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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 동아시아에 분포하는 칡 및 근연분류군간의 유연관계를 확인하기위하여 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)를 분자마커로 활용하는 연구를 수행하고자 하였다.
- 상기한 바와 같이 칡 및 근연분류군에 대하여 종내, 종간의 개체군 사이의 유전적 다양성을 파악하고 종내, 종간의 분자유전학적 유연관계 및 분자마커를 조사하기 위해 칡과 근연분류군에 대하여 국내외 지역별 개체군을 대상으로 채집하여 본 연구에 사용하였다. 칡은 한국에서 채집․확보된 9개 자연집단과 베트남과 중국에서 직접 채집한 2개 집단을 이용하였으며, 시중에서 한약재(갈화)로 유통 중인 국내산(PSPK)과 중국산(PSPC01)을 확보하여 원산지의 진위여부 판별에 이용하였다.
제안 방법
- 5 mL을 첨가하여 3,200 rpm에서 1시간 원심분리시켜 상등액을 취하고 2/3에 해당하는 부피의 isopropanol을 첨가한 후 -20℃에서 12시간 이상 보관 후 15,000 rpm로 1시간 원심분리하여 DNA를 분리하였다. DNA pellet은 70% ethanol로 세척 후 TE buffer(1M Tris, 0.5 M EDTA, pH 8.0)에 녹였고, Geneclean kit(Bio 101 Inc., CA, USA)를 이용하여 DNA를 정제한 후, 0.7% agarose gel에 전기영동 시킨 후 1% EtBr로 염색하여 추출여부를 확인하였으며, 정확한 DNA의 농도는 GeneQuant pro(Amersham Pharmacia Biotech, Inc. USA)를 이용하여 결정한 후 PCR 반응에 사용하였다.
- DNA 추출을 위한 재료는 주로 어린잎을 Silica gel을 이용하여 건조시켜 사용하였으며, 잎을 액체질소에 넣은 후 막자사발로 분쇄하였고, CTAB 방법(Doyle and Doyle, 1987)을 변형한 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 약 1.
- PCR 결과에 의해 증폭된 DNA 절편으로부터 나타난 각 band를 하나의 형질로 취급하여 band의 유무에 따라 각각 1과 0으로 표시하고, 전체 OTU에 대한 자료행렬을 작성하였다.
- PCR 반응액의 총 부피는 25 μL로서, 10-50 ng DNA, 1unit Taq DNA polymerase, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% gelatin, 0.5 μM primer 그리고 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 M을 포함시켰다.
- 1)을 이용하여 Nei(1972)의 유전적 거리지수에 근거한 비유사도지수행렬을 도출하였다(Table 3). 도출된 자료행렬에 근거하여 UPGMA(비가중산술법, Unweighted pair group method with arithmetic mean)방법(Rohlf, 1989)에 의한 phenogram을 작성하여 각 OTU간의 유전적 유사성을 검토하였다.
- 약 1.0g의 분말을 0.5% 2-β-mercaptoentanol이 첨가된 15 mL의 extraction buffer(2% CTAB; 100 mM Tris, pH 8.0;50 mM EDTA, pH 8.0; 500 mM NaCl)에 넣은 후 65℃에서 1시간 incubation하였고, 조직 내 phenol 화합물 및 탄닌 등의 불순물을 제거하기 위하여 extraction buffer에 2% PVP-40을 첨가하였다.
- 200까지의 10-mer oligoprimer를 이용하여 94℃에서 4분간 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 30초, 45℃에서30초, 72℃에서 1분으로 구성된 amplifying을 40cycle로 수행하고, 마지막 단계인 final extention 과정은 72℃에서 7분간 진행시켰다. 이때 각각의 primer 에 대한 상기의 PCR 과정을 통한 screening을 실시하여 선택된 primer는 3회 이상의 반복실험을 통해 재현성이 뚜렷한 것만을 사용하였다(Table 2). 증폭된 DNA product는 1.
- 이때 각각의 primer 에 대한 상기의 PCR 과정을 통한 screening을 실시하여 선택된 primer는 3회 이상의 반복실험을 통해 재현성이 뚜렷한 것만을 사용하였다(Table 2). 증폭된 DNA product는 1.5% agarose gel상에서 전기영동한 후 1% EtBr로 염색하여 UV-illuminator상에서 band를 확인한 후 사진촬영을 하고 ideogram을 작성하여 정확한 분자마커의 위치를 표시하였다(Fig. 1, 2).
- 콩과에 속하는 칡 1종에 대한 13개 집단과 근연분류군 2종의 4개 집단 등 총 17개 국내외 지역별개체군에 대하여 유전적 유연관계 및 분자마커를 알아보기 위해 RAPD 분석을 실시하였다. 본 실험에 사용된 200개의 random primer를 대상으로 screening을 실시한 결과, 뚜렷한 RAPD 절편형성의 재현성을 나타내는 primer는 15개로 나타났다(Table 2).
대상 데이터
- 칡은 한국에서 채집․확보된 9개 자연집단과 베트남과 중국에서 직접 채집한 2개 집단을 이용하였으며, 시중에서 한약재(갈화)로 유통 중인 국내산(PSPK)과 중국산(PSPC01)을 확보하여 원산지의 진위여부 판별에 이용하였다. 근연분류군의 경우 베트남과 중국에서 2종 4개 집단을 확보하여 총 17개 집단을 본 실험에 이용하였다. 확보된 시료 중 시중에서 구입하여 동정이 불가능한 개체는 PSPK(한국산)과 PSPC01(중국산)으로 처리하여 취급하였다(Table 1).
- 상기한 바와 같이 칡 및 근연분류군에 대하여 종내, 종간의 개체군 사이의 유전적 다양성을 파악하고 종내, 종간의 분자유전학적 유연관계 및 분자마커를 조사하기 위해 칡과 근연분류군에 대하여 국내외 지역별 개체군을 대상으로 채집하여 본 연구에 사용하였다. 칡은 한국에서 채집․확보된 9개 자연집단과 베트남과 중국에서 직접 채집한 2개 집단을 이용하였으며, 시중에서 한약재(갈화)로 유통 중인 국내산(PSPK)과 중국산(PSPC01)을 확보하여 원산지의 진위여부 판별에 이용하였다. 근연분류군의 경우 베트남과 중국에서 2종 4개 집단을 확보하여 총 17개 집단을 본 실험에 이용하였다.
- 근연분류군의 경우 베트남과 중국에서 2종 4개 집단을 확보하여 총 17개 집단을 본 실험에 이용하였다. 확보된 시료 중 시중에서 구입하여 동정이 불가능한 개체는 PSPK(한국산)과 PSPC01(중국산)으로 처리하여 취급하였다(Table 1). 본 연구에 사용된 재료의 증거표본은 경원대학교 생명과학과 자원식물표본실(KWU)에 보관하였다.
이론/모형
- NTSYS(Applied Biostatistics, 2000, v2.1)을 이용하여 Nei(1972)의 유전적 거리지수에 근거한 비유사도지수행렬을 도출하였다(Table 3). 도출된 자료행렬에 근거하여 UPGMA(비가중산술법, Unweighted pair group method with arithmetic mean)방법(Rohlf, 1989)에 의한 phenogram을 작성하여 각 OTU간의 유전적 유사성을 검토하였다.
성능/효과
- RAPD 분자마커를 이용한 본 연구에서 15개의 oligo primer로부터 형성된 211개의 RAPD절편 중 polymorphic bands는 208개로 나타나 칡 개체군들이 유전적으로 매우 다양한 것으로 생각되며, 이러한 결과는 비유사도지수에서 칡 개체군간의 유전적거리가 비교적 높고, 유집분석결과 UPGMA phenogram에서도 지역별 유집성이 없는 것으로 지지된다. 한편, 칡과 근연분류군을 식별가능하게 하는 분자마커는 15개의 primer에서 4개가 관찰되어 별도의 RAPD 절편 자료분석을 수행하지 않아도 근연종을 쉽게 구별할 수 있었으며, 총 3회의 반복실험에도 동일한 재현성을 나타내어 종구별에 매우 유용한 분자마커로 생각된다.
- RAPD결과 도출된 비유사도지수행렬에 의하면 칡 개체군간의 유전적 거리는 0.159에서 0.512(평균 0.316)로 나타나 유전적 다양성이 비교적 높은 것으로 나타났으며, 칡개체군과 근연분류군간에는 0.340에서 1.23(평균 0.661)로 확인되어 유전적 불연속성이 확인되었다. 또한, 한국산 칡 개체군 내에서는 0.
- 한국산 칡 유집군은 무주-함양-옥천I-태안, 대전-당진, 천안-옥천II-정읍 등의 3개 소그룹으로 구성되지만 지역적 분포와는 전혀 무관하게 유집되는 경향을 나타내어 칡 개체군들이 매우 높은 유전적 다양성을 나타내는 것으로 생각된다. 또한, 시중에서 구입한 칡 개체군 중 한국산 칡은 외국산 칡 개체군들과 함께 유집되었으며, 중국산 칡 개체군은 칡의 근연분류군인 Pueraria peduncularis와 함께 유집되었다(Fig. 3).
- 콩과에 속하는 칡 1종에 대한 13개 집단과 근연분류군 2종의 4개 집단 등 총 17개 국내외 지역별개체군에 대하여 유전적 유연관계 및 분자마커를 알아보기 위해 RAPD 분석을 실시하였다. 본 실험에 사용된 200개의 random primer를 대상으로 screening을 실시한 결과, 뚜렷한 RAPD 절편형성의 재현성을 나타내는 primer는 15개로 나타났다(Table 2). RAPD 절편들은 대부분 300-2,000 bp에서 총 211개로 확인되었고, 종간에 서로 차이를 나타냈다.
- 한편, 칡과 근연분류군을 식별가능하게 하는 분자마커는 15개의 primer에서 4개가 관찰되어 별도의 RAPD 절편 자료분석을 수행하지 않아도 근연종을 쉽게 구별할 수 있었으며, 총 3회의 반복실험에도 동일한 재현성을 나타내어 종구별에 매우 유용한 분자마커로 생각된다. 비유사도 지수행렬에서는 칡 개체군내의 유전적 거리는 평균 0.334이었으며, 근연분류군과는 0.676의 명확한 불연속적 유전적 거리지수를 나타내 종구별이 매우 용이한 것으로 나타났으며, 이는 칡은 탁엽이 엽병에 부착되는 형태가 저착(basifixed)인 반면 근연분류군들인 P. phaseoloides와 P. peduncularis는 측착(dorsifixed)하여 구분되는 것과도 일치한다. 또한, 한국산 칡 개체군간의 유전적 거리지수가 평균 0.
- RAPD 절편들은 대부분 300-2,000 bp에서 총 211개로 확인되었고, 종간에 서로 차이를 나타냈다. 종내 개체군간에 동일하거나 서로 다른 band pattern이 관찰되었으며, polymorphic bands는 208개였고, monomorphic bands는 3개에 불과하여 칡과 근연분류군의 매우 높은 유전적 다양성을 나타내고 있다(Fig. 1, 2).
- 374로 상대적으로 높게 나타나 추가적인 primer screening을 실시한다면 칡의 원산지 판별에도 유용한 분자마커를 탐색할 수 있을 것으로 기대된다. 한편, 시중에서 유통 중인 한국산 칡은 한국산 칡 개체군과의 유전적 거리(평균 0.435)에 비해 외국산 칡과 보다 가까운 유전적 거리지수(평균 0.345)를 나타내었으며, 특히, 칡으로 유통 중인 중국산과 칡 개체군과는 평균 0.607의 매우 높은 유전적 거리를 나타내는 것으로 볼 때 칡이 아닌 근연분류군중 하나로 생각된다. 이러한 결과는 유집분석에서도 동일하게 나타나 한국산 칡은 국외산과 중국산 칡은 근연분류군들과 함께 유집되는 것을 관찰할 수 있다.
- RAPD 분자마커를 이용한 본 연구에서 15개의 oligo primer로부터 형성된 211개의 RAPD절편 중 polymorphic bands는 208개로 나타나 칡 개체군들이 유전적으로 매우 다양한 것으로 생각되며, 이러한 결과는 비유사도지수에서 칡 개체군간의 유전적거리가 비교적 높고, 유집분석결과 UPGMA phenogram에서도 지역별 유집성이 없는 것으로 지지된다. 한편, 칡과 근연분류군을 식별가능하게 하는 분자마커는 15개의 primer에서 4개가 관찰되어 별도의 RAPD 절편 자료분석을 수행하지 않아도 근연종을 쉽게 구별할 수 있었으며, 총 3회의 반복실험에도 동일한 재현성을 나타내어 종구별에 매우 유용한 분자마커로 생각된다. 비유사도 지수행렬에서는 칡 개체군내의 유전적 거리는 평균 0.
후속연구
- 따라서 사용빈도가 높거나 오용될 소지가 있는 한약재들을 대상으로 분자생물학적인 표지인자를 구축해 나간다면 향후 보다 객관적으로 검증된 한약재의 유통을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 RAPD 분자마커를 이용한 연구 방법은 현재 뚜렷한 정보 없이 무분별하게 수입되어 사용되고 있는 칡과 칡의 근연분류군을 정확하고 객관적으로 식별하는 방법으로서 매우 유용하다고 생각되며, 향후 지속적인 분자마커 탐색을 실시한다면 칡의 원산지 판별에도 매우 유용한 방법으로 판단되어진다.
- 한약재는 식물체의 다양한 부위가 이용되는 만큼 절단된 상태로 이를 건조시켰을 경우 효능 및 품질이 떨어지는 위품을 진품과 구별하는 것은 매우 주관적일 뿐 아니라 어려운 일이다. 따라서 사용빈도가 높거나 오용될 소지가 있는 한약재들을 대상으로 분자생물학적인 표지인자를 구축해 나간다면 향후 보다 객관적으로 검증된 한약재의 유통을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 RAPD 분자마커를 이용한 연구 방법은 현재 뚜렷한 정보 없이 무분별하게 수입되어 사용되고 있는 칡과 칡의 근연분류군을 정확하고 객관적으로 식별하는 방법으로서 매우 유용하다고 생각되며, 향후 지속적인 분자마커 탐색을 실시한다면 칡의 원산지 판별에도 매우 유용한 방법으로 판단되어진다.
- peduncularis는 측착(dorsifixed)하여 구분되는 것과도 일치한다. 또한, 한국산 칡 개체군간의 유전적 거리지수가 평균 0.288로 비교적 낮은 반면에 국외산 칡 개체군과는 평균 0.374로 상대적으로 높게 나타나 추가적인 primer screening을 실시한다면 칡의 원산지 판별에도 유용한 분자마커를 탐색할 수 있을 것으로 기대된다. 한편, 시중에서 유통 중인 한국산 칡은 한국산 칡 개체군과의 유전적 거리(평균 0.
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