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제안 방법
- , Merck, Berlin, Germany)의 전개 시작점에 시료를 수 마이크로리터 주입하고 건조시킨 후 전개용매로 n-butanol：acetic acid：water (12：3：5)를 사용하여 밀폐용기에서 전개시킨 후 꺼내어 상온에서 건조시켰다. 건조된 TLC판에 아세톤에 용해된 ninhydrin 용액 0.25% (w/v)를 분무하고 110℃에서 5분 간 가열한 후 전개된 스팟을 관찰하였다. 반응액 혹은 용출액을 건조시킨 후 KBr 분말과 혼합하여 시료를 준비하고 FT-IR (FT/IR-3000, Bio-Rad, Cambridge, UK)을 이용하여 적외선영역에서의 스펙트럼을 관찰하여 반응여부를 확인한다.
- 8%로 나타났다. 고농도의 pH 9인 인산완충용액으로 용출된 분획이 글리세릴 펩타이드인지 확인하기 위하여 건조시킨 후 시료를 FT-IR을 사용하여 분석하였다 (Fig. 4). 피브로인 펩타이드 시료의 FT-IT 스펙트럼에서 amide I과 II는 1643 및 1522 cm-1에서 관찰되었고 카복실기는 1390 cm-1가 현저하게 사라지고 1200 cm-1이하에서 흡광도가 증가에서 관찰되었다.
- 4배와 39배에 해당되어 역반응인 글리세릴 에스터 결합을 촉진시킬 수 있을 것으로 추정하였다. 그러나 생성물의 TLC 스팟의 크기에는 큰 변화가 없는 반면 반응액의 점도를 증가시키므로, 이후 실험에서는 글리세롤의 농도를 50%로 고정하여 에스터화 반응을 진행하였다.
- C18 reverse phase 칼럼을 사용하여 반응물과 생성물의 시료의 크로마토그램을 얻었으나, 펩타이드 혼합물이 각각의 펩타이드의 피크로 완전하게 분리되는 조건을 찾을 수 없었다. 따라서 acetonitrile의 조성을 변화시켜 혼합물이 분리되지 않는 조건에서 얻어진 각각의 시료의 단일 피크의 정점에서 조성물의 질량 스펙트럼을 분석하였다 (Fig. 1). 피브로인 펩타이드의 질량 스펙트럼에는 피브로인에서 빈번하게 출현하는 디펩타이드 (dipeptide)인 AG, VG 및 YG의 [M+H]+에 해당하는 피크가 147.
- 반응 후 시료의 질량 스펙트럼은 글리세릴 펩타이드와 미반응 펩타이드가 섞여 있음을 보여주고 있다. 따라서 글리세릴 펩타이드가 C말단에 글리세릴 에스터를 형성하여 중성 pH에서 양전하를 가지는 특성을 활용하여, 양이온교환수지 칼럼을 사용하여 미반응된 펩타이드와 글리세릴 펩타이드를 분획하였다 (Fig. 3). 시료를 주입한 후 중성 인산완충용액으로 200 mL을 흘려주며 5 mL 단위로 분획물을 얻었고 이중 20에서 70 mL까지의 분획시료에서 214 nm에서 높은 흡광도를 가지는 피크가 관찰되었다.
- 이 결과는 글리세롤이 50% 포함된 낮은 pH의 반응조건하에서도 피브로인 펩타이드가 더욱 가수분해 되었거나 글리세롤 에스터화 반응이 펩타이드 가수분해와 동시에 일어날 수 있음을 의미한다. 따라서 반응전 시료의 주요 펩타이드에 해당하는 피크의 크기 및 반응후에 남아있는 미반응 펩타이드 및 글리세릴 에스터 펩타이드에 해당하는 피크의 크기를 비교하였다 (Fig. 2). 반응전의 시료의 질량스펙트럼에서는 AG, AGAG, AGAGAG 및 AGAGAGAG에 해당하는 피크의 크기가 점차적으로 감소하였다.
- 따라서 본 연구에서는 피브로인 펩타이드를 효소적으로 수식하여 펩타이드 글리세리드를 합성하는 중간단계로 파파인을 이용하여 글리세롤 에스터화 반응을 통하여 피브로인 펩타이드의 글리세릴 에스터를 합성하는 반응을 수행하였다. 특히 파파인은 펩타이드 가수분해 활성뿐만 아니라 에스터 분해효소 (esterase)의 활성을 동시에 가지고 있으므로 [6], 효소적으로 에스터를 합성하는데 사용되어 왔다.
- 따라서 본 연구에서는, 파파인으로 가수분해된 피브로인 펩타이드에 추가적으로 글리세롤을 공급하고 반응조건을 변화시켜 피브로인 펩타이드에 글리세릴 에스터 결합을 형성시키는 역반응을 시도하였다. 에스터 결합을 형성하기 위해서는 카복실기가 해리되지 않은 상태에서 -COOH의 OH기가 효소의 활성부위의 아미노산의 잔기와 수소결합을 형성한 후 분리되어야 하므로, 에스터화 반응은 펩타이드의 카복실기의 pKa 값보다 충분히 낮은 pH 3에서 과량의 글리세롤을 첨가하여 반응시키고 각각의 펩타이드의 글리세릴 에스터의 생성 여부는 전기분무 이온화형 질량분석기 (ESI-MS)를 이용하여 분석하였다.
- 예를 들어 당화 헤모글로빈 펩타이드의 당화도를 질량분석기를 이용하여 분석할 때 당화 펩타이드의 이온화 효율이 달라져 정량적인 비교를 위하여 이온화 효율의 보정이 필요하였다 [14]. 따라서 펩타이드의 글리세릴 에스터 역시 이온화 효율이 달라질 것으로 예상되므로 생성물의 조성 또한 정량적인 비교는 정확하지 않으므로 기존의 펩타이드의 조성 스펙트럼의 개별 피크들의 증감을 비교하여 반응전과 반응후의 조성물의 변화를 관찰하였다.
- 반응 전후의 시료의 질량스펙트럼에서 주요 펩타이드에 해당하는 피크의 크기를 비교하여 펩타이드의 조성의 변화 및 반응 후 생성물의 조성을 분석하였다. 펩타이드는 질량분석기에서 이온화되는 효율이 서로 달라 정량적인 비교가 어렵다.
- 반응물의 펩타이드의 조성을 확인하기 위하여 액체크로마토그래프와 전기분무 이온화 질량분석기 (LC-ESI-MS) (LCMS-2010, Shimidzu, Japan)를 사용하였다. 액체 크로마토그래피 칼럼은 C18 역상칼럼 (AlltimaTM HP C18, 150 × 2.
- 25% (w/v)를 분무하고 110℃에서 5분 간 가열한 후 전개된 스팟을 관찰하였다. 반응액 혹은 용출액을 건조시킨 후 KBr 분말과 혼합하여 시료를 준비하고 FT-IR (FT/IR-3000, Bio-Rad, Cambridge, UK)을 이용하여 적외선영역에서의 스펙트럼을 관찰하여 반응여부를 확인한다.
- 본 연구에서는 파파인으로 가수분해된 피브로인 펩타이드에 글리세롤을 추가하고 동일한 효소인 파파인을 이용하여 글리세릴 에스터 결합을 형성시키는 반응을 수행하였다. 피브로인 펩타이드 10%와 글리세롤 50% 포함된 반응용액을 pH 3, 40℃의 반응 조건에서 글리세릴 에스터가 생성됨을 ESI 질량분석을 통하여 확인하였다.
- 따라서 본 연구에서는, 파파인으로 가수분해된 피브로인 펩타이드에 추가적으로 글리세롤을 공급하고 반응조건을 변화시켜 피브로인 펩타이드에 글리세릴 에스터 결합을 형성시키는 역반응을 시도하였다. 에스터 결합을 형성하기 위해서는 카복실기가 해리되지 않은 상태에서 -COOH의 OH기가 효소의 활성부위의 아미노산의 잔기와 수소결합을 형성한 후 분리되어야 하므로, 에스터화 반응은 펩타이드의 카복실기의 pKa 값보다 충분히 낮은 pH 3에서 과량의 글리세롤을 첨가하여 반응시키고 각각의 펩타이드의 글리세릴 에스터의 생성 여부는 전기분무 이온화형 질량분석기 (ESI-MS)를 이용하여 분석하였다. 아울러 생성된 글리세릴 에스터는 카복시 말단이 에스터화되어 중성용액에서 양전하를 띠는 점을 활용하여 이온교환수지 칼럼을 이용하여 회수하였다.
- 에스터화 반응을 통하여 글리세릴 펩타이드가 제조되었는지 확인하기 위하여 LC-ESI-MS를 사용하여 반응 전 후의 시료를 분석하였다. C18 reverse phase 칼럼을 사용하여 반응물과 생성물의 시료의 크로마토그램을 얻었으나, 펩타이드 혼합물이 각각의 펩타이드의 피크로 완전하게 분리되는 조건을 찾을 수 없었다.
- 파파인으로 가수분해된 피브로인 펩타이드를 농도가 각각 50, 60, 70, 80 및 90%의 글리세롤 용액에 최종농도 10% (w/v)이 되도록 녹이고 반응시킨 후 TLC를 이용하여 글리세릴 에스터 반응을 모니터 하였다. 글리세롤이 첨가되지 않은 대조시료에서 관찰되지 않는 새로운 스팟 (Rf = 0.
- 본 연구에서는 파파인으로 가수분해된 피브로인 펩타이드에 글리세롤을 추가하고 동일한 효소인 파파인을 이용하여 글리세릴 에스터 결합을 형성시키는 반응을 수행하였다. 피브로인 펩타이드 10%와 글리세롤 50% 포함된 반응용액을 pH 3, 40℃의 반응 조건에서 글리세릴 에스터가 생성됨을 ESI 질량분석을 통하여 확인하였다. 아울러 반응전 시료의 펩타이드의 조성과 생성된 글리세릴 펩타이드 에스터의 조성으로부터 헥사 및 옥타펩타이드의 비율은 감소하였고 디펩타이드와 테트라펩타이드의 글리세릴 에스터가 반응 생성물을 주로 구성되어 있으며 특히 AG-OGl의 조성이 증가하였음을 확인하였다.
- 합성된 글리세릴 펩타이드를 회수하기 위하여 약산성 이온교환수지인 CM-Sepharose CL-6B 100 (Sigma, USA)을 인산완충용액 (KH2PO4 10 mM, pH 7)에서 수화시킨 후 일회용 칼럼 (polypropylene, 20 x 150 mm)에 40 mL을 충진하고 동일한 완충용액을 주입하여 평형상태를 만들었다. 여기에 pH 7로 조절된 시료를 칼럼의 상단에 투입하고 스며들게 한 후 200 mL의 인산완충용액을 주입하여 흘려주면서 5 mL씩 시료를 취하고 이후 용출용액 (KH2PO4 200 mM, pH 9)을 주입하고 칼럼에서 배출되는 용액을 분획하여 회수하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 피브로인 펩타이드는 고농도의 염용액으로 가용화시킨 재생피브로인을 파파인으로 가수분해하여 제조하였다 [3]. 파파인 (crude papain, 1 U/mg), dithiothreitol, formic acid, trifluoroacetic acid (TFA) 및 acetonitrile은 Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA)에서 구매하였다.
- 실리카 겔 TLC판 (Silica gel 60 F254, Merck, Berlin, Germany)의 전개 시작점에 시료를 수 마이크로리터 주입하고 건조시킨 후 전개용매로 n-butanol：acetic acid：water (12：3：5)를 사용하여 밀폐용기에서 전개시킨 후 꺼내어 상온에서 건조시켰다. 건조된 TLC판에 아세톤에 용해된 ninhydrin 용액 0.
- 본 실험에 사용된 피브로인 펩타이드는 고농도의 염용액으로 가용화시킨 재생피브로인을 파파인으로 가수분해하여 제조하였다 [3]. 파파인 (crude papain, 1 U/mg), dithiothreitol, formic acid, trifluoroacetic acid (TFA) 및 acetonitrile은 Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA)에서 구매하였다.
이론/모형
- 질량분석기는 양이온 모드에서 50에서 2000 m/z까지 스캔하여 질량스펙트럼을 얻었다. 펩타이드의 이론 분자량 및 질량은 펩타이드 질량 계산소프트웨어 (peptide mass calculator V3.2)를 사용하여 계산하였다 [12].
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