Apple Scar Skin viroid 발생상황 및 Real-time RT-PCR을 이용한 상대정량 분석 Occurrence of Apple Scar Skin viroid and Relative Quantity Analysis Using Real-time RT-PCR원문보기
우리나라 사과 및 배 주산단지 12개 지역을 대상으로 ASSVd에 대한 진단 결과, 사과 및 배나무 전체 1,193주에서 20주가 바이로이드가 검출되어 1.7%의 이병율을 나타내었다. 품종별 감염상황을 살펴본 결과, 사과는 '홍로' 품종이 이병율이 3.6%로 타 품종에 비해 많이 감염되어 있음을 알 수 있었다. 국내에서 확인된 후지 등 주요 품종에서의 ASSVd 병징은 주로 과피 얼룩반점 증상이었으나, 후지품종 과피에 발생한 코르크(corking) 반점증상이 ASSVd 감염과 연관된 것으로 새롭게 확인하였다. 본 증상은 앞으로 유관으로 바이로이드 감염여부를 판단하는 중요한 지표가 될 것으로 판단된다. ASSVd에 감염된 사과를 대상으로 real time RT-PCR을 이용하여 ASSVd을 진단하고 시료간 상대 정량값을 분석하였다. real time RTPCR은 기존 RT-PCR에 비하여 전기영동이 필요없이 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적었다. 특히 시료 간에 상대적인 정량값을 알 수 있기 때문에 시료를 비교 분석하는데 유효하다.
우리나라 사과 및 배 주산단지 12개 지역을 대상으로 ASSVd에 대한 진단 결과, 사과 및 배나무 전체 1,193주에서 20주가 바이로이드가 검출되어 1.7%의 이병율을 나타내었다. 품종별 감염상황을 살펴본 결과, 사과는 '홍로' 품종이 이병율이 3.6%로 타 품종에 비해 많이 감염되어 있음을 알 수 있었다. 국내에서 확인된 후지 등 주요 품종에서의 ASSVd 병징은 주로 과피 얼룩반점 증상이었으나, 후지품종 과피에 발생한 코르크(corking) 반점증상이 ASSVd 감염과 연관된 것으로 새롭게 확인하였다. 본 증상은 앞으로 유관으로 바이로이드 감염여부를 판단하는 중요한 지표가 될 것으로 판단된다. ASSVd에 감염된 사과를 대상으로 real time RT-PCR을 이용하여 ASSVd을 진단하고 시료간 상대 정량값을 분석하였다. real time RTPCR은 기존 RT-PCR에 비하여 전기영동이 필요없이 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적었다. 특히 시료 간에 상대적인 정량값을 알 수 있기 때문에 시료를 비교 분석하는데 유효하다.
Apple scar skin viroid (ASSVd) is one of the smallest viral pathogens infecting fruits, especially apple, and causes a significant damage to fruit trees. ASSVd usually induced the skin-dapple ring symptoms, but in 'Fuji' varieties, corked spot were occurred on the fruit skin in 2009. This new sympto...
Apple scar skin viroid (ASSVd) is one of the smallest viral pathogens infecting fruits, especially apple, and causes a significant damage to fruit trees. ASSVd usually induced the skin-dapple ring symptoms, but in 'Fuji' varieties, corked spot were occurred on the fruit skin in 2009. This new symptom will be of great helpful to diagnosis ASSVd in sight. ASSVd was surveyed in apple and pear from 2009 to 2010 in Korea, and ASSVd was identified in 20 out of 1,193 trees. The infection rate was 1.7%. To screen the infectivity of ASSVd among apple cultivars, real-time RT-PCR was applied followed by designing of ASSVd specific primers based on highly conserved regions of several ASSVd isolates including Korean isolate. NADH dehydrogenase subunit 5 (nad 5) gene, which is mRNA of the mitochondrial gene, was used for internal control. In this study, ASSVd infected apples were classified into 12 groups depending on different symptoms and symptom severity (scaring, rusting or malformation). Taken together, this study suggested that real-time PCR analysis was more sensitive to detect the low copy of ASSVd on early viroid infected apple skins than regular RT-PCR method.
Apple scar skin viroid (ASSVd) is one of the smallest viral pathogens infecting fruits, especially apple, and causes a significant damage to fruit trees. ASSVd usually induced the skin-dapple ring symptoms, but in 'Fuji' varieties, corked spot were occurred on the fruit skin in 2009. This new symptom will be of great helpful to diagnosis ASSVd in sight. ASSVd was surveyed in apple and pear from 2009 to 2010 in Korea, and ASSVd was identified in 20 out of 1,193 trees. The infection rate was 1.7%. To screen the infectivity of ASSVd among apple cultivars, real-time RT-PCR was applied followed by designing of ASSVd specific primers based on highly conserved regions of several ASSVd isolates including Korean isolate. NADH dehydrogenase subunit 5 (nad 5) gene, which is mRNA of the mitochondrial gene, was used for internal control. In this study, ASSVd infected apples were classified into 12 groups depending on different symptoms and symptom severity (scaring, rusting or malformation). Taken together, this study suggested that real-time PCR analysis was more sensitive to detect the low copy of ASSVd on early viroid infected apple skins than regular RT-PCR method.
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문제 정의
한편 노출된 RNA로 이루어진 바이로이드는 높은 배율의 현미경을 이용하더라도 진단이 어려워 분자생물학적 진단 체계를 이용하는 것이 가장 효율적이다. 따라서 본 연구는 RT-PCR을 이용하여 2009년부터 2010년까지 2년간 국내 사과 및 배나무에 대한 ASSVd에 대한 감염상황을 보고하고, real time RT-PCR을 이용한 ASSVd 진단 방법을 체계화하여 시료간 ASSVd의 정량값에 근거한 발병 정도를 진단하기 위한 기초자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
ASSVd에 감염된 사과를 대상으로 real time RT-PCR을 이용하여 ASSVd을 진단하고 시료간 상대 정량값을 분석하였다(Table 3, Fig. 3). 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 증폭곡선과 Ct (Threshold Cycle) 값을 산출한 후 Ct값과 초기 RNA량 간의 직선그래프인 검량선을 작성하였다(R2=0.
본 증상은 앞으로 유관으로 바이로이드 감염여부를 판단하는 중요한 지표가 될 것으로 판단된다. ASSVd에 감염된 사과를 대상으로 real time RT-PCR을 이용하여 ASSVd을 진단하고 시료간 상대 정량값을 분석하였다. real time RTPCR은 기존 RT-PCR에 비하여 전기영동이 필요없이 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적었다.
RT-PCR 반응은 추출한 RNA 1 µl을 주형으로 하였으며, 프라이머 염기서열은 Lee 등(2001)이 발표한 특이적 프라이머를 사용하였다(AS3 프라이머, 5'-CCCGGTAAAC ACCGTGCGG-3', AS4 프라이머, 5'-ACCGGGAAACACC TATTGTG-3').
RT-PCR에 의한 바이로이드 검정.
standard curve를 위해 positive 샘플을 10−1,10−2, 10−3로 희석하였으며, 각각의 샘플들은 20배로 희석하여 PCR을 수행하였다.
각 시료는 이병조직 0.2 g씩 잘라 최종적으로 50 µl의 H2O에 녹인 후 RT-PCR의 주형으로 사용하였다.
검정할 식물의 total RNA는 Nucleic acid extractor(easy MAC, BIOMERIEUX)를 이용하여 추출하였다. 각 시료는 이병조직 0.
국내 사과 및 배 재배품종을 대상으로 ASSVd 바이로이드의 감염정도를 조사코자 기존에 알려진 프라이머(Lee 등, 2001)를 제작하여 RT-PCR로 검정하였다. 각각의 프라이머로 증폭된 DNA 산물의 크기는 331 bp였다.
상대 정량값은 우선 시료별 ASSVd 유전자 발현량을 측정한 후 이에 따른 reference gene (house keeping gene)인 nad5에 대한 유전자 발현량으로 나누어 각각의 값을 보정하였다. 그리고 상대정량은 보정값 중에서 가장 높은 positive 값을 1로 두고 나머지 시료들에 대한 값을 환산하여 측정하였다.
3). 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 증폭곡선과 Ct (Threshold Cycle) 값을 산출한 후 Ct값과 초기 RNA량 간의 직선그래프인 검량선을 작성하였다(R2=0.97). 상대 정량값은 우선 시료별 ASSVd 유전자 발현량을 측정한 후 이에 따른 reference gene (house keeping gene)인 nad5에 대한 유전자 발현량으로 나누어 각각의 값을 보정하였다.
97). 상대 정량값은 우선 시료별 ASSVd 유전자 발현량을 측정한 후 이에 따른 reference gene (house keeping gene)인 nad5에 대한 유전자 발현량으로 나누어 각각의 값을 보정하였다. 그리고 상대정량은 보정값 중에서 가장 높은 positive 값을 1로 두고 나머지 시료들에 대한 값을 환산하여 측정하였다.
조건은 42℃, 30분→94℃, 10분→[95℃, 30초→50℃ or 55℃, 1분→72℃,1분 30초] 35회 처리하였으며 final extension은 72℃에서 5분 처리하였다.
RT-PCR에 의한 바이로이드 검정을 위한 시료채집은 2009년 5월부터 2010년 10월까지 우리나라 사과 주산단지인 경기 포천, 충남 충주, 예산, 경북 안동, 영주, 포항지역 등 6지역, 배 주산단지인 경기 남양주, 안성, 충남 천안, 전남 나주, 울산, 경북 상주지역 등 6지역, 전체 12지역에서 10~20점을 무작위로 채집하여 −80℃에 보존하면서 바이로이드 검정에 사용하였다(Fig. 1).
1). 그리고 real time RT-PCR을 위한 바이로이드 진단 및 정량분석을 위한 시료채집은 경북 의성 및 전북 장수지역에서 ASSVd 증상을 뚜렷하게 나타내는 사과나무를 대상으로 시료를 채취하여 사용하였다.
이론/모형
O로 20 µl로 맞춘 후, mixture를 42℃에서 60분, 70℃에서 15분 heating하였다. 바이로이드의 정량분석을 위한 real-time PCR 반응은 ABI 7500 fast real-time PCR machine (Applied BioSystems)을 이용하였다. 96-well plate에 SYBR® Premix Ex Taq (2x, Takara) 10 µl, forward primer 0.
성능/효과
12개 시료를 분석한 결과, 동녹 증상을 보인 8번 시료가 0.320±0.018로 타 시료에 비해 가장 높았으며, 반대로 기형과 증상을 보인 5번 시료는 0.019±0.004로 제일 낮았다.
국내에서 확인된 후지 등 주요 품종에서의 ASSVd 병징은 주로 과피 얼룩반점 증상이었으나, 후지품종 과피에 발생한 코르크화 반점증상이 ASSVd 감염과 연관된 것으로 새롭게 확인하였다(Fig. 2). 이 바이로이드에 대하여 염기서열을 비교한 결과 기존에 보고된 바이로이드와 100% 상동성을 나타내었다(자료 생략).
바이로이드의 정량값과 과실 특성 그리고 RT-PCR 결과에 대한 상관관계를 분석한 결과, 과실 크기(small size)는 Real time PCR 결과와 82%(P<0.01)의 정의 상관관계를 보였으며, 그 외는 유의성이 없음을 확인할 수 있었다(Table 4).
우리나라 사과 및 배 주산단지 12개 지역을 대상으로 ASSVd에 대한 진단 결과, 사과 및 배나무 전체 1,193주에서 20주가 바이로이드가 검출되어 1.7%의 이병율을 나타내었다. 품종별 감염상황을 살펴본 결과, 사과는 ‘홍로’ 품종이 이병율이 3.
우선 12개 사과시료를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 ASSVd에 감염여부를 조사한 결과 12개 시료 전부 ASSVd 에 감염이 되어 있음을 알 수 있었다. 12개 시료를 분석한 결과, 동녹 증상을 보인 8번 시료가 0.
2). 이 바이로이드에 대하여 염기서열을 비교한 결과 기존에 보고된 바이로이드와 100% 상동성을 나타내었다(자료 생략). 본 증상은 앞으로 유관으로 바이로이드 감염여부를 판단하는 중요한 지표가 될 것으로 판단된다.
우리나라 사과 주산단지인 경기 포천, 충남 충주, 예산, 경북 안동, 영주, 포항지역과, 배 주산단지인 경기 남양주, 안성, 충남 천안, 전남 나주, 울산, 경북 상주지역 등 전체 12지역에서 ASSVd에 대한 진단 결과는 Table 1과 같다. 전체 1,193주에서 20주가 바이로이드가 검출되어 1.7%의 이병율을 나타내었다. 사과나무인 경우 조사주수인 725주에서 15주가 감염되어 2.
품종별 감염상황을 살펴본 결과(Table 2), 사과는 ‘후지’ 품종이 1.3%로 낮은 감염율을 보인 반면, ‘홍로’ 품종은 이병율이 3.6%로 타 품종에 비해 다소 높았다.
품종별 감염상황을 살펴본 결과, 사과는 ‘홍로’ 품종이 이병율이 3.6%로 타 품종에 비해 많이 감염되어 있음을 알 수 있었다.
각각의 프라이머로 증폭된 DNA 산물의 크기는 331 bp였다. 합성된 이들의 바이로이드에 대하여 특이적으로 증폭된 유전자 염기서열을 비교분석한 결과, 기존에 보고된 바이로이드와 100% 상동성을 나타내었다(자료 생략).
후속연구
이것은 ASSVd가 과실 비대에 가장 큰 지장을 주는 것으로 예측되며, 이에 대한 자세한 연구가 필요하다. 또한 과실 크기 등 품질별로 차이를 보이는 바이로이드 유전자를 대상으로 염기서열 분석을 통한 병원성 검정이 필요하다고 판단되었다. 한편 real time RT-PCR 결과와 RT-PCR 결과 사이의 상관관계분석 결과는 유의성이 없는 것으로 분석되었다.
또한 바이로이드에 저항성이 있는 품종을 육성하고, 교차방어(cross-protection)를 이용하여 바이로이드에 감염이 되더라도 병징이 약하게 나오는 변이주를 생산함과 동시에 무독묘 생산을 통한 우량묘목 생산·보급체계를 조기에 정착시켜야 할 것이다.
이 바이로이드에 대하여 염기서열을 비교한 결과 기존에 보고된 바이로이드와 100% 상동성을 나타내었다(자료 생략). 본 증상은 앞으로 유관으로 바이로이드 감염여부를 판단하는 중요한 지표가 될 것으로 판단된다. 농촌진흥청(2005)에서는 품종에 따라 병징의 발현 정도가 다르지만 주로 과피에 노란색 반점들이 생긴 후 과실이 성숙되면서 크기가 점점 커져서 약 1~2 cm까지 확대되어 수확기에 과피 전체의 50% 이상을 덮어 얼룩얼룩해지면서 착색이 불균일해 진다.
01)의 정의 상관관계를 보였으며, 그 외는 유의성이 없음을 확인할 수 있었다(Table 4). 이것은 ASSVd가 과실 비대에 가장 큰 지장을 주는 것으로 예측되며, 이에 대한 자세한 연구가 필요하다. 또한 과실 크기 등 품질별로 차이를 보이는 바이로이드 유전자를 대상으로 염기서열 분석을 통한 병원성 검정이 필요하다고 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Apple scar skin viroid에 감염된 사과의 병징은 어떠한가?
Lee 등(2001)은 2001년도에 국내 최초로 “미끼라이프” 사과 품종에서 ASSVd-korean strain을 RT-PCR 방법으로 진단하였으며, Kwon 등(2002)은 의성을 포함한 군위, 상주, 영양, 안동과 영덕, 무주지역에서 ASSVd가 발생하였다고 보고하였다. ASSVd에 감염된 사과의 병징은 잎이나 줄기에는 나타나지 않고 주로 과피에 나타나며, 노란색 반점들이 생긴 후 과실이 성숙함에 따라 전체적으로 착색이 불균일하게 된다. 또한 정상과에 비해 과중이 15~50%까지 감소하고, 과피에 얼룩이 생겨 상품성이 떨어진다(농촌진흥청, 2005). 그리고 ASSVd의 전염은 접수 및 즙액전염이 가능하다고 보고하여 감염주를 조기에 진단하여 제거하는 것이 매우 중요하다고 하였다(Kim 등, 2006).
바이로이드가 갖는 특징은 무엇인가?
과수에 발생하는 주요 바이로이드로는 Apple scar skin viroid (ASSVd), Dapple apple viroid (DAVd), Pear rusty skin viroid (PRSVd) 등 27여종이 있다(Flores 등, 1998). 바이로이드는 원형, 외가닥의 RNA로 구성되어 있으며 246~401 nucleotide의 크기를 가진다. 외피단백질이 없이 RNA으로만 구성되어 있으며 크기가 가장 작고 분자량이 작으며 복제가 가능한 병원체이다(Lee 등, 1985; Diener 등, 1987; Sänger, 1988). 이 등(1985)은 이러한 특성은 유전체의 분자구조 및 생물학적 특성을 연구하는데 좋은 재료가 되며, 벡터로 개발하여 생물공학 분야에 활용할 수 있을 것이라 하였다.
과수에 발생하는 주요 바이로이드는 무엇이 있는가?
과수 바이로이드병은 미국, 중국 및 일본 등 전 세계적으로 발생하며, 과실과 수량에 심각한 피해를 준다(Diener 등, 1987; Di Serio 등, 1996; Hashimoto와 Koganezawa, 1987; Sänger, 1988; Sano 등, 1989). 과수에 발생하는 주요 바이로이드로는 Apple scar skin viroid (ASSVd), Dapple apple viroid (DAVd), Pear rusty skin viroid (PRSVd) 등 27여종이 있다(Flores 등, 1998). 바이로이드는 원형, 외가닥의 RNA로 구성되어 있으며 246~401 nucleotide의 크기를 가진다.
참고문헌 (19)
Cambell, A. and Sparks, T. R. 1976. Experiments with dapple apple virus. Acta Hortic. 67: 261-264.
Diener, T. O. 1987. The Viroids. Plenum Press; New York and London.
Di Serio, F., Aparicio, F., Aloito, D., Ragozzino, A. and Flores, R.
Flores, R., Randles, J. W., Bar-Jorseph, M. and Diener, T. O. 1998. A proposed scheme for viroid classification and nomenclature. Arch. virol. 143: 623-629.
Kwon, M. J., Hwang, S. L., Lee, S. J., Lee, D. H. and Lee, J. Y. 2002. Detection and distribution of Apple scar skin viroid-Korean Strain (ASSVd-K) from Apples Cultivated in Korea. Plant Pathol. J. 18: 342-344.
Sanger, H. L. 1988. Viroids and viroid diseases. Acta Hort 234:79-87.
Sano, T., Hataya, T., Terai, Y. and Shikata, E. 1989. Hop stunt viroid strains from dample fruit plum and peach in Japan. J. Gen. Virol. 70: 1311-1319.
Rizza, S., Nobile, G., Tessitori, M., Catara, A. and Conte, E.. 2009. Real time RT-PCR assay for quantitative detection of Citrus viroid III in plant tissues Plant Pathology 58: 181-185.
Tessitori, M., Rizza, S., Reina, A. and Catara, A. 2005. Real-time RT-PCR based on SYBR-Green I for the detection of citrus excortis and citrus cachexia diseases. sixteenth IOCV Conference. Short communication.
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