~6 nun 및 6~10 nun 난포 크기 별 난포액을 각각 채취하여 동결건조를 통해 농축 후 단백질양을 200 ug/iil로 정량하여 18cm, NL 3~11 IPG ships을이용해 등전첞 전기영동을 실시하였고, 12% aaylamide gel로 SDS-PAGE를 수행하여 Coomassie blue staining 하였다. 이미지 분석은 Melanie 7과 육안 검토를 통해 spo- ts을 분석하였다.
- 6~10 mm에서 발견된 spot 8개는 다른 난포 직경에서 나타났으나 재현성을 보이지 않고 오로지 6~10 mm 직경의 난포에서만 재현성을 보였다. 그 중 2~6 mm에서만 나타난 1개의 28 spot과 6~10 mm에서만 나타난 5개의 29, 30, 31, 32 및 33 spot을 MALDI- TOF를 이용해 단백질을 동정하였다.
- 또한, 펩타이드 서열을 확인하기 위해 MALDI-TOF에서 나온 스펙트럼을 이용해 Mascot에서 NCBI의 Databa se 를 검색하였다(Fig. 2).
대상 데이터
- 도축장에서 회수한 임의의 발정주기를 가진 돼지의 난소를 생리식염수(Nad, 0.9% w/v; penidlline 100U/ml; streptomycin 1(X) µg/ml 및 Amphoieridn B 2.5 µg/ml) 내에서 25〜30莒로 유지하여 실험실로 운반하였다. 생리식염수로 수 차례 세척한 후, 선택된 난소들은 70% (v/v) ethanol에서 세척한 다음 수집배양액(collection medium; penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 pg/ml, ampho tericin B 2.
- 1 에서와 같이 동일 spot 27개를 확인하였고, 2~6 mm에서만 나타난 spot 1개와 6—10 min에서만 *.타난 spot 5개를 선별하였다. 6~10 mm에서 발견된 spot 8개는 다른 난포 직경에서 나타났으나 재현성을 보이지 않고 오로지 6~10 mm 직경의 난포에서만 재현성을 보였다.
데이터처리
- 난포의 직경을 1~2 iran, 2~6 nun 및 6~10 nun 난포 크기 별 난포액을 각각 채취하여 동결건조를 통해 농축 후 단백질양을 200 ug/iil로 정량하여 18cm, NL 3~11 IPG ships을이용해 등전첞 전기영동을 실시하였고, 12% aaylamide gel로 SDS-PAGE를 수행하여 Coomassie blue staining 하였다. 이미지 분석은 Melanie 7과 육안 검토를 통해 spo- ts을 분석하였다.
이론/모형
- SDS- PAGE는 12% aaylamide gel 에 IPG strip을 sample로 이용하여 150 V에서 10분간, 50 mA에서 6시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 CBB 염색법을 이용하여 염색한 후 이미지 분석 프로그램인 Melanie 7로 spots를 분석하고 육안으로 검토하였다.
성능/효과
- 그 결과, 2~6 mm 난포에서만 나타난 28번 spot은 MALDI-TOF 분석 결과, 면역 단백질 Ig lambda chain C region로 확인되었다(Table 1). 6~10 nun 크기의 난포에서 채취한 난포액 내 단백질에만 존재했었던 spot인 29, 30, 31, 32 및 33 등은 32와 33이 동일한 단백질로 Apo lipoprotein A-IV(APOA4)으로 확인되었으며, 나머지 29 에서 31번의 단백질은 MALDI-TOF 분석 과정에서 추출된 peptide의 양이 부족하여 분석에 실패하였다.
- 연구에서 돼지난소의 난포 직경은 크기별로 1~2 mm, 2—6 nun 및 6~10 mm로 설정하였다. 난포 크기 별 난포액 내 단백질의 변화를 이차원 전기영동을 통해 단백질을 분리하고 MALDI-TOF를 이용해 동정한 결과 1〜2 mm 크기의 난포액 내의 단백질 spot들은 다른 크기의 난포액에서도 모두 존재하였으며, 2〜6 mm 크기에서는 면역 도메인 단백질로 알려진 Ig lambda chain C region이 분비되는 것을 확인하였고, 6~10 nun 난포액에서는 APOA47} 발견되었다. Table 1에서와 같이 Ig lambda chain C region, Apolipoprotein A-IV 단백질 등이 난포 크기가 증가함에 따라 새롭게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 이와 같은 사실은 난포 크기 성장과 배란에 있어서 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬 분비에 있어서 전구체인 콜레스테롤 분비 자극과 연관이 있을 것으로 생각된다. 본 연구를 통하여 난포 크기 별 난포액 내 단백질의 변화로 보면 난포 크기가 커짐에 따라 난포액 내 단백질 종류가 증가되는것을 확인할 수 있었다.
- 부분적으로 연구되었다. 또한, 포유동물에 서의 난포 형성 과정에서 나타나는 변화가 분자적, 세포적 수준에서 검토되어, 이 연구를 통해서 (1) 난포액 내의 단백질의 확인, ⑵ 난포 크기 별 단백질의 변화, (3) 난포 성장의 세포 외 또는 세포 내 조절에 관련된 인자에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 한편, 연구를 통해 얻어진 정보는 난포 성장을 동기화시키거나 과배란 반응을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- 확인되었다(Table 1). 6~10 nun 크기의 난포에서 채취한 난포액 내 단백질에만 존재했었던 spot인 29, 30, 31, 32 및 33 등은 32와 33이 동일한 단백질로 Apo lipoprotein A-IV(APOA4)으로 확인되었으며, 나머지 29 에서 31번의 단백질은 MALDI-TOF 분석 과정에서 추출된 peptide의 양이 부족하여 분석에 실패하였다.
후속연구
- 또한, 포유동물에 서의 난포 형성 과정에서 나타나는 변화가 분자적, 세포적 수준에서 검토되어, 이 연구를 통해서 (1) 난포액 내의 단백질의 확인, ⑵ 난포 크기 별 단백질의 변화, (3) 난포 성장의 세포 외 또는 세포 내 조절에 관련된 인자에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 한편, 연구를 통해 얻어진 정보는 난포 성장을 동기화시키거나 과배란 반응을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 연구결과는 인간을 포함한 다양한 포유동물에서 무배란성 불임 (anovulatory infertility)을이해하고 극복할 수 있게 할 것이며, 배란을 촉진 시 키는 더욱 생리적이고 효과적인 방법을 디자인하는데 도움을 줄 것으로 예상되며, 포유동물의 난포 및 난자의 발달과 배란율을 조절할 수 있는 전략적 메카니즘을 규명하는데 기초자료로 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
- 한편, 연구를 통해 얻어진 정보는 난포 성장을 동기화시키거나 과배란 반응을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 연구결과는 인간을 포함한 다양한 포유동물에서 무배란성 불임 (anovulatory infertility)을이해하고 극복할 수 있게 할 것이며, 배란을 촉진 시 키는 더욱 생리적이고 효과적인 방법을 디자인하는데 도움을 줄 것으로 예상되며, 포유동물의 난포 및 난자의 발달과 배란율을 조절할 수 있는 전략적 메카니즘을 규명하는데 기초자료로 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
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