MSPD와 HPLC를 이용한 돼지고기 및 광어 중의 테트라싸이클린계 항생제와 sulfonamide의 다성분 잔류분석법 개발 Simultaneous Determination of Tetracyclines and Sulfonamides Residues in Pork and Flatfish Using Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) Extraction and HPLC원문보기
HPLC를 이용한 분석은 항균, 항생제의 정량분석에 있어 가장 널리 이용되고 있으며, 최근에 개발된 MSPD방법은 고정상을 직접 갈아서 추출, 정제하는 방법으로 전처리 시 그조작이 간단하며, 유기용매가 적게 들고 전처리 시간이 짧다는 장점이 있다. 본 연구는 HPLC와 MSPD방법을 이용하여 가축 중 소비량이 가장 많은 돼지고기와 생선 중 회로 가장 많이 소비되는 광어에 대하여, 식품 중 잔류 가능성이 높은 tetracycline계 항생제 3종(oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline)과 sulfonamide(sulfadimethoxine, sulfamerazine, sulfamethazine, slfaquinoxaline, sulfamonomethoxine) 5종의 동시분석방법을 개발코자 하였다. HPLC의 최적 분석조건으로 파장은 tetracycline계 항생물질은 360 nm에서 sulfonamide는 270 nm였으며, 이동상은 TC와 SMR이 분리되는 시점인 15분까지는 pH 4.5, oxalic acid : acetonitrile (78.5 : 21.5, v/v)로 분석하고 이후 30분까지는 pH 6.1, oxalic acid : acetonitrile (78.5 : 21.5, v/v)로 분석을 실시하였을 때 기존의 실험방법보다 피크의 분리도와 검출한계의 개선이 이루어졌으며 이를 토대로 8가지 성분의 MRLs인 $0.1{\sim}0.2mg{\cdot}kg^{-1}$까지 충분히 분석이 가능하였다. MSPD 적용을 위한 시료의 전처리 방법개선은 기존의 0.5 g으로 제한된 시료량을 3 g으로 늘릴 수 있었고 dichloromethane 20 mL와 methanol 20 mL로 연속적으로 8가지 성분을 동시에 용출시켜 sulfonamide는 $80.25{\sim}101.25%$, tetracycline계 항생물질은 $85.77{\sim}121.42%$의 회수율을 얻을 수 있었다.
HPLC를 이용한 분석은 항균, 항생제의 정량분석에 있어 가장 널리 이용되고 있으며, 최근에 개발된 MSPD방법은 고정상을 직접 갈아서 추출, 정제하는 방법으로 전처리 시 그조작이 간단하며, 유기용매가 적게 들고 전처리 시간이 짧다는 장점이 있다. 본 연구는 HPLC와 MSPD방법을 이용하여 가축 중 소비량이 가장 많은 돼지고기와 생선 중 회로 가장 많이 소비되는 광어에 대하여, 식품 중 잔류 가능성이 높은 tetracycline계 항생제 3종(oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline)과 sulfonamide(sulfadimethoxine, sulfamerazine, sulfamethazine, slfaquinoxaline, sulfamonomethoxine) 5종의 동시분석방법을 개발코자 하였다. HPLC의 최적 분석조건으로 파장은 tetracycline계 항생물질은 360 nm에서 sulfonamide는 270 nm였으며, 이동상은 TC와 SMR이 분리되는 시점인 15분까지는 pH 4.5, oxalic acid : acetonitrile (78.5 : 21.5, v/v)로 분석하고 이후 30분까지는 pH 6.1, oxalic acid : acetonitrile (78.5 : 21.5, v/v)로 분석을 실시하였을 때 기존의 실험방법보다 피크의 분리도와 검출한계의 개선이 이루어졌으며 이를 토대로 8가지 성분의 MRLs인 $0.1{\sim}0.2mg{\cdot}kg^{-1}$까지 충분히 분석이 가능하였다. MSPD 적용을 위한 시료의 전처리 방법개선은 기존의 0.5 g으로 제한된 시료량을 3 g으로 늘릴 수 있었고 dichloromethane 20 mL와 methanol 20 mL로 연속적으로 8가지 성분을 동시에 용출시켜 sulfonamide는 $80.25{\sim}101.25%$, tetracycline계 항생물질은 $85.77{\sim}121.42%$의 회수율을 얻을 수 있었다.
This study was conducted to develop more convenient simultaneous determination method by matrix solid phase dispersion (MSPD) and HPLC for sulfonamides such as sulfamerazine (SMR), sulfamethazine (SMT), sulfamonomethoxine (SMM), sulfadimethoxine (SDM), sulfaquinoxaline (SQX), and tetracyclines inclu...
This study was conducted to develop more convenient simultaneous determination method by matrix solid phase dispersion (MSPD) and HPLC for sulfonamides such as sulfamerazine (SMR), sulfamethazine (SMT), sulfamonomethoxine (SMM), sulfadimethoxine (SDM), sulfaquinoxaline (SQX), and tetracyclines including oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC) chlortetracycline (CTC) in prok and flatfish. The limits of detection were 0.047 $mg{\cdot}kg^{-1}$ for OTC, TC, SMR, SMT and SMM, and 0.033 $mg{\cdot}kg^{-1}$ for CTC, SDM, and SQX, respectively. So it is sufficiently possible to detect the eight tetracyclines and sulfonamides under their MRLs ($0.1{\sim}0.2mg{\cdot}kg^{-1}$). The average percentage recoveries of sulfonamides and tetracyclines from pig muscle and flatfish spiked standard solution were approximately $80.25{\sim}101.25%$ and $85.77{\sim}121.42%$, respectively. Therefore this method was efficient for simultaneous analysis of eight tetracyclines and sulfonamides.
This study was conducted to develop more convenient simultaneous determination method by matrix solid phase dispersion (MSPD) and HPLC for sulfonamides such as sulfamerazine (SMR), sulfamethazine (SMT), sulfamonomethoxine (SMM), sulfadimethoxine (SDM), sulfaquinoxaline (SQX), and tetracyclines including oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC) chlortetracycline (CTC) in prok and flatfish. The limits of detection were 0.047 $mg{\cdot}kg^{-1}$ for OTC, TC, SMR, SMT and SMM, and 0.033 $mg{\cdot}kg^{-1}$ for CTC, SDM, and SQX, respectively. So it is sufficiently possible to detect the eight tetracyclines and sulfonamides under their MRLs ($0.1{\sim}0.2mg{\cdot}kg^{-1}$). The average percentage recoveries of sulfonamides and tetracyclines from pig muscle and flatfish spiked standard solution were approximately $80.25{\sim}101.25%$ and $85.77{\sim}121.42%$, respectively. Therefore this method was efficient for simultaneous analysis of eight tetracyclines and sulfonamides.
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문제 정의
본 연구는 Baker와 Walker5)가 제시한 MSPD방법을 응용하여 가축 중 현재 국내에서 소비량이 가장 많고, 지방의 함량이 비교적 높은 돼지고기와, 회로 가장 많이 소비되고 있는 광어 중 잔류 가능성이 높은 oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC) 및 chlortetracycline (CTC)를 포함한 3종의 tetracycline계열 항생제와 sulfamerazine (SMR), sulfamethazine (SMT), sulfamonomethoxine (SMM), sulfadimethoxine (SDM), sulfaquinoxaline (SQX)을 포함한 5종의 sulfonamide들을 MSPD와 HPLC를 이용한 정량분석법을 확립하고 현행 분석방법의 문제점도 보완하여 보다 낮은 검출한계와 높은 회수율을 얻을 수 있는 효율적인 축산물 및 수산물 중 tetracycline계 항생제와 sulfonamide들의 동시분석방법을 확립하고자하였다.
제안 방법
12%로 매우 저조하게 나타났다. 그러므로 동일한 파장에서 OTC, TC, CTC, SMR, SMT, SMM, SDM 및 SQX를 동시에 분석할 수 없어 OTC, TC, CTC 3종은 식품공전 및 AOAC에 제시되어 있는 테트라싸이클린계열 항생물질 동시분석 파장인 360 nm에서, SMR, SMT, SMM, SDM, SQX는 AOAC에 제시되어있는 sulfonamide 동시분석 파장인 270 nm에서 UV/DAD를 이용하여 8가지 성분을 동시분석하였다3,20).
따라서 본 실험에서는 pH변화에 따른 이동상 용매들의 피크분리 양상과 8가지 항생, 항균제들의 동시분석 시 적절한 피크분리를 유도하기 위하여 예비실험을 거쳐 분리도가 비교적 좋은 0.005 M oxalic acid : acetonitrile(79:21, v/v)의 이동상을 선정한 다음 각 항생제 및 항균제 표준용액 5mg·L-1로 완충용액의 pH 변화에 따른 머무름 시간의 양상을 조사하였다.
이러한 결과를 바탕으로 TC와 SMR이 분리되는 시점까지는 pH 4.5의 0.005 M oxalic acid 완충용액으로 분석하고 SDM과 SQX를 분리하기 위하여 pH 6.1의 0.005 Moxalic acid 완충용액으로 분석을 실시하였다. 위의 실험을 거쳐 설정한 이동상 용매와 분석조건은 Table 2에 나타내었다.
그러므로 MSPD 방법을 이용한 tetracycline계 항생제와 sulfonamide의 추출 시 지방의 제거는 시료량의 증가와 동시에 정확하고 효율적인 분석에 중요한 요인이라 할 수 있다. 지방제거를 위하여 시료의 균질화 전에 petroleum ether를 이용하여 0℃에서 원심분리하여 돼지고기 및 광어 중 지방을 제거하였고, 용출과정에서 hexane을 이용하여 다시 한번 지방을 제거하고 기기분석 전에 0℃에서 원심분리하여 지방을 제거하였다. 그 결과 효과적으로 지방을 제거할 수 있었으며 이전의 0.
항생제가 잔류하지 않은 무처리 시료 3 g에 1 mg·kg-1 및 5 mg·kg-1이 되도록 8종의 항생, 항균제 혼합표준용액을 첨가하고 회수율 검사를 실시하였다.
대상 데이터
실험에 사용된 돼지고기는 대전광역시 대형마트에서, 광어는 대전광역시 노은동 노은농수산물 도매시장에서 유통 판매되는 것을 구입하여 냉장상태로 실험실에 운반하고 지방부분을 제거한 근육만을 균질화 한 후 각각 3 g으로 칭량하여 polyethylene bag에 밀봉한 후 -20℃ 상태로 보관하며 사용하였다.
실험에 사용한 표준품은 OTC, TC, CTC 등 tetracycline계 항생제 3종과 SMR, SMT, SMM, SDM, SQX 등 sulfonamide들 5종을 Sigma-Aldrich 사(U.S.A.)의 제품을 직접 구매하여 사용하였고, 실험에 사용한 항생, 항균제들의 특성은 Table 1과 같다.
성능/효과
8가지 성분의 검출한계는 0.033~0.047 μg·mL-1로 8가지 성분의 MRLs(Maximum Residue Levels) 인 0.1~0.2 mg·kg-1 수준의 분석에 적합한 것으로 판단된다.
그리고 8가지 성분의 검출 순서는 실험을 실시한 거의 대부분의 pH에서 OTC, TC, SMR, SMT, SMM, CTC, SDM, SQX의 순으로 나타났으며 TC와 SMR, SDM과 SQX를 제외하고는 비교적 좋은 분리양상을 보였다. TC와 SMR은 pH 4.5를 제외한 모든 pH에서 서로 분리가 이루어지지 않았고, SDM과 SQX의 경우 pH에 따라 두성분간의 머무름 시간에서는 차이를 보였으나 피크가 많이 늘어지는 양상을 보여 완벽하게 분리되지 않았으나 pH 6.1에서는 SQX가 SDM보다 먼저 검출되면서 가장 좋은 분리를 보였고 이 둘의 머무름 시간이 17분 안쪽으로 단축되었다.
광어에서의 회수율은 1 mg·kg-1에서 sulfonamide들이 82.99~97.28%였고, tetracycline계 항생물질이 87.43~119.55%로 나타났고 5mg·kg-1에서 sulfonamide는 83.56~101.28%였고, tetracy-cline계 항생물질은 91.35~121.42%로 나타나 모두 80 % 이상의 회수율을 보였다.
지방제거를 위하여 시료의 균질화 전에 petroleum ether를 이용하여 0℃에서 원심분리하여 돼지고기 및 광어 중 지방을 제거하였고, 용출과정에서 hexane을 이용하여 다시 한번 지방을 제거하고 기기분석 전에 0℃에서 원심분리하여 지방을 제거하였다. 그 결과 효과적으로 지방을 제거할 수 있었으며 이전의 0.5 g으로 제한된 시료량도 3 g으로 늘릴 수 있었다. 한편 Baker와 Long25)과 Long 등22)은 각각 우유와 어육에서 tetracycline계 항생제와 OTC 분석과정 중 EDTA와 oxalic acid를 전 처리과정에 첨가하였을 때 회수율이 높아진다고 하였고, Kang 등4)은 시료 0.
57%를 보인 것으로 보고하여 Hah 등2)이 보고한 것보다 높은 회수율을 보여 tetracycline계열의 항생제 분석의 세정 및 용출시 n-hexane으로 지방을 제거한 후 methanol 및 methanolic oxalic acid로 용출하여 분석하는 것이 효율적이라 판단하였다. 그래서 시료의 증가와 8가지 성분의 특성을 고려하여 n-hexane 10 mL로 지방을 제거한 후 dichloromethane 20 mL와 methanol 20mL로 연속적으로 용출한 결과 sulfonamide의 회수율은 80.25~101.25%, tetracycline계 항생물질의 회수율은 85.77~121.42%였다.
1에서 보는 바와 같이 pH 농도가 중성에 가까울수록 대부분 성분들의 머무름 시간이 조금씩 길어졌고, SDM과 SQX만이 완충액의 pH가 5일 때를 기준으로 머무름 시간이 급속히 짧아졌다. 그리고 8가지 성분의 검출 순서는 실험을 실시한 거의 대부분의 pH에서 OTC, TC, SMR, SMT, SMM, CTC, SDM, SQX의 순으로 나타났으며 TC와 SMR, SDM과 SQX를 제외하고는 비교적 좋은 분리양상을 보였다. TC와 SMR은 pH 4.
실제로 MSPD방법을 이용하여 분석하였을 때 최종적으로 조제된 분석시료에도 상당량의 지방이 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 이 지방은 HPLC를 이용한 분석 시 피크의 분리도에 큰 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 그러므로 MSPD 방법을 이용한 tetracycline계 항생제와 sulfonamide의 추출 시 지방의 제거는 시료량의 증가와 동시에 정확하고 효율적인 분석에 중요한 요인이라 할 수 있다.
돼지고기 1 mg·kg-1에서 sulfonamide가 80.25~90.32%, tetracycline계 항생물질이 85.77~111.36%로 나타났고 5 mg·kg-1에서 sulfonamide들은 81.86~94.21%, 테트라싸이클린계 항생물질은 87.69~120.60%로 나타나 모두 80% 이상의 회수율을 보였다.
5 g 이하로 제한이 된다는 단점을 가지고 있는데, 그 이유 중 시료에 포함되어있는 지방이 큰 비중을 차지한다17). 실제로 MSPD방법을 이용하여 분석하였을 때 최종적으로 조제된 분석시료에도 상당량의 지방이 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 이 지방은 HPLC를 이용한 분석 시 피크의 분리도에 큰 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Sulfonamide는 언제 누구에 의해서 개발되었는가?
특히돼지, 닭, 소의 사료첨가제로써 많이 사용되는데, 그 소비가 많은 만큼 조직에 잔류할 가능성이 많기 때문에 소비자뿐만 아니라 공중보건담당자들에게도 지대한 관심거리이다. 또한 sulfonamide는 1932년 Domark에 의해 Prontosil을 개발한 후 각종 화합물이 계속 개발되어 가축의 세균성, 원충성 감염질환의 치료와 예방목적으로 널리 사용되어 왔으며 안정된 구조와 경제적인 면에서 탁월하여 다양한 형태로 시판되고 있다2,5). Sulfonamide는 가축에 경구투여 시 흡수가 빠르며 뇨의 pH와 밀접한 관계가 있어 돼지에서는 반추가축이나 말보다 배설되는 시간이 오래 걸리며 주로 비뇨기 계통으로 배설되는데 sulfonamide를 과량으로 장기간 투여할 경우 조직 내에 잔류할 가능성이 매우 높은 것으로 알려져 있다6-7).
sulfonamide를 과량으로 장기간 투여할 경우 어떤 문제점이 있는가?
또한 sulfonamide는 1932년 Domark에 의해 Prontosil을 개발한 후 각종 화합물이 계속 개발되어 가축의 세균성, 원충성 감염질환의 치료와 예방목적으로 널리 사용되어 왔으며 안정된 구조와 경제적인 면에서 탁월하여 다양한 형태로 시판되고 있다2,5). Sulfonamide는 가축에 경구투여 시 흡수가 빠르며 뇨의 pH와 밀접한 관계가 있어 돼지에서는 반추가축이나 말보다 배설되는 시간이 오래 걸리며 주로 비뇨기 계통으로 배설되는데 sulfonamide를 과량으로 장기간 투여할 경우 조직 내에 잔류할 가능성이 매우 높은 것으로 알려져 있다6-7).
tetracycline계열의 항생제는 어디에 사용되는가?
항균, 항생제 중 tetracycline계열의 항생제는 그람음성균, 그람양성균 및 마이코플라스마에 대하여 정균효과가 우수한 항생제로 가축에서는 장내세균 감염증, 호흡기 질병, 아나플라스마 감염증 및 타일레리아 감염증 등의 치료제로 사용될 뿐만 아니라 각종 질병을 예방하고 사료효율을 높이기 위한 사료첨가제로 매우 많이 사용되는 항생제이다4-5). 특히돼지, 닭, 소의 사료첨가제로써 많이 사용되는데, 그 소비가 많은 만큼 조직에 잔류할 가능성이 많기 때문에 소비자뿐만 아니라 공중보건담당자들에게도 지대한 관심거리이다. 또한 sulfonamide는 1932년 Domark에 의해 Prontosil을 개발한 후 각종 화합물이 계속 개발되어 가축의 세균성, 원충성 감염질환의 치료와 예방목적으로 널리 사용되어 왔으며 안정된 구조와 경제적인 면에서 탁월하여 다양한 형태로 시판되고 있다2,5).
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