고체상 합성법에 의해 합성된 N-(3-hydroxysulfonyl)-L-homoserine Lactone 유사체들의 Vibrio harveyi 쿼럼 센싱에 대한 저해 효과 Solid Phase Synthesis of N-(3-hydroxysulfonyl)-L-homoserine Lactone Derivatives and their Inhibitory Effects on Quorum Sensing Regulation in Vibrio harveyi원문보기
Vibrio harveyi 쿼럼 센싱 (quorum sensing; QS) 신호전달에 대한 저해제들이 주 신호물질인 N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone(3-OH-$C_4$-HSL)의 분자 구조를 변형함에 의해 개발되었다. 일련의 구조 변형체들인 N-(3-hyoxysulfonyl)-L-homoserine lactones(HSHLs)들은 고체상 유기합성법 (solid-phase organic synthesis method)으로 합성되었다. 이 물질들의 생체내 쿼럼 센싱 저해능이 V. harveyi 발광을 이용한 bloassay를 system에 의해 측정되었을 때, 모두 의미있는 저해효과를 보여주었다. 이 물질들과 3-OH-$C_4$-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다. 이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-$C_4$-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다. 이렇게 모델링을 통해 얻어진 결과와 생체 내 bioassay를 통해 얻어진 결과의 비교를 통해, 수용체 단백질과 그 리간드 사이의 상호 작용에 관한 in silica 해석이 특히 단백질의 삼차 구조에 대한 정보가 제한적인 경우에 보다 나은 저해제 개발을 위한 유용한 방법이 될 수 있음을 제안한다.
Vibrio harveyi 쿼럼 센싱 (quorum sensing; QS) 신호전달에 대한 저해제들이 주 신호물질인 N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone(3-OH-$C_4$-HSL)의 분자 구조를 변형함에 의해 개발되었다. 일련의 구조 변형체들인 N-(3-hyoxysulfonyl)-L-homoserine lactones(HSHLs)들은 고체상 유기합성법 (solid-phase organic synthesis method)으로 합성되었다. 이 물질들의 생체내 쿼럼 센싱 저해능이 V. harveyi 발광을 이용한 bloassay를 system에 의해 측정되었을 때, 모두 의미있는 저해효과를 보여주었다. 이 물질들과 3-OH-$C_4$-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다. 이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-$C_4$-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다. 이렇게 모델링을 통해 얻어진 결과와 생체 내 bioassay를 통해 얻어진 결과의 비교를 통해, 수용체 단백질과 그 리간드 사이의 상호 작용에 관한 in silica 해석이 특히 단백질의 삼차 구조에 대한 정보가 제한적인 경우에 보다 나은 저해제 개발을 위한 유용한 방법이 될 수 있음을 제안한다.
The inhibitors against Vibrio harveyi quorum sensing (QS) signaling were developed by modifying the molecular structure of the major signal, N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone (3-OH-$C_4$-HSL). A series of structural derivatives, N-(3-hydroxysulfonyl)-L-homoserine lactones (HSHLs) w...
The inhibitors against Vibrio harveyi quorum sensing (QS) signaling were developed by modifying the molecular structure of the major signal, N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone (3-OH-$C_4$-HSL). A series of structural derivatives, N-(3-hydroxysulfonyl)-L-homoserine lactones (HSHLs) were synthesized by the solid-phase organic synthesis method. The in vivo QS inhibition by these compounds was measured by a bioassay system using the V. harveyi bioluminescence, and all showed significant inhibitory effects. To analyze the interaction between these compounds and LuxN, a 3-OH-$C_4$-HSL receptor protein of V. harveyi, we tentatively determined the putative signal binding domain of LuxN based on the sequence homology with other acyl-HSL binding proteins, and predicted the partial 3-D structure of the putative signal binding domain of LuxN by using ORCHESTRA program, and further estimated the binding poses and energies (docking scores) of 3-OH-$C_4$-HSL and HSHLs within the domain. In comparison of the result from this modeling study with that of in vivo bioassay, we suggest that the in silica interpretation of the interaction between ligands and their receptor proteins can be a valuable way to develop better competitive inhibitors, especially in the case that the structural information of the protein is limited.
The inhibitors against Vibrio harveyi quorum sensing (QS) signaling were developed by modifying the molecular structure of the major signal, N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone (3-OH-$C_4$-HSL). A series of structural derivatives, N-(3-hydroxysulfonyl)-L-homoserine lactones (HSHLs) were synthesized by the solid-phase organic synthesis method. The in vivo QS inhibition by these compounds was measured by a bioassay system using the V. harveyi bioluminescence, and all showed significant inhibitory effects. To analyze the interaction between these compounds and LuxN, a 3-OH-$C_4$-HSL receptor protein of V. harveyi, we tentatively determined the putative signal binding domain of LuxN based on the sequence homology with other acyl-HSL binding proteins, and predicted the partial 3-D structure of the putative signal binding domain of LuxN by using ORCHESTRA program, and further estimated the binding poses and energies (docking scores) of 3-OH-$C_4$-HSL and HSHLs within the domain. In comparison of the result from this modeling study with that of in vivo bioassay, we suggest that the in silica interpretation of the interaction between ligands and their receptor proteins can be a valuable way to develop better competitive inhibitors, especially in the case that the structural information of the protein is limited.
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문제 정의
3. In vivo QS inhibition by compounds synthesized in this study. The luminescence induced by 1 μM 3-OH-C4-HSL was set to 100% and the reduced levels of luminescence by adding the compounds were relatively presented in percentage.
본 연구에서는 3-OH-C4-HSL의 분자 구조를 변형함에 의해 가능성 있는 V harveri^ QS 저해제들을 탐색하고자 하였다. 이를 위해 3-OH-C4-HSL의 lactone head 부분과 hydroxybutanoyl tail 부분을 연결하는 carboxamide 결합 부위를 고체상 합성법 (solid phase synthesis method)을 이용해 sulfonamide 결합으로 변형하여 M3-hydroxysulfonyl-L-HSL 을 제조하고, 이를 더욱 다양하게 변형하였다.
본 연구에서는 V harveyi QS에 대한 새로운 저해제를 개발하기 위하여, body 부분이 sulfonamide 결합으로 변형되고, 다양한 구조의 tail 부분 치환기를 가지는 화합물들을 고체상 유기합성법으로 합성한 후, 이들 화합물들의 실제 in vivo QS 저해 효과를 측정하고, 또한 수용체 단백질인 LuxN 의 추정 신호결합 부위와의 결합 형태 및 에너지를 in silico 모델링을 통해 분석하였다. 이렇게 모델링으로 예측한 결합구조를 바탕으로 각 화합물이 가지는 서로 다른 저해능을 설명하고자 하였다.
수행하였다. 우선 공통적으로 존재하는 lactone head와 sulfonamide bond body가 신호 결합부위의 극성 아미노산 잔기들과 수소결합을 형성하는지 여부와, 다양한 tail 부분 치환기들이 소수성이 강한 large pocket에 적절히 위치할 수 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과, Table 3과 Fig.
그러나, 세균 QS 저해제 개발을 위한 지속적, 선도적 연구의 일환으로, 본 연구에서는 LasR, TraR과 LuxN의부분적 아미노산 서열 유사성으로부터 LuxN의 신호 결합 부위를 추정하고, 그 부위의 부분적 삼차구조를 기반으로 in silico 모델링을 수행하여 리간드-LuxN 간의 상호작용과 그 결합 형태 및 에너지를 분석하는 새로운 시도를 수행하였다. 이러한 방법은 이전에 시도된 바가 없으나, 본 연구팀은 acyl- HSL 구조와 in silico 모델링에 기반한 QS 저해제 개발에 대한 이전의 연구 경험으로부터, 아직 삼차 구조가 알려지지 않은 수용체 단백질에 대한 상호작용 연구라는 새로운 시범적인 시도로써 본 연구를 수행하였다. 본 연구에서 시도된 모든 화합물들이 in vivo 에서 의미있는 QS 저해력을 보여주었다는 점에서, 이러한 모델링 연구가 특히 수용체 단백질의 삼차구조 정보-가 제한적인 경우에 보다 나은 경쟁적 저해제의 개발에 가치있는 방법이라고 할 수 있을 것이다.
통해 분석하였다. 이렇게 모델링으로 예측한 결합구조를 바탕으로 각 화합물이 가지는 서로 다른 저해능을 설명하고자 하였다. 본 연구에서 시도된 모든 화합물들은, 원신호 물질인 3-OH-C4-HSL보다 LuxN의 추정 신호 결합 부위에 더 적합한 자세로 결합할 수 있어, 더 나은 결합에너지를 보여주었으며, 실제로 in V机세서도 좋은 저해력을 보여주었다, 이는 모델링으로 얻어진 결합에너지(Table 2)와 in vivo 저해력 (Fig.
가설 설정
각각 Pseudomonas aeruginosa와 Agrobacterium tumefa- ciens의 QS 수용체 단백질들인 LasR과 TraR 신호 결합부 41 (signal binding domain)의 아미노산 서열을 LuxN 서열과 비교하여, LasR과 TraR의 신호 결합부위와 부분적으로 잘 보존된 부분을 LuxN의 신호 결합부위로 가정하고 이를 모델링 연구에 사용하였다(Fig. 2). 이 추정 신호 결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA 프로그램으로 예측하여[20], 이를 기반으로 FlexX 프로그램을 통해 Fig.
제안 방법
3-OH-C4-HSL에 반응하여 발광을 하는 V. harveri strain BB886을 report strain으로 하여, 3-OH-C4-HSL에 대한 발광 정도를 측정함으로써 QS 저해를 정량적으로 측정하였다. V.
그러나 3-OH-C4-HSL이 acyl-HSL이라는 점에서 , LuxN의 3-OH-C4-HSL 결합 부위가 LasR이나 TraR과 같은 acyl-HSL 수용체 단백질들의 acyl-HSL 결합 부위와 부분적으로 유사할 것이라고 예상할 수 있었다. LasR 과 TraR의 acyl-HSL 결합 부위가 이미 알려져 있기 때문에, LuxN의 아미노산 서열을 LasR과 TraR의 acyl-HSL 결합 부위와 서로 비교해 보았을 때, 부분적으로 보존된 부위를 발견할 수 있었으므로(Fig. 2), 이 부위를 LuxN의 3-OH-C4- HSL 결합부위로 추정하였다. 이 부위는 N-말단의 세포막 결합 부위 (from 1st to 301st amino acid)와 C-말단 kinase 부위 (from 459th to 679th amino acid) 사이에 있는 400*~ 460th 아미노산 사이에 위치한다[8].
선 결정학적 연구로부터 이들 단백질들의 신호 결합부위의 삼차구조에 대한 정보를 얻을 수 있었으나[3, 27], V harveyi^ LuxN의 경우는 이러한 삼차 구조가 보고된 바 없고, LuxN이 TraR이나 LasR과는 다른 형태의 막 단백질이기 때문에, 리간드-LuxN간 상호작용분석을 위한 믿을 수 있는 in silico 모델을 얻기가 매우 어려웠다. 그러나, 세균 QS 저해제 개발을 위한 지속적, 선도적 연구의 일환으로, 본 연구에서는 LasR, TraR과 LuxN의부분적 아미노산 서열 유사성으로부터 LuxN의 신호 결합 부위를 추정하고, 그 부위의 부분적 삼차구조를 기반으로 in silico 모델링을 수행하여 리간드-LuxN 간의 상호작용과 그 결합 형태 및 에너지를 분석하는 새로운 시도를 수행하였다. 이러한 방법은 이전에 시도된 바가 없으나, 본 연구팀은 acyl- HSL 구조와 in silico 모델링에 기반한 QS 저해제 개발에 대한 이전의 연구 경험으로부터, 아직 삼차 구조가 알려지지 않은 수용체 단백질에 대한 상호작용 연구라는 새로운 시범적인 시도로써 본 연구를 수행하였다.
1 μM 3-OH-C4-HSL과 8개의 저해제 물질들을 그림에 표시된 농도로 첨가하고, 30°C에서 더 배양하였다. 발광과 세포 밀도(optical densities; OD)를 각각 lurmnometer(Thermo Electron Co)와 spectrophotometer(HP8452A, Hewlett- Packard)로 600nm에서 측정한 후, 여러 다른 연구에서처럼 luminescence의 강도를 OD600 값으로 표준화한 lumines- cence/OD6oo(RLU, relative light units)로 표시하였다[1, 21].
비슷한 방식으로 새로이 합성한 화합물들을 가지고 FlexX 모델링을 수행하였다. 우선 공통적으로 존재하는 lactone head와 sulfonamide bond body가 신호 결합부위의 극성 아미노산 잔기들과 수소결합을 형성하는지 여부와, 다양한 tail 부분 치환기들이 소수성이 강한 large pocket에 적절히 위치할 수 있는지 여부를 조사하였다.
이 부위는 N-말단의 세포막 결합 부위 (from 1st to 301st amino acid)와 C-말단 kinase 부위 (from 459th to 679th amino acid) 사이에 있는 400*~ 460th 아미노산 사이에 위치한다[8]. 우리는 이 위치의 부분적 아미노산 서열을 가지고, ORCHESTRA 프로그램을 사용하여 in silico 모델링을 통해 부분적 삼차구조를 예측하였다.
1에 제시된 모든 8개의 저해제 물질들을 리간드로 한 결합 분석을 in 玖力2에서 수행하였다[12]. 우선 SYBYL의 sketch module을 사용하여 이들을 결합 형태를 초안한 후[2이, RMS(root mean square) gradient를 0.05 이하까지 Gasteiger-Hiickel charge로 Tripos force Reid를 사용하여 최소화하였다[5, 18]. 이러한 FlexX 결합 분석은 run-multiple ligand option을 가지고 수행되었으며, 가능한 결합 형태들 중에서 LuxN의 신호 결합부위에 적절하게 잘 맞는 형태를 최상의 복합제 구조로 선택하여, 이 구조속에서 결합에너지 (docking energy)를 계산하였다(Table 2).
이물질들의 생체내 쿼럼 센싱 저해능이 V harveyi 발광을 이용한 bioassay를 system에 의해 측정되었을 때 , 모두 의미 있는 저해효과를 보여주었다. 이 물질들과 3-OH-C4-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다. 이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program 을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-C4-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다.
2). 이 추정 신호 결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA 프로그램으로 예측하여[20], 이를 기반으로 FlexX 프로그램을 통해 Fig. 1에 제시된 모든 8개의 저해제 물질들을 리간드로 한 결합 분석을 in 玖力2에서 수행하였다[12]. 우선 SYBYL의 sketch module을 사용하여 이들을 결합 형태를 초안한 후[2이, RMS(root mean square) gradient를 0.
이 물질들과 3-OH-C4-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다. 이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program 을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-C4-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다. 이렇게 모델링을 통해 얻어진 결과와 생체 내 bioassay를 통해 얻어진 결과의 비교를 통해, 수용체 단백질과 그리간드 사이의 상호작용에 관한 in silico 해석이 특히 단백질의 삼차 구조에 대한 정보가 제한적인 경우에 보다 나은 저해제 개발을 위한 유용한 방법이 될 수 있음을 제안한다.
이를 위해 3-OH-C4-HSL의 lactone head 부분과 hydroxybutanoyl tail 부분을 연결하는 carboxamide 결합 부위를 고체상 합성법 (solid phase synthesis method)을 이용해 sulfonamide 결합으로 변형하여 M3-hydroxysulfonyl-L-HSL 을 제조하고, 이를 더욱 다양하게 변형하였다. 이들 변형체들과 3-OH-C4-HSL 수용체인 LuxN과의 상호작용의 형태와 그 결합에너지를 예측해 보기 위해, 비록 LuxN의 삼차 구조가 아직 알려지지 않았지만 다른 acyl-HSL 수용 단백질들과의 부분적 인 유사성으로부터 신호결합부위를 추정하여 , 그 추정 부위와 QS 저해 후보물질들간의 상호작용을 in Meo에서 모델링 하였다. 이 결과들을 in vivo 에서 측정된 V.
05 이하까지 Gasteiger-Hiickel charge로 Tripos force Reid를 사용하여 최소화하였다[5, 18]. 이러한 FlexX 결합 분석은 run-multiple ligand option을 가지고 수행되었으며, 가능한 결합 형태들 중에서 LuxN의 신호 결합부위에 적절하게 잘 맞는 형태를 최상의 복합제 구조로 선택하여, 이 구조속에서 결합에너지 (docking energy)를 계산하였다(Table 2).
이를 위해 3-OH-C4-HSL의 lactone head 부분과 hydroxybutanoyl tail 부분을 연결하는 carboxamide 결합 부위를 고체상 합성법 (solid phase synthesis method)을 이용해 sulfonamide 결합으로 변형하여 M3-hydroxysulfonyl-L-HSL 을 제조하고, 이를 더욱 다양하게 변형하였다. 이들 변형체들과 3-OH-C4-HSL 수용체인 LuxN과의 상호작용의 형태와 그 결합에너지를 예측해 보기 위해, 비록 LuxN의 삼차 구조가 아직 알려지지 않았지만 다른 acyl-HSL 수용 단백질들과의 부분적 인 유사성으로부터 신호결합부위를 추정하여 , 그 추정 부위와 QS 저해 후보물질들간의 상호작용을 in Meo에서 모델링 하였다.
이론/모형
고체상 유기 합성법 (solid phase organic synthesis method) 으로 8개의 N-3-hydroxysulfonyl-L-HSL 유도체를 합성하였다. 선행연구에서 사용된 방법에 따라, Fig.
5에서 보이는 것처럼, 1) 세번째 탄소의 수산기 산소가 Gln415와 함께 수소결합을 형성한다는 점. 2) tail 부분이 large pocket의 아미노산 잔기들과 소수성 상호작용을 한다는 점 등의 공통점이 관찰되었다. 한편 large pocket 이 좁고 깊은 모양을 가지고 있기 때문에, 그룹 A 화합물들의 tail 부분에 있는 환형 치환기들은 공간적 방해를 피하기위해 large pocket에 수직으로 위치한다.
그 결과, Table 3과 Fig. 5, 6에서 보여지는 것처럼, 1) 모든 화합물의 lacton head가 logP 값으로부터 예상된 바 대로 small pocket 안에 존재하면서 2개의 수소결합(lactone 환 산소 및 carbonyl 산소와 Gln479 사이에)을 형성한다는 것, 2) sulfonamide body가 Asn475와 수소결합을 형성한다는 것, 3) tail 부분들은 대체로 소수성 pocke에 적절히 들어갈 수 있다는 것 등을 확인할 수 있었다. 이러한 결합 형태에서는 Table 3에서 보이 듯이 , head와 body 부분에서 형성된 수소결합의 방향과 거리가 모든 화합물에서 거의 같기 때문에, 결합에너지는 large pocket에 tail 부분이 결합하는 특성에 의해 주로 결정되는 것으로 보인다.
Fig. 1에 제시된 새로운 8개의 화합물들이 원 신호물질인 3-OH-C4-HSL과 경쟁하여 QS을 저해하는지 알아보고자, reporter strain인 V. harveyi BB886을 이용하여 in vivo에서 활성을 측정하였을 때 , 모두 lux 오페론의 발현을 억제하는 것이 관찰되었다(Fig. 3). 1 [iM의 3-OH-C4-HSL를 각각 1 HM, 5 μM, 10 jxM의 합성 화합물과 동시에 처리했을 때, 농도가 높아짐에 따라 발광이 현저히 감소하였다.
그러므로, LuxN 의 삼차구조가 아직 밝혀지지 않았음에도 불구하고 다른 LuxR-type 수용체 단백질과는 많이 다른 구조를 가질 것이라고 추정할 수 있다. 그러나 3-OH-C4-HSL이 acyl-HSL이라는 점에서 , LuxN의 3-OH-C4-HSL 결합 부위가 LasR이나 TraR과 같은 acyl-HSL 수용체 단백질들의 acyl-HSL 결합 부위와 부분적으로 유사할 것이라고 예상할 수 있었다. LasR 과 TraR의 acyl-HSL 결합 부위가 이미 알려져 있기 때문에, LuxN의 아미노산 서열을 LasR과 TraR의 acyl-HSL 결합 부위와 서로 비교해 보았을 때, 부분적으로 보존된 부위를 발견할 수 있었으므로(Fig.
4 와 5를 비교해 보면, 그룹 A 화합물들의 head는 3- OH-C4-HSL의 head와는small pocket안에서 다른 방향으로 위치하고 있음을 알 수 있다. 또한 Sulfonamide body에서의 수소결합 형성 이 lactone head에서 형성되는 2개의 수소결합과 large pocke에서의 소수성 상호작용을 확실하게 해 주기 때문에, 그룹 A 화합물들의 결합에너지가 원 신호물질인 3-OH-C4-HSI의 결합에너지보다도 더 좋게 나옴을 알 수 있다. 이들 그룹 A 화합물들 중, 6c의 tail 부분은 large pocket 에서의 logP 값이 비교적 좋지 않았지만(LogP=-0.
1과 Table 1에 보여지는 방법과 순서로 합성하였다[13, 16]. 모든 합성물은 aminomethyl polystyrene(AM PS) resin으로부터 63%에서 73%의 수율로 추출하였다[6a(70%), 6b(72%), 6c(64%), 6d (73%), 6e(71%), 6f(70%), 6g(63%)], 6h(67%), AI(73%)]. 합성된 화합물의 화학구조는 GC/MS 분석법 (Micromass Autospec-Ultima OA TOF GC/MS, UK)[11] 과 ^-NMR spectroscopy로 확인하였다(Bruker Avance 400 WB, DSX- 400, Germany) [28].
이렇게 모델링으로 예측한 결합구조를 바탕으로 각 화합물이 가지는 서로 다른 저해능을 설명하고자 하였다. 본 연구에서 시도된 모든 화합물들은, 원신호 물질인 3-OH-C4-HSL보다 LuxN의 추정 신호 결합 부위에 더 적합한 자세로 결합할 수 있어, 더 나은 결합에너지를 보여주었으며, 실제로 in V机세서도 좋은 저해력을 보여주었다, 이는 모델링으로 얻어진 결합에너지(Table 2)와 in vivo 저해력 (Fig. 3) 사이에 일정 정도 상관관계가 있음을 의미한다.
이러한 방법은 이전에 시도된 바가 없으나, 본 연구팀은 acyl- HSL 구조와 in silico 모델링에 기반한 QS 저해제 개발에 대한 이전의 연구 경험으로부터, 아직 삼차 구조가 알려지지 않은 수용체 단백질에 대한 상호작용 연구라는 새로운 시범적인 시도로써 본 연구를 수행하였다. 본 연구에서 시도된 모든 화합물들이 in vivo 에서 의미있는 QS 저해력을 보여주었다는 점에서, 이러한 모델링 연구가 특히 수용체 단백질의 삼차구조 정보-가 제한적인 경우에 보다 나은 경쟁적 저해제의 개발에 가치있는 방법이라고 할 수 있을 것이다.
이들 변형체들과 3-OH-C4-HSL 수용체인 LuxN과의 상호작용의 형태와 그 결합에너지를 예측해 보기 위해, 비록 LuxN의 삼차 구조가 아직 알려지지 않았지만 다른 acyl-HSL 수용 단백질들과의 부분적 인 유사성으로부터 신호결합부위를 추정하여 , 그 추정 부위와 QS 저해 후보물질들간의 상호작용을 in Meo에서 모델링 하였다. 이 결과들을 in vivo 에서 측정된 V. harveyi QS 저해 활성과 비교하여, 이러한 in silico 모델링이 보다 나은 QS 저해제의 개발에 유용하게 응용될 수 있음을 확인하였다.
일련의 구조 변형체들인 N-(3-hydroxysulfonyl)- L-homoserine lactones(HSHLs)들은 고체상 유기합성법 (solid-phase organic synthesis method)으로 합성되었다. 이물질들의 생체내 쿼럼 센싱 저해능이 V harveyi 발광을 이용한 bioassay를 system에 의해 측정되었을 때 , 모두 의미 있는 저해효과를 보여주었다. 이 물질들과 3-OH-C4-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다.
75 kcal/mol였으며 , 결합 형태에는 다음의 두 가지 특징이 예측되었다. 첫째, lacton head와 carboxamide bond body는 logP value(0.277, Table 1)로부터 추론하였을 때, small pocket의 약한 소수성 부위에 위치해 있고, 주변의 아미노산잔기들과 3개의 수소결합(lactone head의 carbonyl oxygen과 Gln479의 질소사이에, 그리고 amide bond의 carbonyl oxygen과 Asn475 사이에, 그리고 수산기와 Pro476 사이에) 을 형성한다는 점, 둘째 , acyl tail 부분은 large pocket의 강한 소수성 부위를 향하고 있어, 주위 아미노산 잔기들과의수소결합 및 소수성 결합은 최대화하고, 반대로 공간적 상충은 최소화하고 있다는 점이다. 그러나 수산기와 Pro476 사이의 수소결합은 수산기의 크기와 친수성 때문에 acyl tail 이 large pocket에 결합하는 것을 방해하여, 3-OH-C4^HSL 의 결합력을 낮추고 있다.
harvery의 lux operon 발현이 QS 의 조절을 받는다는 점에서, 이 결과는 본 실험에서 합성된 화합물이 V harveyiS] QS를 특이적으로 저해하였음을 보여준다. 화합물들 중에서 6d, 6e 그리고 6h가 가장 강한 저해 효과를 보여 주었으며, 6a와 6b는 고농도에서만 저해 효과를 보여주었다(Fig. 3). 이들 화합물들이 3-OH-C4-HSL와 크기와 구조가 비슷하다는 점에서, 이들 화합물들이 수용체 단 백질인 LuxN에 3-OH-C4-HSL과 경쟁적으로 결합함에 의해 QS를 저해한 것으로 판단된다.
후속연구
이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program 을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-C4-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다. 이렇게 모델링을 통해 얻어진 결과와 생체 내 bioassay를 통해 얻어진 결과의 비교를 통해, 수용체 단백질과 그리간드 사이의 상호작용에 관한 in silico 해석이 특히 단백질의 삼차 구조에 대한 정보가 제한적인 경우에 보다 나은 저해제 개발을 위한 유용한 방법이 될 수 있음을 제안한다.
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