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문제 정의
- 본 연구는 8주령 Sprague-Dawley계통의 암컷 랫드에서제독유황을 반복경구투여 독성평가를 하기 위해 시행하였다. 랫드에 처치한 물질은 사료섭취량의 0.
제안 방법
- 제독유황의 안전성을 확인하기 위해 다음과 같은 관찰 및 검사를 하였다. 검사항목으로는 체중과 사료 섭취를 측정하였고 임상증상, 안과학적 검사, 혈액학적 검사, 혈청 생화학적 검사를 관찰하였다. 또한 랫드에 간과 신장에서의 병리조직학적 변화를 관찰하였다.
- 시험물질의 제조는 랫드의 하루 사료섭취량의 구하여 계산하였다. 대조군은 용매제인 Corn oil (Sigma Co, Ltd) 을 사용하였고, 저용량은 하루 섭취량의 0.2%만큼의 제독 유황을 첨가하여 투여하였다. 중간용량군은 하루 섭취량의 1%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였으며, 고용량군은 하루 섭취량의 5%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였다.
- 검사항목으로는 체중과 사료 섭취를 측정하였고 임상증상, 안과학적 검사, 혈액학적 검사, 혈청 생화학적 검사를 관찰하였다. 또한 랫드에 간과 신장에서의 병리조직학적 변화를 관찰하였다. 그 결과 체중, 사료 섭취량, 혈액학적 및 병리조직검사 소견에서 대조군과 제독 유황 그룹 간의 유의적인 차이가 보이지 않았다.
- 랫드에 처치한 물질은 사료섭취량의 0.2%, 1%, 5% 제독 유황과 사료섭취량의 1% 유황으로 13주 경구투여를 하였다. 제독유황의 안전성을 확인하기 위해 다음과 같은 관찰 및 검사를 하였다.
- 랫드에서 투여기간 중 각 군당 5마리씩의 동물에 대하여 육안 및 검안경을 이용한 안과학적 검사를 실시하였다.
- 모든 동물에 대하여 시험개시일로부터 시험종료일 까지매주 1회 측정하였다.
- 모든 시험동물에 대하여 간, 신장(좌 . 우), 폐, 비장, 심장, 부신(좌 . 우), 뇌, 난소(좌 . 우) 등의 체중에 대한 상대 장기 중량 및 크기를 측정하였다.
- 사육상자별로 당일 급여 및 급수총량과 익일 잔량의 차를 시험개시 후 매주 1회 측정하여 하루 사료섭취량 및 음수섭취량으로 하였다.
- 시험군의 구성은 대조군 (Corn oil), 저용량(하루 사료섭취량의 0.2% 제독유황), 중간용량(하루 사료섭취량의 1% 제독유황), 고용량(하루 사료섭취량의 5% 제독유황), 양성대조군(하루 사료섭취량의 1% 유황)으로 분류하였다.
- 시험기간 중 1일 1회 실시하였고, 일반 임상증상 항목으로서 anorexia, salivation, diarrhea, vomiting, polyuria, anuria, fecal change 의 정도를 기록하였다.
- 시험물질의 제조는 랫드의 하루 사료섭취량의 구하여 계산하였다. 대조군은 용매제인 Corn oil (Sigma Co, Ltd) 을 사용하였고, 저용량은 하루 섭취량의 0.
- 양성대조군은 하루 섭취량의 1%만큼의 유황을 투여하였다. 시험물질의 제조는 체중측정을 기준으로 항상 새롭게 시험물질을 제조하여 투여하였다. 투여는 주 5회(월~금) 일정한 시간에(15:00) 경구투여 하였다.
- 중간용량군은 하루 섭취량의 1%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였으며, 고용량군은 하루 섭취량의 5%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였다. 양성대조군은 하루 섭취량의 1%만큼의 유황을 투여하였다. 시험물질의 제조는 체중측정을 기준으로 항상 새롭게 시험물질을 제조하여 투여하였다.
- 이에 본 실험에서는 제독유황을 사용하여 여러 장기에미치는 영향에 대하여 랫드를 통하여 확인하였다. 제독유황을 투여한 랫드의 몸무게, 사료섭취량, 혈액학적 검사, 조직학적 검사를 통해 제독유황에 대한 독성유무를 판단하기위하여 수행하였다.
- 일반 혈액학적 검사는 혈액자동분석기 (Hemavet 850Fs, CDC tech, USA)를 이용하여 백혈구(WBC), 호중구 (neutrophil), 임파구 (lymphocyte), monocyte, 호산구 (eosinophil), 호염구(basophil), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(hemoglobin), hematocrit, MCV, MCH, MCHC, RDW, platelet, MPV수를 측정하였으며, 혈청생화학적 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심분리(3, 000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 혈청자동분석기(BS-400, MINDRAY, China)를 이용하여 총단백 (total protein), 총 빌리루빈 (total bilirubin), 혈당 (blood fucose), 혈액뇨소질소 (BUN), creatinine, aspartate transaminase(AST), alanine transami- nase(ALT), alkaline phosphatase(ALP), 총 콜레스테롤 (total cholesterol)을 측정하였다. 전해질자동분석장치 (EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium(Na+), potassium(K+), chloride(C『) 를 측정하였다.
- 방혈을 시켰다. 장기중량 측정이 끝난 모든 장기를 10% 중성 포르말린액에 고정시켰고 2주간 충분한 고정을거친 모든 장기조직은 파라핀 포매기 (Shandon Inc, USA) 에 포매하여 마이크로톰(Shadon Inc, USA)으로 5 pim절편을 만들어 hematoxylin & Eosin 염색을 하여 광학현미경 (X 100)으로 관찰하였다.
- 일반 혈액학적 검사는 혈액자동분석기 (Hemavet 850Fs, CDC tech, USA)를 이용하여 백혈구(WBC), 호중구 (neutrophil), 임파구 (lymphocyte), monocyte, 호산구 (eosinophil), 호염구(basophil), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(hemoglobin), hematocrit, MCV, MCH, MCHC, RDW, platelet, MPV수를 측정하였으며, 혈청생화학적 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심분리(3, 000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 혈청자동분석기(BS-400, MINDRAY, China)를 이용하여 총단백 (total protein), 총 빌리루빈 (total bilirubin), 혈당 (blood fucose), 혈액뇨소질소 (BUN), creatinine, aspartate transaminase(AST), alanine transami- nase(ALT), alkaline phosphatase(ALP), 총 콜레스테롤 (total cholesterol)을 측정하였다. 전해질자동분석장치 (EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium(Na+), potassium(K+), chloride(C『) 를 측정하였다. 혈액학적 및 혈청생화학적 검사는 (주) 네오딘벳랩에 의뢰하여 측정하였다.
- 제독유황을 투여한 랫드의 몸무게, 사료섭취량, 혈액학적 검사, 조직학적 검사를 통해 제독유황에 대한 독성유무를 판단하기위하여 수행하였다.
- 2%만큼의 제독 유황을 첨가하여 투여하였다. 중간용량군은 하루 섭취량의 1%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였으며, 고용량군은 하루 섭취량의 5%만큼의 제독유황을 첨가하여 투여하였다. 양성대조군은 하루 섭취량의 1%만큼의 유황을 투여하였다.
- 시험물질의 제조는 체중측정을 기준으로 항상 새롭게 시험물질을 제조하여 투여하였다. 투여는 주 5회(월~금) 일정한 시간에(15:00) 경구투여 하였다.
대상 데이터
- 실험기간 중 사육실 환경 조건은 실내온도 25 ± 5oC, 상대습도 40 ±10%, 환기 횟수 10~12회/hr, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등), 조도는 150~200Lux로 유지하였다. 랫드는 폴리카보네이트제 케이지에서 케이지당 5두씩 사육하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다.
- 실험동물로는 8주령의 Sprague Dawley계통의 암컷 랫드 30마리를 (주)오리엔트바이오(Seong Nam, Gyeong gido,Korea) 에서 구입하여 공주대학교 특수동물학과 실험 동물 실에서 약 1주간 순화시키면서 일반증상을 관찰하여 건강한 동물 25마리를 실험에 사용하였다. 실험기간 중 사육실 환경 조건은 실내온도 25 ± 5oC, 상대습도 40 ±10%, 환기 횟수 10~12회/hr, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등), 조도는 150~200Lux로 유지하였다.
- 황샘바이오(주)에서 제공한 제독유황을 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 13주간 반복투여시험에서 얻은 측정치의 통계학적 분석은 통계처리 computer program인 SAS (Statistical Analysis System) 를 이용하여 등분산 검정 후 one-way ANOVA 에서 유의한 F 값이 관찰되는 항목에 대하여 대조군과 각 용량군 사이에 유의수준 p<0.05로 Dunnetfs t-test를 이용하여 비교하였다. 또한, 병리조직학적으로 관찰된 병변의 발생 빈도는 x2(Chi-square)검정을 하였다.
- 05로 Dunnetfs t-test를 이용하여 비교하였다. 또한, 병리조직학적으로 관찰된 병변의 발생 빈도는 x2(Chi-square)검정을 하였다.
- 랫드의 체중변화는 대조군과 투여군과의 차이를 one-way ANOVA에서 유의차가 인정되는 F값이 관찰될 때 대조군과 각 용량군과 비교하기 위하여 Dunnett’s t-test를 하였으며, 발생병변의 빈도는 x2(Chi-square)검정을 하였다.
이론/모형
- 랫드는 폴리카보네이트제 케이지에서 케이지당 5두씩 사육하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다. 사육 상자는 시험기간, 시험명, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다.
- 전해질자동분석장치 (EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium(Na+), potassium(K+), chloride(C『) 를 측정하였다. 혈액학적 및 혈청생화학적 검사는 (주) 네오딘벳랩에 의뢰하여 측정하였다.
성능/효과
- 13주간 반복 투여 독성시험의 랫드에서 전 시험기간 동안 대조군 및 투여군 모두에서 시험물질에 의한 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 또한 투여용량군 사이의체중변화는 용량의존성을 나타내지 않았다 (Fig.
- 저용량군에서는 AST, ALT, cholesterol, BUN, Na에서 유의적인 차이를 보였으며, 중간용량군에서는 ALT, BUN, Na에서 유의적인 차이를 보였다. 고용량군 에서는 T-bilirubin, glucose, ALT, ALP, cholesterol, BUN, Cl에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다. 양성대조군에서는 ALT, ALP, BUN, Cl에서 유의적인 차이를 보였다.
- 또한 랫드에 간과 신장에서의 병리조직학적 변화를 관찰하였다. 그 결과 체중, 사료 섭취량, 혈액학적 및 병리조직검사 소견에서 대조군과 제독 유황 그룹 간의 유의적인 차이가 보이지 않았다. 혈청 생화학적 검사소견에서는 0.
- 한편, 병리조직학적인 검사에서는 시험 전체 군에서 대조군과 비교시 유의할만한 병리조직이상이 관찰되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 사료섭취량 1%의 제독 유황까지 투여는 랫드에서 독성을 나타내지 않는 것으로 사료된다.
- 따라서, 랫드를 이용한 제독유황의 반복 투여독성시험 결과 하루 사료섭취량의 1% 제독유황을 첨가하여 섭취한 중간용량군까지는 독성을 나타내지 않는 것으로 사료된다.
- 하지만 혈청생화학적 검사에서 고용량군의 ALT, ALP는 간의 손상과 직접적으로 연결되는 수치이므로 이 두 수치의 증가로 판단할 때 간의 질병이나 간암, 황달의 유발이 의심된다. 부검 후 상대장기중량에서도 혈청생화학적 검사의 결과와 마찬가지로 대조군과 비교하였을 때 고용량군의 간이증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 부검시의 혈액학적 검사에 있어서 일부의 혈액 데이터에서 유의적인 차이를 보였다. 저용량군에서는 MCV, MCHC 에서 중간용량군에서는 EOS, Hb, MCH, MCHC, PLT, MPV에서 유의적인 차이를 보였으며, 고용량군에서는 WBC, NEU, LYM, RBC, RDW에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다.
- 시험 기간 중 랫드의 대조군, 저용량군, 중간용량군, 고용량군, 양성대조군의 동물당 평균 하루 사료섭취량은 10.2±0.4,10.1 ±0.3, 10.2 ±0.4, 9.9 ±0.4, 10.4 ± 0.5(g)이었다(data not shown).
- 않았다. 시험결과에 있어서 모든 시험군 및 대조군, 양성대조군에서 특이할만한 임상증상은 관찰되지 않았으며, 폐사 및 빈사 동물은 시험 전기간을 통하여 관찰되지 않았다. 체중 변화에 있어서도 투여기간 중 약물투여에 의한 체중감소는 인정되지 않았다.
- 고용량군 에서는 T-bilirubin, glucose, ALT, ALP, cholesterol, BUN, Cl에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다. 양성대조군에서는 ALT, ALP, BUN, Cl에서 유의적인 차이를 보였다. 저용량과 중간용량, 고용량에서 일부 혈청 생화학적인 수치에서 유의차가 인정되었으나, 용량의존성을 보이지 않았으므로 약물에 기인된 변화는 아닌 것으로 사료되나 고용량군에서 glucose의 감소로 인해 저칼륨혈증, 인슐린 과잉분비, 당질흡수 부전의 질병유발을 의심할 수 있으며, ALT와 ALP의 증가는 간의 질병이나 간암, 황달의 유발이 의심된다(Table 2).
- 저용량군에서는 MCV, MCHC 에서 중간용량군에서는 EOS, Hb, MCH, MCHC, PLT, MPV에서 유의적인 차이를 보였으며, 고용량군에서는 WBC, NEU, LYM, RBC, RDW에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다. 양성대조군에서는 WBC, NEU, LYM, MONO, RBC, MCH, MCHC, PLT, MPV 에서 유의적인 차이를 보였다. 각 항목의 수치들이 대조군과 시험물질간에 유의적인 차이는 있었으나 그 수치가 정상범위 수준에서의 차이로서 독성을 일으키지 않는 범위내에서의 차이로 사료된다.
- 혈청생화학적 검사에 있어서 일부의 항목에서 유의적인 차이를 보였다. 저용량군에서는 AST, ALT, cholesterol, BUN, Na에서 유의적인 차이를 보였으며, 중간용량군에서는 ALT, BUN, Na에서 유의적인 차이를 보였다. 고용량군 에서는 T-bilirubin, glucose, ALT, ALP, cholesterol, BUN, Cl에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다.
- 유의적인 차이를 보였다. 저용량군에서는 MCV, MCHC 에서 중간용량군에서는 EOS, Hb, MCH, MCHC, PLT, MPV에서 유의적인 차이를 보였으며, 고용량군에서는 WBC, NEU, LYM, RBC, RDW에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다. 양성대조군에서는 WBC, NEU, LYM, MONO, RBC, MCH, MCHC, PLT, MPV 에서 유의적인 차이를 보였다.
- 일부 장기에서 유의적인 차이를 보였다. 저용량군에서는 liver, heart, lung, kidney (R, L) 에서 유의적인 차이를 보였으며, 고용량군에서는 liver, spleen, heart, lung, ovary (R),kidney (L) 에서 유의적인 차이를 보였다. 양성대조군에서는 heart, lung, ovary (R), kidney (R, L)에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다(Table 3).
- 특이할만한 소견은 인지되지 않았다. 특히 이상의 결과에서 유의적인 차이를 보인 간에 대한 조직학적 관찰에서 용량의존적인 조직변화가 관찰되지 않았다.
- 대조군과 투여군의 일부 장기에서 유의차가 인정되었으나, 용량의존성을 보이지 않았으므로 약물에 기인된 변화는 아닌 것으로 사료된다. 하지만 혈청생화학적 검사수치와 비교하였을 때 수치가 증가한 고용량군의 ALT, ALP의 결과와 동일하게 장기의 상대 중량비에서도 간의 상대중량비가 가장 많이 증가하였다.
- 그 결과 체중, 사료 섭취량, 혈액학적 및 병리조직검사 소견에서 대조군과 제독 유황 그룹 간의 유의적인 차이가 보이지 않았다. 혈청 생화학적 검사소견에서는 0.2% 및 1% 투여군에서는 대조 군과 비교 시 용량의존적으로 유의적인 차이를 보이는 항목은 보이지 않았으나, 고용량군에서는 glucose 감소에 의한 저칼륨혈증, 인슐린 과잉분비의 독성을 의심할 수 있었으며, 또한 ALT와 ALP의 증가는 간 독성이나 간암, 황달의 유발이 의심되었다. 한편, 병리조직학적인 검사에서는 시험 전체 군에서 대조군과 비교시 유의할만한 병리조직이상이 관찰되지 않았다.
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