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문제 정의
- 따라서 본 실험에서도 본 균주가 추출 가능한 중성 지방구를 대량저장하고 있는 지의 여부를 알아보기 위해 균주를 Nile red 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 Fig. 1과 같다.
제안 방법
- Tube 내부를 질소로 치환한 후 뚜껑을 닫고 혼합하여 70℃의 수조에서 2시간 동안 반응시켜 상온에서 냉각하여였고, 6% K2CO3 5 mL와 toluene 2 mL를 넣어주었다. 1,100 rpm으로 5분 간 원심분리하여 상을 분리하였고, organic 층을 취하여 다른 바이알에 옮긴 다음 Na2SO4로 수분을 제거한 후 GC로 분석하였다.
- 1 mg/mL in acetone)을 세포현탁액에 가하였다 (1：100, v/v). 10분간 염색한 후 형광현미경으로 사진촬영 하였다.
- Chlorophyll의 확인은 chlorophyll로 추정되는 fraction을 용출용매인 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v)로 희석하여 시료액으로 하였고, 이를 분광광도계 (UV-Vis spectrophotometer, Genesys 5, Milton Roy, USA)를 이용하여 400∼700 nm에서 주사 (scanning)하여 얻은 흡수스펙트럼으로부터 확인하였다.
- 그 후 미리 항량을 구하여 둔 칭량병에 원심분리된 상징액 10 mL를 취하여 100∼105℃의 건조오븐에서 30분간 건조하였고 desiccator에서 45분간 방치시킨 후 건조중량을 측정하여 항량을 구하였다.
- 따라서 지표물질인 triacylglycerol만을 분획정제하기 위해 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v) 용매를 사용하여 추출된 지방을 silicic acid column chromatography하고 분획하였으며, 그 결과는 Fig. 6과 같다.
- 또한 triacylglycerol만을 용출시키기 위해 triacylglycero의 용출용매인 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v)를 이용하여 3∼5 mL/min의 속도로 5 mL 씩 분획하고 각 분획별 건조중량을 측정하여 용출되는 지질의 함량을 계산하였다 [24].
- 에 의한 바이오디젤 및 지질 소재화 연구의 일환으로, 이 균주로부터 용매지방을 추출하였고, silicic acid로 칼럼 크로마토그래피하여 분획, 정제하였다. 또한 추출된 지방의 종류와 함량, 지방산의 조성 및 특성 등을 조사하고 다음의 결과를 얻었다.
- 따라서 Scenedesmus sp.를 세포파쇄한 후 chloroform-methanol의 혼합용매 추출법에 의해 지방을 추출하고, 지질함량을 구하였다.
- 총 지질량 100∼300 mg을 칼럼에 주입한 후 2∼3 mL/min의 속도로 흘러나오도록 조절하면서 중성지질은 chloroform 250 mL, 당지질은 acetone 300 mL, 그리고 인지질은 methanol 250 mL로 용출시켜 분획하였다. 분획된 각각의 시료액은 40℃에서 회전진공농축기 (EYELA rotary vacuum evaporator, N-N type, Tokyo Rikakikai Co. Ltd.))로 용매를 제거하고 수분을 증발시킨 후 중량법에 의해 각각의 함량을 계산하였다.
- 지질 추출물 1 mL (건조중량 320 mg)을 칼럼에 주입한 후 2∼3 mL/min의 속도로 흘러나오도록 조절하면서 hexane에 ether 용매를 혼합하고 농도 별 (0%, 2%, 5%, 15% 및 100%)로 분획하였다. 분획한 각각의 시료액은 40℃에서 회전진공농축기로 용매를 제거하고 수분을 증발시킨 후 중량법에 의해 이들 함량을 각각 계산하였다.
- 세 가지 분획 (A, B, C)이 얻어졌으며, 추출된 지방으로부터 서로 색깔이 다른 두 가지 성분이 분획되었다. 즉, tube No.
- 즉, 동결건조한 시료를 생리식염수에 재현탁 (400 rpm, 12 h)하고 일정량 (5 mL)을 취하여 원심분리 (1500 × g, 10 min)한 다음 침전물을 생리식염수로 여러 번 세척하였다. 세포를 수확하고 생리식염수 0.5 mL를 가하여 재현탁하였으며, Nile red 용액 (0.1 mg/mL in acetone)을 세포현탁액에 가하였다 (1：100, v/v). 10분간 염색한 후 형광현미경으로 사진촬영 하였다.
- 본 연구는 미세조류인 Scenedesmus sp.에 의한 바이오디젤 및 지질 소재화 연구의 일환으로, 이 균주로부터 용매지방을 추출하였고, silicic acid로 칼럼 크로마토그래피하여 분획, 정제하였다. 또한 추출된 지방의 종류와 함량, 지방산의 조성 및 특성 등을 조사하고 다음의 결과를 얻었다.
- 따라서 본 연구에서는 Scenedesmus sp.의 biomass를 바이오디젤의 원료로 사용하거나 이의 지질 소재화를 위한 자료를 구축하기 위하여 중성지질 함량 및 조성 등을 조사하였고, 지방 추출물의 몇몇 특성을 TLC와 silicic acid의 column chromatography를 통한 분획 및 정제 실험을 통하여 조사, 검토하였다.
- sp.의 동결건조시료를 용매추출하고 이 추출물을 두 가지 방법 즉, Procedure A 및 B의 방법으로 지방산을 분석하였다. 그 결과는 Fig.
- 이때, column은 HP-INNOWAX (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)를 사용하였고, flame ionization detector (FID)를 사용하였으며, 온도 프로그램은 다음과 같이 실시하였다.
- 이를 질소가스로 pentane을 제거한 후 즉시 n-hexane 50 μL로 녹인 다음 GC로 분석하였다.
- 즉 시료지질을 HPTLC plate (10 × 10, Merck, Darmstadt, Germany)에 표준물질 (mono-, di- 및 tri-glyceride mix, Supelco., USA)과 함께 spotting하여 benzene：diethyl ether：ethyl acetate : acetic acid (80：10：10：0.2, v/v)의 전개용매로 전개시킨 후 요오드 증기를 발색제로 발색하고 표준물질의 Rf값과 비교하여 지질성분을 확인하였다.
- Hexane과 diethyl ether 용매를 stepwise로 혼합하여 사용하는 방법 [23]을 이용하여 추출된 지방을 분획하였다. 즉, silicic acid는 상기방법과 같이 활성화하였고 18 g을 칭량하여 hexane：ether (1：10, v/v)로 slurry를 만들었다. 이를 기포가 혼입되지 않도록 하면서 glass column (i.
- 지방산 조성은 다음의 두 가지 방법 (Procedure A 및 B)으로 시료를 처리하고 GC (HP 6890 Series/Hewlett Packard, U.S.A)로 분석하였다. 이때, column은 HP-INNOWAX (30 m × 0.
- 지방추출액 중의 지질종류의 비율을 알아보기 위해 silicic acid에 의해 column chromatography하고 chloroform, acetone 및 methanol로 극성도를 증가시켜 용출하여 각각으로부터 중성지질, 당지질 및 인지질을 분획하였다. 각각을 회전진공 농축기로 용매를 제거한 후 얻어진 각 분획의 총 지질 중의 함량을 구하였으며, 그 결과는 Table 2와 같다.
- 지질 추출물 1 mL (건조중량 320 mg)을 칼럼에 주입한 후 2∼3 mL/min의 속도로 흘러나오도록 조절하면서 hexane에 ether 용매를 혼합하고 농도 별 (0%, 2%, 5%, 15% 및 100%)로 분획하였다.
- 즉, 일정량 (3 g)의 시료를 용량 250 mL의 환저 플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 chloroform：methanol (2：1, v/v) 용매 60 mL를 첨가하여 냉각관에 연결한 후 65℃의 수조에서 1시간 동안 추출하였다. 추출 후 냉각관으로부터 플라스크를 분리하여 추출 혼합액을 여지 (Advantec, No.2)로 여과한 다음 chloroform : methanol (2：1, v/v) 용매 5 mL로 3회 세정하였다. 추출 혼합액을 65℃로 유지한 수조에서 용매를 증산시킨 후 석유에테르 25 mL를 가하여 무수황산 나트륨 15 g을 첨가하였고 1분간 흔들어 섞은 후 석유 에테르 층을 원심분리 (3000 × g, 5분)하였다.
- 추출한 지방성분은 TLC로 확인하였다. 즉 시료지질을 HPTLC plate (10 × 10, Merck, Darmstadt, Germany)에 표준물질 (mono-, di- 및 tri-glyceride mix, Supelco.
대상 데이터
- 본 실험의 균주는 Scenedesmus sp.이며, 조절된 조건하에서 배양한 배양액을 원심분리 (3000 rpm, 10 min)하여 균체를 수확한 후 동결건조하고 분쇄 (100 mesh)한 것을 한국해양수산연구원으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 동결건조시료는 밀봉하여 4℃의 냉장실에 보관하면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- Folch 법 [18]에 따라 CHCl3：methanol (2：1, v/v)을 용매로 하여 지방을 추출한 후, 얻어진 지방을 다음과 같이, acid catalyzed esterification하였다 [19]. 즉, screw-capped glass tube에 Folch 법 [18]으로 추출한 지방추출물 10 mg을 넣고 BF3/methanol 1 mL를 넣어주었다.
- Hexane과 diethyl ether 용매를 stepwise로 혼합하여 사용하는 방법 [23]을 이용하여 추출된 지방을 분획하였다. 즉, silicic acid는 상기방법과 같이 활성화하였고 18 g을 칭량하여 hexane：ether (1：10, v/v)로 slurry를 만들었다.
- Sukhija와 Palmquist의 방법 [20]에 따라 10∼50 mg의 지방을 함유하는 시료를 뚜껑이 테프론 screw cap인 tube에 넣고 toluene 1 mL와 5% methanolic HCl (acethyl chloride：methanol (5：100, v/v))을 넣어주었다.
- 농축한 시료를 Rouser의 방법 [22]에 의해 silicic acid column chromatography하고 중성지질, 당지질 및 인지질로 분리하였다. 100∼200 mesh의 silicic acid (Sigma-Aldrich Inc.
- 미세조류 세포내의 지방구 (lipid droplet)를 검출하기위하여 세포를 Matsunaga 등 [21]의 방법에 따라 Nile red (9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-one) 염색하고 형광현미경 (Fluorescence microscope/Eclipe 50i, Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 즉, 동결건조한 시료를 생리식염수에 재현탁 (400 rpm, 12 h)하고 일정량 (5 mL)을 취하여 원심분리 (1500 × g, 10 min)한 다음 침전물을 생리식염수로 여러 번 세척하였다.
- 지방 함량의 측정은 chloroform-methanol 혼합용매 추출법 [18]으로 실시하였다. 즉, 일정량 (3 g)의 시료를 용량 250 mL의 환저 플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 chloroform：methanol (2：1, v/v) 용매 60 mL를 첨가하여 냉각관에 연결한 후 65℃의 수조에서 1시간 동안 추출하였다.
성능/효과
- 용출분획은 크게 A∼E의 5개 분획으로 나눌 수 있었다. 0% ether 용매에서 용출된 peak A, B 분획은 TLC로 확인한 결과, triacylglycerol이 검출되었다. 그러나 2∼15%의 ether 용매로 용출된 분획 (C)에서는 많은 peak를 보였으나 지방함량은 매우 낮았다.
- 지표물질인 triacylglycerol만을 분리정제 하기위해 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v) 용매를 사용하여 분획한 결과, 지표물질인 triacylglycerol이 노란색의 분획으로 분획되었다. TLC로 확인되었으며, 그 함량은 12.63%였다. 반면, triacylglycerol보다 앞서 분획된 녹색의 분획은 chlorophylla인 것으로 확인되어 부가가치 높은 co-product로서 기대되었으며, 그 함량은 49.
- TLC한 결과, 역시 Fig. 6에서 보는 바와 같이, 지표물질인 triacylglycerol은 분획 B의 tube No. 7∼9에서만 확인되었으며, 그 함량은 12.63%이었다.
- 의 포화 및 불포화 지방산을 함유하였다. 검출된 peak 중 standard에 속하지 않은 두 개의 peak는 fatty acid standard의 GC 분석 그래프에서 retention time을 비교한 결과, 각각 C16：2 및 C18：2 지방산인 것으로 확인하였다. 매우 긴사슬길이를 갖는 C20 이상의 지방산은 미량에 불과하였고, EPA (eicosapentaenoic acid), DHA (decosahexaenoic acid)와 같은 다가 불포화지방산도 함유하지 않았다.
- 균주는 다른 미세조류에 비해 지방함량이 높고, 디젤화에 필요한 추출 가능한 중성지질을 함유하며, 지방산 조성도 매우 긴 사슬 (≥ C20)의 지방산을 함유하지 않고 C18:3의 함량이 낮은 C16 및 C18의 주요 조성을 보여 바이오디젤의 소재원으로의 잠재력을 갖는 것으로 판단하였다.
- 그러나 각 분획을 TLC한 결과 (Fig. 4), 그림에서 볼 수 있는 바와 같이, 중성지질 분획에서는 중성지질 이외의 다른 화합물이 혼재하는 것이 관찰되었다. Kates [31]에 의하면 이 chloroform 용출분획에는 hydrocarbon, 색소 (carotenoid, chlorophyll), sterol, 유리지방산 등이 함유된다.
- 그러므로 본 균주는 녹조류의 평균값 범위의 비교적 높은 지방함량과 추출 가능한 중성 지방구를 다량 함유하는 것으로 판단하였다.
- 따라서 Table 1에서 검출된 총 지방산을 포화 및 불포화지방산으로 나누어 그 함량비율을 계산한 결과, acid catalyzed esterification (procedure A) 처리시의 불포화지방산은 포화지방산에 비해 약 3.8 배나 많았고 one step methylation (procedure B)으로 처리시에는 약 4.6배의 많은 함량으로 검출되었다.
- 중성지질은 저장지질인 반면, 당 및 인지질은 세포벽에 포함된 구조지질인데, 통상 동물 및 미생물의 극성지질 비율은 60∼85%이다 [31]. 따라서 본 균주의 중성지질 비율 28.1%는 비교적 높은 수준이며, 고지질 함량의 미세조류로 알려진 I. galbana (26.5%)나 P. tricornutum (23.2%)보다 다소 높은 것을 알 수 있다 [32,33]. 하지만 막 지질의 TAG 전환 등에 의해 중성지질의 함량을 높일 필요가 있다고 생각된다 [14].
- 또한 시료로부터 지방을 추출하여 methyl ether화한 acid catalyzed esterification에 비해 시료의 지방추출과 methyl ether화를 동시에 처리한 one step methylation의 지방산 함량을 비교해 보면, A 방법의 경우는 지방산의 총 함량이 93.21%인 반면, B 방법에서는 90.38%로 미미하나 A 방법으로 처리하였을 때의 지방산 함량이 다소 높았다.
- 이상의 결과에서 Scenedesmus sp.로부터 생성된 바이오디젤은 불포화 지방산의 함량이 높아 저온 유동성이 좋으나 산화 안정성이 다소 낮을 것으로 생각되었다.
- sp.로부터 추출된 지방을 TLC하였으며, 그 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이, mono-, di- 및 triglyceride standard의 Rf 값과 비교하였을 때, mono-, di-acylglyceride는 검출되지 않았으나 triacylglycerol 성분의 검출은 확인되었다.
- 63%였다. 반면, triacylglycerol보다 앞서 분획된 녹색의 분획은 chlorophylla인 것으로 확인되어 부가가치 높은 co-product로서 기대되었으며, 그 함량은 49.47%로 매우 높았다.
- 세포 안쪽에 넓은 부위의 노란색과 붉은 색의 바깥 테두리 부위가 모두 확인되어 시료는 hydrocarbon을 포함하는 지방과 triglyceride 및 극성지방을 모두 함유하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 재확인하기 위해 Scenedesmus.
- )이었다. 이 중 TLC에 의해 biodiesel 생산의 주요 원료물질인 triacylglycerol이 mono- 및 di-acylglyceride의 검출없이 확인되었다. 추출된 지방을 GC로 분석한 결과, 10종의 C16∼C22 포화 및 불포화 지방산을 함유하였고, 그 함량의 순서는 C18：2 > C16：2 > C16：0 > C18：3로 바이오디젤의 품질규격에 적합한 지방산조성분포를 나타내었다.
- 조지방의 총 질량에 따른 각 분획의 함량은 당지질이 52.642%로 가장 높았고, 중성지질 및 인지질은 각각 28.10% 및 19.26%이었다.
- 지질함량은 21.38 ± 1.03% (w/w, d.b.)로, Scenedesmus quadricauda의 1.9%나 Scenedesmus obliquus의 12∼14%보다는 높았으나 Scenedesmus dimorphus에서 보고된 16∼40%와 비교 하였을 때는 낮은 값 수준이었고 [6,17], 통상 총 균체중량의 상당량이 무기회분 중량임을 고려한다 하더라도 다소 낮은 값 범위이었다.
- 26%로 가장 낮았다. 지표물질인 triacylglycerol만을 분리정제 하기위해 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v) 용매를 사용하여 분획한 결과, 지표물질인 triacylglycerol이 노란색의 분획으로 분획되었다. TLC로 확인되었으며, 그 함량은 12.
- 추출된 지방을 GC로 분석한 결과, 10종의 C16∼C22 포화 및 불포화 지방산을 함유하였고, 그 함량의 순서는 C18：2 > C16：2 > C16：0 > C18：3로 바이오디젤의 품질규격에 적합한 지방산조성분포를 나타내었다.
- 6배의 많은 함량을 보여 저온유동성은 좋으나 산화 안정성이 다소 낮을 것으로 예상되었다. 한편, 추출된 지방을 silicic acid에 의한 column chromatography로 분획 및 정제한 결과, 총 질량에 따른 당지질의 함량은 52.64%로 가장 높았고, 이어서 중성지질이 28.10%이었으며, 인지질은 19.26%로 가장 낮았다. 지표물질인 triacylglycerol만을 분리정제 하기위해 n-hexane-diethyl ether (95：5, v/v) 용매를 사용하여 분획한 결과, 지표물질인 triacylglycerol이 노란색의 분획으로 분획되었다.
후속연구
- 그러나 영양분이 결핍되면 2배나 증가한다고 하였다. 따라서 본 균주의 지방함량을 향상시키기 위해서는 질소원 결핍이나 염도증가 조건 등 배양조건의 검토가 뒤따라야 할 것으로 생각되었다.
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