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문제 정의
- 이 연구에서는 전 세계적으로 분포하고 특히 남북극 극지방에 우점하고 있는 prymnesiophyte 분류군 중 북극종인 Phaeocystis pouchetii(Hariot in Pouchet) Lagerheim 그리고 양극해양 서식 규조류인 Porosira glacialis(Grunow) Jørgensen을 단종 배양하여, 인공자외선에 노출시킨 후 자외선 흡수물질(MAAs) 및 카로틴의 생성 및 일차 생산력을 비교함으로서 극한의 환경에 적응하는 각 식물플랑크톤의 적응력 및 생존 능력을 파악하고자 한다.
제안 방법
- Standard response factor(Rf) 값은 표준물질의 peak 면적을 계산하고, 이 면적으로 표준물질의 농도를 나누어 계산하였다.
- MAAs 분석에 쓰인 표준물질은 독일 Freiderich Alexender 대학 Häder 교수님으로부터 shinorine과 porphyra-334를 받아 사용했다. 각 MAAs의 생산력은 MAAs compounds를 시간에 따라 tin cap(미리 태운 filter paper 조각 포함)에 분취 후 solvent를 완전 제거 후 EA-irMS를 이용하여 각 compounds 내 13C 값을 측정하였다. 이후 Hama et al.
- 6을 사용했다. 검출기는 Agilent DAD(G1315D) 313 nm(250~750 nm scan)로 검출하였으며, 각 MAAs 화합물은(M-335, shinroine, 그리고 porphyra-334) fraction collector(Agilent analyte(G1364C) FC)를 이용하여 분취하였다. 이동성 용매는 100% DIW(with 0.
- 광합성 효율(Fv/FM)은 Fluorescence Induction and Relaxation(FIRe) fluorometer(Satlantic Inc., Halifax, Canada)를 이용하여 측정하였으며, 배양된 시간에 따라 시료 10 ml를 채취 후 바로 암냉보관 후 30분 이내에 측정하였다. FIRe fluorometer는 광합성하는 생물체나 광합성 기작을 설명, 측정하는 가장 최신의 bio-optical 기술로서, 식물플랑크톤의 환경 모니터링, 수중 생태계 내 일차생산력 측정, 그리고 환경 스트레스에 대한 평가를 하는 등 여러 분야에 활용 되고 있다.
- 광합성에 의한 탄소고정속도 측정을 위한 배양실험은 배양 해수에 NaH13CO3(98%)를 첨가하여 일정 시간 동안 실시하였다. 배양이 끝난 후 13C 표시된 시료를 미리 태운(450℃, 4시간) GF/F 25 mm 필터에 10 ml를 여과 후 −80℃ 냉장고에 분석 전까지 보관한다.
- 두 종의 식물플랑크톤은 계대 배양시 30 µmol/m2/s의 광량으로 배양실 빛 조건을 맞추었으며, 노출 실험 전 마지막 계대 배양은 실험 전 일주일간 15~20 µmol/m2/s의 조건으로 순응시켰다. 그 후 자외선 노출 배양기로 이동 후 약 24시간 암조건 상태를 유지, 순응시킨 후 인공자외선에 노출실험을 실시하였다.
- 식물플랑크톤은 한국해양연구원 부설 극지연구소 극지생물재현연구실(KOPRI Culture Collections for Polar Microorganisms; KCCPM)에서 제공받았으며, 2010년 4월에 실시한 실내 자외선 노출 실험에서는 2009년 북극 현장조사에서 분리 동정된 prymnesiophyte 분류군 중 Phaeocystis pouchetii(KCCPM 일련번호 ArM0055)과 남극에 서식하는 대표적인 식물플랑크톤인 규조류 중 Porosira glacialis(KCCPM 일련번호 AnM0008)를 사용하였으며, 각 식물플랑크톤의 생체 내 자외선 흡수물질(MAAs)의 농도를 분석함과 동시에 각 MAAs의 생산력을 측정하였다. 또한 각 식물플랑크톤의 광보호 색소 카로틴을 분석함으로서 자외선 흡수물질과 광보호 색소간 상호작용에 대한 고찰을 실시하였다. 극지 식물플랑크톤을 배양한 배지는 규조류에 일반적으로 사용되는 f/2 배지를 사용하여 Porosira glacialis를 배양하였으며, f/2 배지와 같은 성분에 미량금속만 추가된 L1 배지는 Phaeocystis pouchetii를 배양하는데 사용하였다(Guillard and Ryther 1962).
- 이 연구에서는 전 세계적으로 분포하고 특히 남북극 극지방에 우점하고 있는 prymnesiophyte 분류군 중 북극종인 Phaeocystis pouchetii(Hariot in Pouchet) Lagerheim 그리고 양극해양 서식 규조류인 Porosira glacialis(Grunow) Jørgensen을 단종 배양하여, 인공자외선에 노출시킨 후 자외선 흡수물질(MAAs) 및 카로틴의 생성 및 일차 생산력을 비교함으로서 극한의 환경에 적응하는 각 식물플랑크톤의 적응력 및 생존 능력을 파악하고자 한다. 또한 이 연구에서는 13C 추적자을 이용하여 측정된 광합성능과 자외선 흡수 물질(MAAs)의 생산성을 비교함으로써 광에너지가 세포 내에서 전달 분배되는 과정을 이해하고, 각 빛 조건에 따라 반응하는 정도를 파악하였다.
- 여과된 샘플은 동결건조기를 통하여 완전 건조 후 1 N HCl fume로 overnight 해줌으로서 무기탄소를 제거하였다. 무기탄소 제거 후 NaOH fume으로 중화를 시켜 준 후 EA-irMS로 13C값을 측정하였다.
- 04 µmol/m2/s가 측정되었다. 배양온도 4℃를 유지하면서, 총 5일까지 자외선 노출 실험을 실시하였다. 두 종의 종주 보관은 배양실 광량 30 µmol/m2/s 하에서 배양온도 4℃를 유지하였다.
- 완전 건조된 시료를 500 µl의 증류수로 다시 녹인 후 chloroform 100 µl를 넣은 후 원심분리기 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상층액 400 µl를 분리한다. 분리한 상등액을 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)에 주입하여 MAAs 정량 분석을 실시하였다.
- 총 2종(Phaeocystis pouchetii, Porosira glacialis)의 극해역 우점 식물플랑크톤이 연구에 활용되었다. 식물플랑크톤은 한국해양연구원 부설 극지연구소 극지생물재현연구실(KOPRI Culture Collections for Polar Microorganisms; KCCPM)에서 제공받았으며, 2010년 4월에 실시한 실내 자외선 노출 실험에서는 2009년 북극 현장조사에서 분리 동정된 prymnesiophyte 분류군 중 Phaeocystis pouchetii(KCCPM 일련번호 ArM0055)과 남극에 서식하는 대표적인 식물플랑크톤인 규조류 중 Porosira glacialis(KCCPM 일련번호 AnM0008)를 사용하였으며, 각 식물플랑크톤의 생체 내 자외선 흡수물질(MAAs)의 농도를 분석함과 동시에 각 MAAs의 생산력을 측정하였다. 또한 각 식물플랑크톤의 광보호 색소 카로틴을 분석함으로서 자외선 흡수물질과 광보호 색소간 상호작용에 대한 고찰을 실시하였다.
- 이 연구에서는 HPLC를 이용하여 P. pouchetii와 P. glacialis의 β-carotene과 diadinoxanthin을 시간에 따라 분석하였다.
- 자외선 광량은 UVX® radiometer(Model UVX-25 and UVX-31)를 통하여 250 nm(UV-B)에서 5.2 µW/m2, 320 nm(UV-A)에서 12.3 µW/m2, 그리고 395 nm(PAR)에서 1.8 µW/m2 세기로 조사하였다.
- 추출된 색소는 주사기 필터(PTFE 0.20 µm Hydrophobic)를 이용하여 여과 후 1 ml을 취하여 Water packing(300 µl 3차 증류수 혼합)하여 High-Performance Liquid Chromatography(HPLC)로 정량 분석을 실시하였다.
- 탄소순환속도(turnover rate)은 각 측정된 탄소고정속도에 배양된 유기물의 총 탄소량을 나누워 줌으로서 배양 동안의 고정된 13C 탄소의 순환 속도을 계산하였다(Hama et al. 1983).
대상 데이터
- MAAs 분석에 쓰인 표준물질은 독일 Freiderich Alexender 대학 Häder 교수님으로부터 shinorine과 porphyra-334를 받아 사용했다.
- 또한 각 식물플랑크톤의 광보호 색소 카로틴을 분석함으로서 자외선 흡수물질과 광보호 색소간 상호작용에 대한 고찰을 실시하였다. 극지 식물플랑크톤을 배양한 배지는 규조류에 일반적으로 사용되는 f/2 배지를 사용하여 Porosira glacialis를 배양하였으며, f/2 배지와 같은 성분에 미량금속만 추가된 L1 배지는 Phaeocystis pouchetii를 배양하는데 사용하였다(Guillard and Ryther 1962).
- 실내 배양에 사용된 광조건는 총 2종류의 UV cutoff 필터를 사용하였다. 중파자외선과 장파자외선 그리고 광합성 유효광(UVB+UVA+PAR)이 투과되는 295 nm cutoff filter(Ultraphan, UV Opak, Digefra, Muncich, Germany)와 광합성 유효광(PAR)만 투과하는 395 nm cutoff filter(Ultraphan, UV Opak, Digefra, Muncich, Germany)를 사용했다(Fig.
- 1). 인공 자외선은 상업적으로 판매되는 UV lamp를 사용했으며, 중파 자외선(UV-B) lamp(Actionic BL 15W, PHILIPS, Holland), 장파 자외선(UV-A) lamp (TL-D 15W, PHILIP, Holland), 그리고 일반 visible lamp를 사용하였다. 자외선 광량은 UVX® radiometer(Model UVX-25 and UVX-31)를 통하여 250 nm(UV-B)에서 5.
- 실내 배양에 사용된 광조건는 총 2종류의 UV cutoff 필터를 사용하였다. 중파자외선과 장파자외선 그리고 광합성 유효광(UVB+UVA+PAR)이 투과되는 295 nm cutoff filter(Ultraphan, UV Opak, Digefra, Muncich, Germany)와 광합성 유효광(PAR)만 투과하는 395 nm cutoff filter(Ultraphan, UV Opak, Digefra, Muncich, Germany)를 사용했다(Fig. 1). 인공 자외선은 상업적으로 판매되는 UV lamp를 사용했으며, 중파 자외선(UV-B) lamp(Actionic BL 15W, PHILIPS, Holland), 장파 자외선(UV-A) lamp (TL-D 15W, PHILIP, Holland), 그리고 일반 visible lamp를 사용하였다.
- 총 2종(Phaeocystis pouchetii, Porosira glacialis)의 극해역 우점 식물플랑크톤이 연구에 활용되었다. 식물플랑크톤은 한국해양연구원 부설 극지연구소 극지생물재현연구실(KOPRI Culture Collections for Polar Microorganisms; KCCPM)에서 제공받았으며, 2010년 4월에 실시한 실내 자외선 노출 실험에서는 2009년 북극 현장조사에서 분리 동정된 prymnesiophyte 분류군 중 Phaeocystis pouchetii(KCCPM 일련번호 ArM0055)과 남극에 서식하는 대표적인 식물플랑크톤인 규조류 중 Porosira glacialis(KCCPM 일련번호 AnM0008)를 사용하였으며, 각 식물플랑크톤의 생체 내 자외선 흡수물질(MAAs)의 농도를 분석함과 동시에 각 MAAs의 생산력을 측정하였다.
이론/모형
- MAAs 분석은 HPLC system(Agilent technologies 1200 series)을 사용했으며, 컬럼은 Waters 120DS-AP(5 µm) 150 mm×4.6을 사용했다.
- 색소 분석은 Zapata et al. (2000)의 방법을 이용하였으며, 컬럼(Waters symmetry C8 column(150 × 4.6 mm, 3.5 µm))을 이용하고, 이동상 용매 A(Methanol: 50%, Acetonitrile: 25%, Aqueous pyridine solution: 25%)와 이동상 용매 B (Methanol: 20%, Acetonitrile: 60%, Acetone: 20%)를 이용하여 분석하였으며, chromatogram의 봉우리(peak)에 대한 동정은 표준색소(DHI water & Environment, Hørsholm, Denmark)의 머무름 시간(retention time)과 비교 결정하였다.
- 안정동위원소비는 EA-irMS(EuroEA-Isoprime IRMS, GV instruments, UK)를 이용하여 측정하였으며, 측정된 안정동위원소비를 이용하여, 아래의 Hama et al. (1983) 식을 이용하여 일차생산력을 계산하였다.
- 각 MAAs의 생산력은 MAAs compounds를 시간에 따라 tin cap(미리 태운 filter paper 조각 포함)에 분취 후 solvent를 완전 제거 후 EA-irMS를 이용하여 각 compounds 내 13C 값을 측정하였다. 이후 Hama et al. (1983)의 식을 이용하여 각 compound의 생산 속도를 구하였다.
- 5 µm))을 이용하고, 이동상 용매 A(Methanol: 50%, Acetonitrile: 25%, Aqueous pyridine solution: 25%)와 이동상 용매 B (Methanol: 20%, Acetonitrile: 60%, Acetone: 20%)를 이용하여 분석하였으며, chromatogram의 봉우리(peak)에 대한 동정은 표준색소(DHI water & Environment, Hørsholm, Denmark)의 머무름 시간(retention time)과 비교 결정하였다. 표준색소의 농도는 Jeffrey의해 알려진 흡광계수(Jeffrey et al. 1997)를 이용하여 아래의 식(Park and Park 1997)에 의해 계산하였다.
성능/효과
- 3b). P. glacialis의 탄소순환속도는 P. pouchetii 보다는 약간 높은 값(0.04~0.1/day)을 보이고 있으며, 인공자외선에 노출된 P. pouchetii은 거의 비슷한 탄소순환속도를 보이는 반면 광합성 유효광에 노출된 cell은 72시간까지 증가한 후 다시 감소하는 높은 변동성을 보이고 있다(Table 2). 또한 P.
- P. pouchetii의 광보호 색소인 카로틴의 농도 변화는 자외선에 노출시 β-carotene이 빠르게 반응하는 것을 볼 수 있으며, diadinoxanthine은 β-carotene보다 자외선에 늦게 반응하는 것을 볼 수 있다.
- 각 인공 자외선과 광합성 유효광에 노출된 P. pouchetii의 MAA 생산속도은 인공자외선에 120시간 노출 후 6.95 pgC l−1 hr−1의 값을 보이는 반면 광합성 유효광에 120시간 노출 후 3.53 pgC l−1 hr−1 값으로 보다 낮은 생산성을 보이고 있다.
- a 값을 보이고 있다. 광합성 유효광과 인공자외선에 노출된 P. pouchetii 의 MAA 농도는 시간에 따라 증가 양상을 모두 보이고 있으나 광합성 유효광에 노출된 P. pouchetii 보다 인공자 외선에 노출시 2배 정도 더 빠르게 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 MAA 생산속도에서도 인공자외선에 노출된 P.
- 그러나 규조류인 P. glacialis의 MAAs은 shinorine (λmax : 334 nm)와 porphyra-334(λmax : 334 nm) 두 종류의 MAAs를 가지고 있는 것을 확인하였으며, shinorine과 porphyra-334의 농도는 광조건과 시간에 관계없이 거의 비슷한 값을 유지하고 있는 것을 보이고 있다(Fig. 5).
- glacialis 내 두 자외선 흡수 물질의 생산속도는 일정 시간 뒤 감소하는 경향을 보이고 있다. 따라서 외부 표면의 자외선 흡수 능력이 뛰어난 P. glacialis은 P. pouchetii와는 상반된 경향을 보이는 것으로 생각된다.
- pouchetii 보다 인공자 외선에 노출시 2배 정도 더 빠르게 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 MAA 생산속도에서도 인공자외선에 노출된 P. pouchetii의 새로운 MAA의 생산속도가 광합성 유효광에 노출된 cell보다 높은 경향을 보이고 있다(Fig. 6). 각 인공 자외선과 광합성 유효광에 노출된 P.
- 4 pgC l−1 hr−1의 값을 보였다. 또한 각 MAAs의 탄소순환속도에서는 오히려 shinorine(광합성유효광은 평균 0.0063/day, 인공자외선은 평균 0.0054/day)이 porphyra-334(광합성유효광은 평균 0.0009/day, 인공자외선은 평균 0.0009/day)보다 빠른 순환속도를 보이고 있으며, 인공자외선에 노출된 경우보다 광합성 유효광에 노출된 세포가 약간 더 빠른 것을 볼 수 있다(Table 2).
- glacialis는 자외선 흡수 물질 및 광보호 색소를 일정한 농도로 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 극지 자외선에 노출되고 있는 식물플랑크톤 2종(Phaeocystis pouchetii, Porosira glacialis)에 대해 자외선 흡수 물질의 생산속도를 결정함으로서 자외선 노출 시간에 따른 극지 식물플랑크톤 세포내 생성되는 광보호 물질의 순차적 반응 차이 및 농도 변화를 규명할 수 있었다.
- 실내 배양된 극지 식물플랑크톤 2종(Phaeocystis pouchetii, Porosira glacialis)은 유해한 환경으로부터 생존하기 위해 자외선 흡수 물질을 생체 내 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 극지 지역에 우점하고 있는 것으로 알려진 종이다(Riegger and Robninson 1997). 본 실험 결과 prymnesiophyte 분류군 중 P. pouchetii 종은 최대 흡광도 335 nm를 보이고 있는 M-335 한 종류만을 가지고 있는 것으로 확인된 반면, P. glacialis은 shinorine과 porphyra-334 두 종류의 자외선 흡수물질을 가지고 있는 것으로 확인되었다. P.
- 또한 자외선과 세포 내 기관 사이에 해면조직(sponge), 상피 조직(cuticles), 갑각 조직(carapaces), 껍질(shells), 비늘(scales), 깃털(feathers), 모피(fur) 등은 자외선을 효과적으로 차단하고 있으며, 이러한 외부 표면은 세포 내 기관을 보호하기 위해 자외선의 95% 이상을 흡수하는 것으로 알려져 있다(Karentz 1994; Rawlings 1996). 위와 같은 연구보고를 통하여, 규조류 P. glacialis의 두 종류의 자외선 흡수 물질(shinorine과 porphyra-334)은 모두 노출시간에 따라 일정한 농도를 유지하고 있으며, P. pouchetii보다 10배 이상 높은 값을 나타내고 있다. 그러나 P.
- 이상 본 연구로부터 P. pouchetii는 자외선에 노출시 광보호 물질의 생성이 활발한 것을 볼 수 있는 반면, P. glacialis는 자외선 흡수 물질 및 광보호 색소를 일정한 농도로 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 극지 자외선에 노출되고 있는 식물플랑크톤 2종(Phaeocystis pouchetii, Porosira glacialis)에 대해 자외선 흡수 물질의 생산속도를 결정함으로서 자외선 노출 시간에 따른 극지 식물플랑크톤 세포내 생성되는 광보호 물질의 순차적 반응 차이 및 농도 변화를 규명할 수 있었다.
- pouchetii가 더 크게 받고 있는 것으로 보인다. 인공자외선과 광합성 유효광에 노출된 P. pouchetii의 탄소고정속도는 저해되지만 자외선 흡수 물질의 탄소고정속도는 오히려 증가하는 결과를 볼 수 있다. 이와 반대로 인공자외선에 노출된 규조류인 P.
- 인공자외선에 노출된 P. glacialis의 엽록소 농도는 배양하는 동안 변화가 심하지만(15.8~24.2 µg l−1), 광합성 유효광에 노출된 cell은 96시간까지 증가 후 120시간 이후에는 약간 감소하는 것을 보이고 있다(Fig. 4b).
- 이러한 경향은 총 탄소고정속도와 유사한 경향을 보이고 있다. 탄소순환속도는 광합성 유효광과 인공자외선에 노출된 P. pouchetii 모두 72시간까지 비슷한 값을 보이고 있으나, 광합성 유효광에 노출된 세포는 72시간 이후 다시 증가하고, 인공자외선에 노출된 P. pouchetii은 96시간에 가장 낮은 값(0.011/day)를 보인 후 증가하고 있다. 그러나 엽록소의 농도는 배양시간 동안 거의 비슷한 값을 보이고 있으며, 인공자외선에 노출된 P.
- MAAs의 세포 내 조성은 광도에 따라 다양하게 반응, 합성되고 있으며 게다가 각각의 MAAs 화합물들은 광합성 유효광 및 자외선 파장에 따라 영향을 받고 있는데, 이러한 MAAs 생성기작에 대한 광 반응은 식물플랑크톤 종에 따라 다르게 나타난다(Karentz 2001). 한편, 광합성 유효광에 노출된 P. pouchetii의 탄소고정속도는 96시간까지 광저해를 받아 낮아진 후 점차 증가하여 식물플랑크톤의 생리 상태가 회복하고 있는 것을 볼 수 있다.
후속연구
- 따라서 Phaeocsytis sp.가 우점하기 위해서는 MAAs포함된 점액물질 속에 세포가 존재하는 군체를 형성하여 보다 많은 자외선 흡수 물질을 분비하거나 군집을 통한 자체 차단을 해야 할 것으로 사료된다.
- 2). 그러므로, 이 연구 결과는 광합성을 하는 식물플랑크톤이 빛에너지를 이용하여 유기물 합성을 하고 생체 내 에너지 전달 과정을 이해하는데 도움을 줄 것으로 사료되며, 현장 식물플랑크톤의 대발생 이후 자외선 노출에 따른 각 식물플랑크톤 군집 내 자외선 흡수 물질 및 광보호 색소의 변화를 이해할 수 있는 자료를 제공할 수 있다.
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