Xenorhabdus nematophila (Xn)와 Photorhabdus tempeerata subsp. temperata (Ptt)의 곤충병원세균을 배추좀나방(Plutella xylostella)의 혈강에 주입할 경우 높은 병원력을 보였다. 본 연구는 이들 세균 배양액의 섭식 처리에 따른 배추좀나방에 대한 병원성 유기를 조사하였다. 세균 배양액만을 이용하여 배추좀나방 3령충에 섭식 처리한 결과 뚜렷한 병원성을 유발하지 못하였으나, Bacillus thurigiensis(Bt) 와 혼합 처리하였을 때 높은 Bt 병원성 제고 효과를 나타냈다. 물질 추적을 위해서 이 세균 배양액을 유기 용매를 이용하여 헥산, 에틸아세테이트 및 수용액 추출 분획구로 분리하였다. 대부분이 Bt 상승효과는 에틸아세테이트 추출 분획구에서 나타났다. Thin layer chromatography 분석 결과는 에틸아세테이트 분획구가 대사물질을 포함하고 있으며, 이들이 헥산 또는 수용액 추출 분획구에 포함된 물질과는 상이하다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 이들 곤충병원세균이 Bt 병원성을 제고시키는 물질을 생산하고 배양액으로 분비한다고 제시하고 있다.
Xenorhabdus nematophila (Xn)와 Photorhabdus tempeerata subsp. temperata (Ptt)의 곤충병원세균을 배추좀나방(Plutella xylostella)의 혈강에 주입할 경우 높은 병원력을 보였다. 본 연구는 이들 세균 배양액의 섭식 처리에 따른 배추좀나방에 대한 병원성 유기를 조사하였다. 세균 배양액만을 이용하여 배추좀나방 3령충에 섭식 처리한 결과 뚜렷한 병원성을 유발하지 못하였으나, Bacillus thurigiensis(Bt) 와 혼합 처리하였을 때 높은 Bt 병원성 제고 효과를 나타냈다. 물질 추적을 위해서 이 세균 배양액을 유기 용매를 이용하여 헥산, 에틸아세테이트 및 수용액 추출 분획구로 분리하였다. 대부분이 Bt 상승효과는 에틸아세테이트 추출 분획구에서 나타났다. Thin layer chromatography 분석 결과는 에틸아세테이트 분획구가 대사물질을 포함하고 있으며, 이들이 헥산 또는 수용액 추출 분획구에 포함된 물질과는 상이하다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 이들 곤충병원세균이 Bt 병원성을 제고시키는 물질을 생산하고 배양액으로 분비한다고 제시하고 있다.
Two entomopathogenic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus temperata subsp. temperata, are known to be potent against the diamondback moth, Plutella xylostella, when the bacteria are injected into the hemocoel. This study investigated any pathogenic effect of their culture broth on P. x...
Two entomopathogenic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus temperata subsp. temperata, are known to be potent against the diamondback moth, Plutella xylostella, when the bacteria are injected into the hemocoel. This study investigated any pathogenic effect of their culture broth on P. xylostella by oral administration. Only culture broth of both bacterial species did not give enough pathogenic effects by the oral administration. However, when the culture broth was orally treated together with Bacillus thuringiensis (Bt), both cell-free culture broth significantly enhanced Bt pathogenicity against the 3rd instar larvae of P. xylostella. The culture broth was then fractionated into hexane, ethyl acetate, and aqueous extracts. Most synergistic effect on Bt pathogenicity was found in ethyl acetate extracts of both bacterial species. Thin layer chromatography of these extracts clearly showed that ethyl acetate extracts of both bacterial culture broths possessed metabolites that were different to those of hexane and aqueous extracts. These results suggest that the both entomopathogenic bacteria produce and secrete different factors to give significant synergistic effect on Bt pathogenicity.
Two entomopathogenic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus temperata subsp. temperata, are known to be potent against the diamondback moth, Plutella xylostella, when the bacteria are injected into the hemocoel. This study investigated any pathogenic effect of their culture broth on P. xylostella by oral administration. Only culture broth of both bacterial species did not give enough pathogenic effects by the oral administration. However, when the culture broth was orally treated together with Bacillus thuringiensis (Bt), both cell-free culture broth significantly enhanced Bt pathogenicity against the 3rd instar larvae of P. xylostella. The culture broth was then fractionated into hexane, ethyl acetate, and aqueous extracts. Most synergistic effect on Bt pathogenicity was found in ethyl acetate extracts of both bacterial species. Thin layer chromatography of these extracts clearly showed that ethyl acetate extracts of both bacterial culture broths possessed metabolites that were different to those of hexane and aqueous extracts. These results suggest that the both entomopathogenic bacteria produce and secrete different factors to give significant synergistic effect on Bt pathogenicity.
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문제 정의
면역반응이 억제된 대상 곤충은 병원미생물에 대한 감염성이 높아지게 된다. 본 연구는 이들 두 종류의 곤충병원 세균의 배양액이 배추좀나방(尸&旋〃a:顷에 Bacillus thuringiensis (Bt) 의 감염력을 제고시키는지를 조사하였다. 또한 두 병원 세균에서 분비되는 물질을 추적하기 위해 이들 배양을 분리하여, 분획 구별로 면역 억제 기능을 분석하고 이들 분획 구에 포함된 화학물질 존재를 thin layer chromatography (TLC) 를 이용흐卜여 규명하였다
제안 방법
분리하였다. TLC 판(Merck, Darmstadt, Germany)에 분획구 물질 (200 ]」1)을 각각 처리한 후 isopropanol:H2O (9:1, v/v) 의 전개제를 이용하여 물질 분리를 실시하였다. 전개 용액이 정점에 이르면, TLC 판을 자외선 투영기 (Spectroline, New York, USA)를 통하여 분리 띠를 확인한 후 sea sand (Junsei, Tokyo, Japan) 와 iodine (Duksan, Ansan, Korea) 혼합물(19:1, 잉£)100 g 이 담겨진 병에서 발색시켰다.
이 현탁액에 배추잎(1 Cnf)을 10분간 침지 시킨 후 여과가 깔려진 용기 (직경 9 cm)에서 5분간 건조시켰다. 각 배추잎에 배추좀나방 3령충을 10마리씩 3반복으로 처리하였으며, 매일 24시간 주기로 5일 동안 생존수를 계수하였다. 대조구는 Bt 단독 또는 살균 수로 상기와 동일하게 처리하였다.
두 곤충병원 세균 단독 효과를 알아보기 위해 이들 세균을 48시간동안 배양시킨 배양액(5 X 107 cfb/ml)을 이용하여 배추좀나방 3령 유충에 대해 섭식 처리 효과를 분석했다(Fig. 1). 세균이 제거된 배양액은 단독으로 뚜렷한 살충효과를 나타내지 못했다.
본 연구는 이들 두 종류의 곤충병원 세균의 배양액이 배추좀나방(尸&旋〃a:顷에 Bacillus thuringiensis (Bt) 의 감염력을 제고시키는지를 조사하였다. 또한 두 병원 세균에서 분비되는 물질을 추적하기 위해 이들 배양을 분리하여, 분획 구별로 면역 억제 기능을 분석하고 이들 분획 구에 포함된 화학물질 존재를 thin layer chromatography (TLC) 를 이용흐卜여 규명하였다
세균배양액으로부터 유기용매를 이용하여 준비된 헥산 분획구, 에틸아세테이트 분획구 및 남은 배양액수용액 층으로 추출된 물질들을 TLC로 분리하였다. TLC 판(Merck, Darmstadt, Germany)에 분획구 물질 (200 ]」1)을 각각 처리한 후 isopropanol:H2O (9:1, v/v) 의 전개제를 이용하여 물질 분리를 실시하였다.
5 ppm으로 산출되었다. 약 20%의 살충효과를 보이는 Bt 약량을 이용하여 Xn과 Ptt의 배양액의 Bt에 대한 협력 효과를 분석하였다 (Fig. 2). 위에서와같이 다시 Xn과 Ptt는 단독으로 살충효과가 있었으나, 낮은 농도의 Bt와 혼합할 경우 뚜렷한 Bt 병원력 상승효과를 보였다.
이러한 농도에 따른 병원성 증가 경향은 두 세균 배양액 추출물 모두에서 유사하게 관찰되었다. 이 에틸아세테이트 추출물에 포함된 물질을 규명하기 위해 본 연구는 두 세균 추출물을 TLC로 분석하였다 (Fig. 4). 비교적 극성 전개용매에서 에틸아세테이트 추출물은 TLC상에서 이동한 반면에 헥산 추출물은 이동하지 않았다.
TLC 판(Merck, Darmstadt, Germany)에 분획구 물질 (200 ]」1)을 각각 처리한 후 isopropanol:H2O (9:1, v/v) 의 전개제를 이용하여 물질 분리를 실시하였다. 전개 용액이 정점에 이르면, TLC 판을 자외선 투영기 (Spectroline, New York, USA)를 통하여 분리 띠를 확인한 후 sea sand (Junsei, Tokyo, Japan) 와 iodine (Duksan, Ansan, Korea) 혼합물(19:1, 잉£)100 g 이 담겨진 병에서 발색시켰다.
헥산과 에틸아세테이트를 이용하여 두 곤중병원세균 배양액으로부터 물질 추출을 실시하였고, 이 추출물들의 Bt 병원력 상승효과를 검정하였다(Fig. 3). 낮은 농도의 Bt와 혼합 처리하였을 때, 헥산과 에틸아세테이트의 두 물질 추출 분획 구는 모두 병원력 상승효과를 지녔다.
대상 데이터
(B) Bacillus thuringiensis (Bt, 32,000 lU/mg) was diluted with the sterile distilled water and used to treat the larvae with the method described above. Each dose treatment used 30 larvae with three replications. Mortality was estimated at 48 h after the treatment.
곤충병원 세균인 X. nematophila K1과 P. temperata temperata ANU101은 각각 기주 선충에서 분리된 후 (Park et al., 1999; Kang et al., 2004) 동결보관중인 것을 이용하였다. 이들 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지를 이용하여 28℃에서 12시간 동안 배양하여 단일 균총을 채취하였다.
생물농약 Bt는 (주) 고려바이오(Hwasung, Korea)로부터 지원받았다. 제품 성분은 B.
시험 곤충은 안동시 송천동에 소재한 배추밭에서 채집한 유충을 약제 처리하지 않고 실내에서 누대 사육한 것을 사용하였다. 유중은 온도 25±1℃, 광주기 16:8h (L:D), 상대습도 40~60%의 배양기에서 배추를 먹이로 사육했다.
데이터처리
모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다. 반수치사약량 (median lethal concentration: LC50)은 probit 분석법 (Raymond, 1985)을 이용하여 산출하였다.
, 2004) benzylideneacetone (BZA), proline-tyrosine (PY) 및 acetylated phenylalanine-glycine-valine (Ac-FGV) 이 존재하는 것으로 본 TLC는 나타냈다. 그러나 본 TLC 결과는 Xn의 주요 대사산물이 이들 세 물질이 아닌 것으로 나타났다. 반면에 Ptt 유래 에틸아세테이트 추출물은 Xn 유래 에틸아세테이트와 서로 다른 추출 물질 양상을 보였다
한 예로 척추동물의 후천성면역의 기억 작용과 유사하게 곤충에 있어서 저12 차 감염에 따라 신속하게 면역작용이 일어나는 현상이 발견되었으며, 이러한 작용 원리가 미리 높은 농도의 불활성화 형태의 페놀옥시다제를 이전 감염에서 비축해두었다가 제2차 감염 때 신속하게 많은 양으로 활성화된다고 설명하였다(Pham and Schneider, 2008). 따라서 본 연구에서 보여준 면역억제와 Bt 감수성 증가는 최종적으로 만들어진 면역작용 물질에 대한 억제 보다는 이를 활성화하는 단계인 아이코사노이드합성효소인 PLA2를 공략함에 따라 Bt에 대한 선천성 및 일부 후천적 기억 면역 저항 기작을 무력화한다는 의미로 받아들여야 한다.
그러나 이 Bt 병원력 상승효과는 헥산에 비해 에틸아세테이트 추출 분획 구에서보다 높게 나타났다. 또한 에틸아세테이트의 Bt 병원력 상승효과는 이 추출물의 농도가 높아짐에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 농도에 따른 병원성 증가 경향은 두 세균 배양액 추출물 모두에서 유사하게 관찰되었다.
본 연구 결과는 유용물질을 생산하고 분비할 것으로 여겨지는 두 곤충병원 세균인 Xn과 Ptt가 Bt의 병원력을 뚜렷하게 제고시키는 것으로 나타냈다. 즉 20% 이하의 낮은 병원력을 보였던 Bt 병원력이 이들 세균 배양액과 함께 처리하면 크게 살충력이 증가하였다.
채취된 단일 균총을 3 ml의 LB 액체배지를 이용하여 28℃에서 16시간 동안 200 rpm의 속도로 회전 배양한 후, 글리세롤을 30%의 농도가 되도록 첨가한 후 동결 분획 시료를 만들었다. 이 동결 시료가 추후 반복되는 세균 배양의 원시료로 이용되어 계대배양에 따른 세균 변이 가능성을 줄였다. 글리세롤 동결 세균 시료 250 μ1를 1 L 의 LB 액체배지에 첨가하고 28 ℃ 에서 48시간 동안 200 rpm의 속도로 회전 배양하였다.
이상의 연구 결과는 XB과 Ptt의 배양액에 면역억제물질이 포함되었으며 이 물질이 배추좀나방의 아이코사노이드 생합성에 주요한 pla2 효소 반응을 억제시킬 가능성이 있는 것으로 제시된다. 추후 두 세균 배양액 에틸아세테이트 추출물을 중심으로 새로운 pla2 면역교란 물질에 대한 화학 동정이 필요하다.
뚜렷하게 제고시키는 것으로 나타냈다. 즉 20% 이하의 낮은 병원력을 보였던 Bt 병원력이 이들 세균 배양액과 함께 처리하면 크게 살충력이 증가하였다. 예를 들어, Ptt 배양액과 Bt를 혼합한 경우 약 90% 이상의 살충력 상승효과를 나타냈다.
후속연구
가능성이 있는 것으로 제시된다. 추후 두 세균 배양액 에틸아세테이트 추출물을 중심으로 새로운 pla2 면역교란 물질에 대한 화학 동정이 필요하다.
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