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문제 정의
- 본 연구는 17β-estradiol에 노출된 저서성 요각류 Tigriopus japonicus s.l.의 생태독성반응과 형태적 변이를 관찰하고 그 영향이 세대를 통해 전달되는가를 살펴보고, 향후 계속적으로 진행될 내분비계장애물질 노출에 따른 저서성 요각류의 생태독성 반응에 대한 연구에 기초적인 자료를 제공하는데 목적이 있다.
제안 방법
- DMSO는 최종 농도가 최대 0.01%(v/v) 이하가 되도록 했으며, 실험 물질은 대조군과 solvent 대조군을 포함하여 0.1, 1, 10, 30 µg l−1 농도로 실험하였다.
- 생존율은 개체를 5분 동안 관찰하여 아무런 움직임이 없는 경우 사망한 것으로 1차 판단 후 24시간 이후에 사망을 확정하여 생존율을 결정하였다. Nauplius 유생의 성장률은 copepodite 유생으로 변태하는 시기를 매일 관찰 하여 측정하였으며, copepodite 유생의 성장률은 수컷 출현일은 성체 수컷이 관찰되는 시기인 수컷 출현일을 통해 판단하였다. 이 후 성체가 된 개체를 대상으로 각각 성비, 포란일, 포란율 등을 확인하였다.
- 독성에 직접 노출된 개체의 생태반응 뿐 아니라, 직접 노출되지 않은 그 자손까지 영향을 미칠 수 있는지 알아보기 위하여 자손세대(F1) 실험을 진행하였다. 자손세대 실험은 부모세대 실험 중 포란한 암컷 개체(F0)를 선별한후 어미세대와는 다르게 독성이 없는 정상 조건에서 유생을 부화시킨 후 배양하여 생존율, 성장률, 포란율 등을 측정하였다.
- 모든 노출실험은 배양 조건과 같은 환경에서 실시하였으며, 시험 용기로 60×15 cm petri-dish(Arambra)와 6- well, 24-well cell culture plate(SPL)를 이용하였다.
- 배양액은 1차 증류수와 인공 해수염(Crystal Sea Marine Mix, Crystal Sea®)을 이용하여 농도 25 psu로 제조하였으며, 수온 20℃, DO 80% 이상, pH 8±0.3, light/ dark=16h/8h 조건에서 항온기(Sanyo incubator MIR-553) 내에서 배양하였다.
- 생존율은 개체를 5분 동안 관찰하여 아무런 움직임이 없는 경우 사망한 것으로 1차 판단 후 24시간 이후에 사망을 확정하여 생존율을 결정하였다. Nauplius 유생의 성장률은 copepodite 유생으로 변태하는 시기를 매일 관찰 하여 측정하였으며, copepodite 유생의 성장률은 수컷 출현일은 성체 수컷이 관찰되는 시기인 수컷 출현일을 통해 판단하였다.
- 유생은 부화 후 12시간 이내의 nauplius 유생 1단계를, 성체는 포란한 암컷 성체를 이용하였으며, 노출 대상 개체는한 농도 당 최소 5개체씩 6회 이상 반복실험을 실시하였고, 생존율, 성장률, 포란, 부화 등을 24시간 간격으로 확인하였다. 실험 기간 중에는 독성 물질의 반감기를 고려하여 3일 간격으로 사육수를 교체해 주었다.
- 실험 후 모든 개체는 70% 에탄올로 고정하여 보관하였으며, 해부 현미경(Olympus SZX12), 광학 현미경(Olympus BX-51) 등을 사용하여 체장, 체적, 각 부속지의 형태 변이 등을 측정 관찰하였다. 각 개체의 길이와 폭은 해부 현미경과 광학 현미경에 부착된 카메라를 이용하여 이미지 분석 프로그램(MetaMorph 6.
- 노출 실험은 ISO의 표준시험 방법을 참조하였다(ISO 1997). 유생은 부화 후 12시간 이내의 nauplius 유생 1단계를, 성체는 포란한 암컷 성체를 이용하였으며, 노출 대상 개체는한 농도 당 최소 5개체씩 6회 이상 반복실험을 실시하였고, 생존율, 성장률, 포란, 부화 등을 24시간 간격으로 확인하였다. 실험 기간 중에는 독성 물질의 반감기를 고려하여 3일 간격으로 사육수를 교체해 주었다.
- Nauplius 유생의 성장률은 copepodite 유생으로 변태하는 시기를 매일 관찰 하여 측정하였으며, copepodite 유생의 성장률은 수컷 출현일은 성체 수컷이 관찰되는 시기인 수컷 출현일을 통해 판단하였다. 이 후 성체가 된 개체를 대상으로 각각 성비, 포란일, 포란율 등을 확인하였다.
- 이번 연구에서는 E2에 노출된 T. japonicus s.l.의 생존, 성장, 성비 등의 변화뿐 아니라 형태적인 변이도 관찰 할수 있었다. 발생된 형태변이 중 대표적인 것은 왜소증(dwarfism)과 복부 기형이다.
- ) 실험을 진행하였다. 자손세대 실험은 부모세대 실험 중 포란한 암컷 개체(F0)를 선별한후 어미세대와는 다르게 독성이 없는 정상 조건에서 유생을 부화시킨 후 배양하여 생존율, 성장률, 포란율 등을 측정하였다.
대상 데이터
- E2에 직접 노출되지 않은 자녀세대(F1) 배양 실험은 각 농도별로 110개 내외의 개체를 대상으로 이루어졌다. F1 nauplius는 1 µg l−1에서 83.
- 실험 물질로 천연 에스트로겐 17β-estradiol(E2; cas no. 50-28-2)을 사용하였으며, carrier solvent로 dimetyl sulfoxide(DMSO)를 이용하였다.
- 실험생물인 저서성 요각류 Tigriopus japonicus s.l.는 전라남도 여수시 만성리 해수욕장 부근 조수 웅덩이에서 소형 핸드넷(망목 크기 63 µm)으로 채집한 후 배양하였다.
데이터처리
- 각각의 독성 물질에 대한 생물종의 생존율, 성장률, 포 란율 등을 분석하기 위해 SPSS 프로그램(ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 분석을 기본으로 하여 분석한 후 Duncan test 로 사후 검정하였으며, 성비는 χ2 검정을 이용하여 분석 하였다.
- 통계 분석은 one-way ANOVA 분석을 기본으로 하여 분석한 후 Duncan test 로 사후 검정하였으며, 성비는 χ2 검정을 이용하여 분석 하였다.
이론/모형
- 실험 후 모든 개체는 70% 에탄올로 고정하여 보관하였으며, 해부 현미경(Olympus SZX12), 광학 현미경(Olympus BX-51) 등을 사용하여 체장, 체적, 각 부속지의 형태 변이 등을 측정 관찰하였다. 각 개체의 길이와 폭은 해부 현미경과 광학 현미경에 부착된 카메라를 이용하여 이미지 분석 프로그램(MetaMorph 6.0)에서 계산하였으며, 생체량(biomass) 측정은 Feller and Warwick의 Volumetric method(Higgins and Thiel 1988)를 이용하였다.
- 모든 노출실험은 배양 조건과 같은 환경에서 실시하였으며, 시험 용기로 60×15 cm petri-dish(Arambra)와 6- well, 24-well cell culture plate(SPL)를 이용하였다. 노출 실험은 ISO의 표준시험 방법을 참조하였다(ISO 1997). 유생은 부화 후 12시간 이내의 nauplius 유생 1단계를, 성체는 포란한 암컷 성체를 이용하였으며, 노출 대상 개체는한 농도 당 최소 5개체씩 6회 이상 반복실험을 실시하였고, 생존율, 성장률, 포란, 부화 등을 24시간 간격으로 확인하였다.
- 먹이는 인공 사료 Tetramin(TetraWerke, Melle, Germany)을 미세하게 처리한 후 현탁액 상태로 공급하였다. 자세한 배양 조건은 ISO의 표준시험방법을 참고하였다(ISO 1997).
성능/효과
- Copepodite 출현일의 경우 비처리 농도에서 부터 1 µg l−1까지 5.20±0.65, 5.55±0.74, 6.11±0.89일로 농도가 높아짐에 따라 성장이 지연되었으며, 10 µg l−1를 정점으로 농도가 더 증가하면 copepodite 출현일이 각각 4.97±0.18, 4.59±0.50일로 점점 빨라지는 것으로 나타났다.
- E2 30 µg l−1에서 관찰된 수컷 개체는 모든 부속지의 강모(seta)가 거의 발달되지 않아 이번에 관찰된 형태 변이 중 가장 특이한 것으로 판단되었다.
- 개체 폭 역시 1 µg l−1을 제외하고 모두 대조군보다 작은 것으로 관찰되었으며, 이에 따라 1 µg l−1을 제외한 전 농도에서 생물량이 대조군보다 작은 것으로 나타났다.
- 82 µm로 대조군보다 10%정도 작게 나타났다. 개체 폭에서도 모든 농도에서 대조군과 많은 차이를 보였으며, 이에 따라 전 농도에서 생물량이 대조군보다 매우 적은 것으로 나타났다. 가장 적은 생물량을 보인 농도는 30 µg l−1로 3.
- 개체 폭은 10 µg l−1을 제외한 다른 농도에서는 280 µm 내외로 대조군의 90% 정도로 나타났으며, 생물량 역시 10 µg l−1를 제외한 모든 농도에서 대조군보다 적은 것으로 관찰되었다.
- 48 µgC로 가장 높게 나타났으나 이 역시 대조군 생물량의 80% 정도에 불과했다 E2 F1 수컷의 체장은 모든 농도에서 대조군과 유사하게 나타났다. 그러나 암컷과 마찬가지로 전 농도에서 개체의 폭이 대조군보다 좁은 것으로 관찰되었고, 이에 따라 생물량도 적게 나타났다. 가장 낮은 생물량은 0.
- 그러나 이번 연구에서는 F0에서 10 µg l−1 이상 농도에서 수컷의 발생비율이 매우 높은 것으로 나타났으며, F1에서도 30 µg l−1에서 90% 이상의 높은 수컷 출현 비율을 보였다.
- 대조군 nauplius 유생의 생존율은 96.55±9.36%, copepodite 유생은 97.86±6.07(평균±표준편차)%로 나타났으며, nauplius 유생은 부화 후 평균 5.20±0.65일 이후에 copepodite 유생으로 발달하였다(Table 1).
- 대조군 암컷은 98.08±10.00%의 포란율을 보이며, 부화후 평균 13.64±0.67일에 포란하는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 17β-estradiol(E2)에 직접 노출되지 않은 자녀세대(F1) 1 µg l−1에서만 생존율의 감소가 있었을뿐 대부분의 농도에서 E2는 Tigriopus japonicus s.l.의 생존에 영향을 주지 않았다.
- 성체 수컷 출현일을 기준으로 한 copepodite 유생 성장은 모든 농도에서 대조군보다 지연되었으며, 특히 1 µg l−1에서는 평균 12.20±2.53일로 대조군 보다 약 1.9일 지연되었다.
- 이 개체들은 체장이 500~600 µm 내외로 매우 작으며, 복부가 상대적으로 잘 발달되지 않았으며, 큐티클(cuticle) 층이 얇은 것으로 관찰되었는데, 이러한 개체들은 주로 10 µg l−1이상 농도에서 관찰되었다.
- 이번 연구를 통해 17β-estradiol에 직접 노출된 개체뿐 아니라 직접 노출되지 않은 그 자손까지 영향을 미칠 수있음을 확인 하였으며, 요각류를 이용한 독성평가 시 생존, 성장, 생식 뿐 아니라 형태적 변이를 이용한 연구도 가능함을 제시하였다.
- 이번 연구에서도 T. japonicus s.l.의 성장은 E2에 영향을 받는 것으로 나타났으며, 특히 1.0 µg l−1 이하에서는 nauplius 유생과 copepodite 유생 모두 대조군에 비해 성장이 지연되는 것으로 나타났다.
- 최초 포란일은 모든 실험군이 대조군보다 지연되는 것으로 나타났으며, 1 µg l−1에서 18.35±4.91일로 가장 늦은 포란일을 보였다.
- 출현한 성체 중 수컷 비율로 산정한 성비를 관찰한 결과, 대조군은 전체 성체 중 수컷이 61.48%를 차지하였으며, E2에 노출된 실험군은 노출 농도가 증가함에 따라 수컷 출현 비율 높아지는 경향을 보였다. 특히 노출 농도 중 10, 30 µg l−1에서 성체 수컷 비율이 각각 93.
- 특히 10 µg l−1은 체장, 폭, 생물량이 각각 대조군의 74%, 82%, 50%로 매우 작은 것으로 나타났다.
- 특히 노출 농도 중 10, 30 µg l−1에서 성체 수컷 비율이 각각 93.33%, 96.67%로 매우 높은 출현율을 보였다.
후속연구
- 하지만 Moore and Stevenson(1991)은 영국 연안에서 채집한 저서성 요각류 Paramphiascella hyperborea에서 90% 이상의 높은 간성 현상을 발견하였다. 이렇게 높은 간성을 보인 이유는 오수 배출과 같은 오염 때문인 것으로 추측만 하였을 뿐 그에 대한 추가 실험은 이루어지지 않았다. 이번 연구에서 내분비계장애물질이 저서성 요각류의 기형을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었으며, 추후 계속적인 연구를 통해 오염에 대한 형태 변이 자료를 축적하여 이를 바탕으로 저서성 요각류의 형태적 변이를 이용한 오염 판단 기준을 세울 수 있을 것이라 기대된다.
- 이렇게 높은 간성을 보인 이유는 오수 배출과 같은 오염 때문인 것으로 추측만 하였을 뿐 그에 대한 추가 실험은 이루어지지 않았다. 이번 연구에서 내분비계장애물질이 저서성 요각류의 기형을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었으며, 추후 계속적인 연구를 통해 오염에 대한 형태 변이 자료를 축적하여 이를 바탕으로 저서성 요각류의 형태적 변이를 이용한 오염 판단 기준을 세울 수 있을 것이라 기대된다.
- 그러나 이번 연구에서는 F0에서 10 µg l−1 이상 농도에서 수컷의 발생비율이 매우 높은 것으로 나타났으며, F1에서도 30 µg l−1에서 90% 이상의 높은 수컷 출현 비율을 보였다. 이전 연구와 다른 결과를 보인 이유는 각 실험 종 및 실험 물질 간 차이일 것으로 추측 되나 정확한 결론을 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.
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