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문제 정의
- 갱년기 여성에는 여러 폐경 증후들이 나타나는데, 특히 에스트로겐의 감소로 인한 혈중 지질 조성의 변화 등으로 심혈관계 질환의 발병율이 급격히 증가하는 경향을 보이고 있으며, 또한 급격한 골 소실로 인한 골다공증의 위험성이 높아 이에 대한 예방 및 치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 갈조류인 곰피 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성 및 osteocalcin 농도와 골 용해 지표인 C-telopeptide of collagen cross-links(CTx) 및 결합 조직 중의 collagen 함량을 측정하였다. ALP는 폐경 시 에스트로겐의 결핍으로 인하여 골 전환이 증가하므로 골 형성의 지표로써 널리 사용되고 있다.
- 본 연구에서는 곰피 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP)활성 및 osteocalcin 농도와 골 용해 지표인 C-telopeptide of collagen cross-links(CTx) 및 결합 조직 중의 collagen 함량을 측정하였다.
- 또한 아울러 collagen의 대사에 관여하는 분해효소 matrix metalloproteinase-1(MMP-1)의 발현을 조절하여 collagen의 분해를 억제하며, 에스트로겐이 결핍되면 비정상적으로 골재형성과정이 촉진되고 조직 내의 collagen 손상은 연골 조직의 노화와 골 관절염, 골다공증 병인의 원인이 된다고 한다(40). 본 연구에서는 난소절제로 인하여 에스트로겐이 결핍되었을 때 collagen 생성 변화에 있어 곰피 추출물의 영향을 검토하였다(Table 6). 각 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절제에 의해 감소하는 경향을 나타내었다.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=7).
제안 방법
- 본 실험에서 사용한 곰피는 2009년에 전라도에서 채취된 것을 구입하여 물로 8～9회 씻어 염분과 불순물을 제거하고, 동결 건조시켜 분쇄하여 분말화하여 실험에 사용하였다. 건조된 곰피에 80% ethanol 2 L를 가해 3회 열 추출하여 감압농축기로 농축하고 동결 건조한 ethanol 추출물을 증류수에 녹인 후 동물실험에 사용하였다.
- 결합조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 200 mg씩 취하여 가수분해(6 N HCl, 110℃ 20 hr)하고 여과, 농축하여 증류수로 시료를 녹인 후 정용하여 실험에 사용하였다.
- 골 용해 지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide(CTx) 농도는 RatLaps ELISA kit(Nordic Bioscience Diagnostics, South Tyneside, England)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type Ⅰ collagen의 C-terminal telopeptide α1 사슬에 특징적인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다.
- 골격 형성 지표인 serum alkaline phosphatase 활성은 측정용 kit를 사용하여 자동생화학분석기 DRY CHEM 3600i(Fujii, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였다. 혈청 osteocalcin은 rat전용 osteocalcin ELISA kit(Biomedical Technologies Inc.
- 평균 몸무게 200 g인 9주령의 Sparaque-Dawley계 암컷 흰쥐를 (주)오리엔트에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후 난소절제 수술을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준 비 난소절제 대조군(sham), 난소를 절제한 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 곰피 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-ES50), 난소절제 후 곰피 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-ES200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).
- 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준 비 난소절제 대조군(sham), 난소를 절제한 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 곰피 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-ES50), 난소절제 후 곰피 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-ES200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1). 실험기간 동안 식이섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50～55%를 유지시켰고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였다.
- 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준 비 난소절제 대조군(sham), 난소를 절제한 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 곰피 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-ES50), 난소절제 후 곰피 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-ES200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1). 실험기간 동안 식이섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다.
- 평균 몸무게 200 g인 9주령의 Sparaque-Dawley계 암컷 흰쥐를 (주)오리엔트에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후 난소절제 수술을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다.
- 골격 형성 지표인 serum alkaline phosphatase 활성은 측정용 kit를 사용하여 자동생화학분석기 DRY CHEM 3600i(Fujii, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였다. 혈청 osteocalcin은 rat전용 osteocalcin ELISA kit(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA, USA)를 이용하여 ELISA reader로 분석하였다. 골 용해 지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide(CTx) 농도는 RatLaps ELISA kit(Nordic Bioscience Diagnostics, South Tyneside, England)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type Ⅰ collagen의 C-terminal telopeptide α1 사슬에 특징적인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 곰피는 2009년에 전라도에서 채취된 것을 구입하여 물로 8～9회 씻어 염분과 불순물을 제거하고, 동결 건조시켜 분쇄하여 분말화하여 실험에 사용하였다. 건조된 곰피에 80% ethanol 2 L를 가해 3회 열 추출하여 감압농축기로 농축하고 동결 건조한 ethanol 추출물을 증류수에 녹인 후 동물실험에 사용하였다.
데이터처리
- 3)Values with different alphabets are significantly different at p<0.05 using Duncan's multiple range test.
- 4)Values with different alphabets are significantly different at p<0.05 using Duncan's multiple range test.
- 본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 mean±SD치로 나타내었고, 통계적 유의성은 SPSS version 17.0 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치를 산출하였다.
- 집단 간의 차이는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였고, Duncan's multiple range test를 이용하여 유의수준은 p<0.05의 범위에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 결합조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 200 mg씩 취하여 가수분해(6 N HCl, 110℃ 20 hr)하고 여과, 농축하여 증류수로 시료를 녹인 후 정용하여 실험에 사용하였다. 시료 중의 collagen은 Woessner(20)의 방법으로 colorimetri method로 hydroxyproline(Hyp)량을 측정한 후, collagen의 아미노산 조성으로부터 collagen량을 환산하였다. Collagen 중의 Hyp의 비율은 평균 110잔기/ 1000잔기이므로 조직 중의 collagen량은 다음의 식에 따라 산출하였다.
성능/효과
- 이는 난소절제로 인해 bone turnover가 증가된 상태에서 곰피 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 점진적으로 감소한 결과로써 곰피의 골 흡수 저해 효과에 의한 것으로 추정된다. 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절제로 인하여 감소하였으나, 곰피 추출물의 투여에 의해 회복되는 경향을 나타내었다. 특히 연골 및 폐 조직에서는 난소 절제에 의해 감소한 collagen 함량이 난소 절제 후 곰피 추출물을 투여한 군에서 증가하였고, 곰피 추출물 200 mg/kg bw/day 투여군인 OVXEC200군에서 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다.
- 혈중 osteocalcin은 난소를 절제한 OVX-CON군의 경우 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 높은 경향을 나타내어 상대적으로 골 중의 osteocalcin 함량은 줄어들었음을 나타내었다. 곰피 추출물을 투여한 경우 OVX-CON군보다 혈중 osteocalcin 농도가 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으나, 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 혈중 osteocalcin은 골 대사가 균형을 유지할 때에는 골 대사 표지자로서 작용하여 폐경 후 증가하는 것으로 나타나고 골 대사가 불균형 시에는 골 형성 표지자로서 작용하여 증가 또는 감소하는 것으로 나타나 폐경 후 혈중 osteocalcin의 증감에 대한 해석이 다르게 나타날 수 있으므로 보다 많은 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- Table 4는 곰피 추출물이 혈청 ALP의 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 난소절제 시 에스트로겐 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제군에 비해 혈장 중의 ALP 활성이 증가되었으나, 난소 절제 후 곰피 추출물을 투여한 군에서는 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소절제 후 에스트로겐의 분비가 감소되는 반해 곰피 추출물 투여가 에스트로겐 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시켜준 것으로 추측되어진다.
- 한편, 골 용해 지표인 혈액 중의 CTx는 난소절제군이 비 절제군에 비해 높은 수준을 보여 난소절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다. 반면 곰피 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 감소하였으며, ES200군의 경우 SHAM군보다 높은 수준으로 나타났다. 이는 난소절제로 인해 bone turnover가 증가된 상태에서 곰피 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 점진적으로 감소한 결과로써 곰피의 골 흡수 저해 효과에 의한 것으로 추정된다.
- 일반적으로 폐경기 여성에서는 골 교체율이 증가하면서 혈청 osteocalcin 농도가 약 2배 정도 증가한다(34). 본 실험 결과 osteocalcin은 난소를 절제한 OVX-CON군의 경우 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 높은 경향을 나타내어 상대적으로 골 중의 osteocalcin 함량이 줄어들었음을 의미하고 있다. 한편 곰피 추출물을 투여한 경우 OVX-CON군보다 혈중 osteocalcin 농도가 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으나, 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 5).
- Garnero 등(37)은 폐경 후 여성을 대상으로 한 연구에서 대퇴골 골 밀도를 보정한 후에도 CTx 생성량이 높을 경우 대퇴골의 골절 위험도가 증가하였으며, 특히 폐경 후 골다공증 여성에서 정상군보다 높은 혈청 CTx 수준을 보고하여(29), 혈청 CTx가 골절 위험에 대한 예측인자로도 유용한 지표라 하였다. 본 연구에서도 난소절제군이 비 난소절제군에 비해 높은 CTx 수준을 보여 난소절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다(Table 5). 한편 곰피 추출물 50 mg/kg bw/day 투여한 군의 경우 OVX-CON군보다 낮은 CTx 함량을 나타내었으나 유의성이 없는 반면, 200 mg/kg bw/day 투여군의 경우 혈중 CTx 함량이 유의적 감소하였고, 정상군인 SHAM군과 거의 비슷한 결과를 나타내었다.
- 각 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절제에 의해 감소하는 경향을 나타내었다. 연골의 경우 난소절제에 의해 감소한 collagen 함량이 난소절제 후 곰피 추출물을 투여한 군에서 증가하였고, 특히 곰피 추출물 200 mg/kg bw/day 투여군인 OVX-EC200군에서 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 이러한 결과는 폐 조직에서도 비슷한 경향을 나타내었다.
- 이 경우의 에스트로겐 투여는 골의 무기질성분의 증가와 함께 교원섬유의 조성에도 영향을 미쳐서 골절의 예방에 효과를 지닌다고 보고되고 있다(3,4). 이상의 실험 결과 난소절제로 인해 결합 조직 중의 collagen 함량이 감소되었으나 곰피 추출물의 투여에 의해 정상군 수준으로 회복되는 경향을 나타내었다. 이는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 곰피의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
- 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절제로 인하여 감소하였으나, 곰피 추출물의 투여에 의해 회복되는 경향을 나타내었다. 특히 연골 및 폐 조직에서는 난소 절제에 의해 감소한 collagen 함량이 난소 절제 후 곰피 추출물을 투여한 군에서 증가하였고, 곰피 추출물 200 mg/kg bw/day 투여군인 OVXEC200군에서 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 한편 골 및 피부조직에서도 난소 절제에 의해 감소한 collagen 함량이 곰피 추출물 투여에 의해 증가하였고, 정상군인 SHAM군 수준 이상으로 증가하는 결과가 나타났다.
- 이러한 결과는 폐 조직에서도 비슷한 경향을 나타내었다. 한편 골 및 피부 조직에서도 난소절제에 의해 감소한 collagen 함량이 곰피 추출물 투여에 의해 증가하였고, 정상군인 SHAM군 수준 이상으로 증가하는 결과가 나타났다. 골다공증은 골무기질과 골량이 저하된 상태로 골조직의 미세구조가 변화되거나 그것으로 인하여 골이 유약해져 골절이 되기 쉬운 상태로써 에스트로겐 결핍에 의한 골다공증은 특히 골절이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 된다고 한다(41).
- 이러한 결과는 폐 조직에서도 비슷한 경향을 나타내었다. 한편 골 및 피부 조직에서도 난소절제에 의해 감소한 collagen 함량이 곰피 추출물 투여에 의해 증가하였고, 정상군인 SHAM군 수준 이상으로 증가하는 결과가 나타났다. 골다공증은 골무기질과 골량이 저하된 상태로 골조직의 미세구조가 변화되거나 그것으로 인하여 골이 유약해져 골절이 되기 쉬운 상태로써 에스트로겐 결핍에 의한 골다공증은 특히 골절이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 된다고 한다(41).
- 본 연구에서도 난소절제군이 비 난소절제군에 비해 높은 CTx 수준을 보여 난소절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다(Table 5). 한편 곰피 추출물 50 mg/kg bw/day 투여한 군의 경우 OVX-CON군보다 낮은 CTx 함량을 나타내었으나 유의성이 없는 반면, 200 mg/kg bw/day 투여군의 경우 혈중 CTx 함량이 유의적 감소하였고, 정상군인 SHAM군과 거의 비슷한 결과를 나타내었다. 따라서 이는 난소절제로 인해 bone turnover가 증가된 상태에서 곰피 추출물 투여로 인해 CTx 함량이 점진적으로 감소한 결과로써 곰피의 골 흡수 저해 효과에 의한 것으로 추정된다.
- 본 실험 결과 osteocalcin은 난소를 절제한 OVX-CON군의 경우 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 높은 경향을 나타내어 상대적으로 골 중의 osteocalcin 함량이 줄어들었음을 의미하고 있다. 한편 곰피 추출물을 투여한 경우 OVX-CON군보다 혈중 osteocalcin 농도가 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으나, 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 5). 한편, Park 등(35)은 폐경 후 여성에게 있어 혈중 osteocalcin 농도는 40%, deoxypyridinoline은 80%까지 증가하는데, 이는 골 대사에서 골 흡수가 골 형성에 비해 상대적으로 더욱 증가한 것을 의미하며, 따라서 전체적인 골 형성은 노화에 의해 그 비율이 줄어들어 골 중의 osteocalcin은 감소한 것으로 보고하였다.
- Turner 등(26)은 흰쥐에서 난소를 제거하면 성장속도가 증가하여 체중이 증가된다고 하였고, Mueller와 Hsiao(27) 및 Mook 등(28)의 연구에서도 일치된 결과를 볼 수 있었다. 한편 난소절제 후 곰피 추출물의 영향을 검토한 결과에서, OVX-ES50 및 OVX-ES200군의 체중 증가량을 SHAM군과 비교하였을 때 난소절제에 의해 증가한 체중이 곰피 추출물 투여에 의해 감소하는 경향은 나타나지 않아 곰피 추출물이 체중 감소에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. Table 3은 실험동물의 장기 중량을 나타낸 것으로, 자궁 무게의 경우 난소 절제한 OVX-CON군은 SHAM군과 비교해 감소하는 경향을 나타내었다.
- 혈중 osteocalcin은 골 대사가 균형을 유지할 때에는 골 대사 표지자로서 작용하여 폐경 후 증가하는 것으로 나타나고 골 대사가 불균형 시에는 골 형성 표지자로서 작용하여 증가 또는 감소하는 것으로 나타나 폐경 후 혈중 osteocalcin의 증감에 대한 해석이 다르게 나타날 수 있으므로 보다 많은 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다. 한편, 골 용해 지표인 혈액 중의 CTx는 난소절제군이 비 절제군에 비해 높은 수준을 보여 난소절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다. 반면 곰피 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 감소하였으며, ES200군의 경우 SHAM군보다 높은 수준으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 실험 결과 난소절제로 인해 결합 조직 중의 collagen 함량이 감소되었으나 곰피 추출물의 투여에 의해 정상군 수준으로 회복되는 경향을 나타내었다. 이는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 곰피의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
- 한편 골 및 피부조직에서도 난소 절제에 의해 감소한 collagen 함량이 곰피 추출물 투여에 의해 증가하였고, 정상군인 SHAM군 수준 이상으로 증가하는 결과가 나타났다. 이상의 실험 결과는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 곰피의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
- 한편, Park 등(35)은 폐경 후 여성에게 있어 혈중 osteocalcin 농도는 40%, deoxypyridinoline은 80%까지 증가하는데, 이는 골 대사에서 골 흡수가 골 형성에 비해 상대적으로 더욱 증가한 것을 의미하며, 따라서 전체적인 골 형성은 노화에 의해 그 비율이 줄어들어 골 중의 osteocalcin은 감소한 것으로 보고하였다. 혈중 osteocalcin은 골 대사가 균형을 유지할 때에는 골 대사 표지자로서 작용하여 폐경 후 증가하는 것으로 나타나고 골 대사가 불균형 시에는 골 형성 표지자로서 작용하여 증가 또는 감소하는 것으로 나타나 폐경 후 혈중 osteocalcin의 증감에 대한 해석이 다르게 나타날 수 있으므로 보다 많은 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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