갱년기 여성에는 여러 폐경 증후들이 나타나는데, 특히 estrogen의 감소로 인하여 급격한 골 소실로 골다공증의 위험성이 높아 이에 대한 예방 및 치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 갈조류인 대황에탄올 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성, 결합조직 중의 콜라겐 함량 및 pyridinoline 함량을 측정하였다. 폴리페놀 함량이 높은 추출물을 이용하는 것이 estrogen의 활성이 높을 것으로 예상되어, 대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타나, 동물 실험의 시료로 사용하였다. ALP는 폐경 시 estrogen의 결핍으로 인하여 골 전환이 증가하므로 골 형성의 지표로써 널리 사용되고 있다. 난소절제 시 estrogen 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제군에 비해 혈장 중의 ALP 활성이 증가되었으나, 난소 절제 후 대황 추출물을 투여한 군에서는 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소절제 후 estrogen의 분비가 감소되는데 반해 대황 추출물이 estrogen 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시킨 것으로 추측되어진다. 대황 추출물이 골 손실 회복에 미치는 영향을 검토하기 위해 연골 및 골 조직의 콜라겐 함량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다. 연골 및 골조직의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 및 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 그 생성량이 감소한 것으로 나타났다. 대황 추출물 투여에 의한 영향을 검토한 결과, 연골조직의 콜라겐 함량은 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다. 반면 골 조직의 콜라겐 함량의 경우, 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVX-EB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 또한 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 HPLC로 분석한 결과, 골 조직의 pyridinoline 함량이 난소절제 후 감소하였으나, 대황 추출물을 투여한 군(OVX-EB50)에서 대조군인 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 결과가 나타났다. 이상의 실험 결과는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 갈조류인 대황의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
갱년기 여성에는 여러 폐경 증후들이 나타나는데, 특히 estrogen의 감소로 인하여 급격한 골 소실로 골다공증의 위험성이 높아 이에 대한 예방 및 치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 갈조류인 대황 에탄올 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성, 결합조직 중의 콜라겐 함량 및 pyridinoline 함량을 측정하였다. 폴리페놀 함량이 높은 추출물을 이용하는 것이 estrogen의 활성이 높을 것으로 예상되어, 대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타나, 동물 실험의 시료로 사용하였다. ALP는 폐경 시 estrogen의 결핍으로 인하여 골 전환이 증가하므로 골 형성의 지표로써 널리 사용되고 있다. 난소절제 시 estrogen 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제군에 비해 혈장 중의 ALP 활성이 증가되었으나, 난소 절제 후 대황 추출물을 투여한 군에서는 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소절제 후 estrogen의 분비가 감소되는데 반해 대황 추출물이 estrogen 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시킨 것으로 추측되어진다. 대황 추출물이 골 손실 회복에 미치는 영향을 검토하기 위해 연골 및 골 조직의 콜라겐 함량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다. 연골 및 골조직의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 및 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 그 생성량이 감소한 것으로 나타났다. 대황 추출물 투여에 의한 영향을 검토한 결과, 연골조직의 콜라겐 함량은 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다. 반면 골 조직의 콜라겐 함량의 경우, 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVX-EB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 또한 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 HPLC로 분석한 결과, 골 조직의 pyridinoline 함량이 난소절제 후 감소하였으나, 대황 추출물을 투여한 군(OVX-EB50)에서 대조군인 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 결과가 나타났다. 이상의 실험 결과는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 갈조류인 대황의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
Menopause is often associated with several chronic diseases, including osteoporosis, cardiovascular disease, and obesity. In this study, we investigated the ability of Eisenia bicyclis (EB) to prevent bone loss in ovariectomized rats, a model for postmenopausal osteoporosis. Extracts from EB obtaine...
Menopause is often associated with several chronic diseases, including osteoporosis, cardiovascular disease, and obesity. In this study, we investigated the ability of Eisenia bicyclis (EB) to prevent bone loss in ovariectomized rats, a model for postmenopausal osteoporosis. Extracts from EB obtained using ethanol or hot water were analyzed for total polyphenol content and osteoporosis effects in vivo. Total polyphenol content was higher with extraction by hot water compared to ethanol extraction. Fifty 8-week-old female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to four groups: the group were sham-operated rats (SHAM), ovariectomized rats (OVX-CON), and ovariectomized rats that were treated with EB at 50 mg/kg body weight (OVX-EB50) and 200 mg/kg body weight (OVX-EB200), respectively. The diets were fed to rats for 6 weeks after their operation. We found that the alkaline phosphatase (ALP) activity was lower in the EB extract group compared to the OVX-CON group. Collagen and pyridinoline content, in bone and cartilage, were reduced by ovariectomy, but the supplemented EB extract groups exhibited higher concentrations in their bones. These results suggest that EB can be used for the industrial development of foods with therapeutic functions.
Menopause is often associated with several chronic diseases, including osteoporosis, cardiovascular disease, and obesity. In this study, we investigated the ability of Eisenia bicyclis (EB) to prevent bone loss in ovariectomized rats, a model for postmenopausal osteoporosis. Extracts from EB obtained using ethanol or hot water were analyzed for total polyphenol content and osteoporosis effects in vivo. Total polyphenol content was higher with extraction by hot water compared to ethanol extraction. Fifty 8-week-old female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to four groups: the group were sham-operated rats (SHAM), ovariectomized rats (OVX-CON), and ovariectomized rats that were treated with EB at 50 mg/kg body weight (OVX-EB50) and 200 mg/kg body weight (OVX-EB200), respectively. The diets were fed to rats for 6 weeks after their operation. We found that the alkaline phosphatase (ALP) activity was lower in the EB extract group compared to the OVX-CON group. Collagen and pyridinoline content, in bone and cartilage, were reduced by ovariectomy, but the supplemented EB extract groups exhibited higher concentrations in their bones. These results suggest that EB can be used for the industrial development of foods with therapeutic functions.
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문제 정의
갱년기 여성에는 여러 폐경 증후들이 나타나는데, 특히 estrogen의 감소로 인하여 급격한 골 소실로 골다공증의 위험성이 높아 이에 대한 예방 및 치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 갈조류인 대황 에탄올 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성, 결합조직 중의 콜라겐 함량 및 pyridinoline 함량을 측정하였다. 폴리페놀 함량이 높은 추출물을 이용하는 것이 estrogen의 활성이 높을 것으로 예상되어, 대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타나, 동물 실험의 시료로 사용하였다.
Estrogne 결핍에 의한 골다공증은 골절이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 되며, 이 경우의 estrogen 투여는 골의 무기질성분 증가와 함께 교원섬유의 조성에도 영향을 미쳐서 골절의 예방에 효과를 지닌다고 보고되고 있다(39). 본 연구에서는 난소절제로 인하여 estrogen이 결핍되었을 때 콜라겐 생성 변화에 있어 대황 추출물의 영향에 대하여 검토하였다(Table 7). 연골의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 콜라겐 생성량이 감소한 것으로 나타났다.
본 연구에서는 대황 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하고자 하였다. 우선 대황을 열수 및 에탄올로 추출하여 항산화 성분인 polyphenol 함량이 많이 포함된 추출물을 선택하여 동물실험에 이용하였다.
Holland 등(41)은 폐경기 골다공증 환자에게 피하 estradiol 이식술을 시행한 결과 요추와 대퇴골의 근위부에서 골밀도의 현저한 증가와 함께 성숙된 가교가 증가되고 교원섬유는 감소되었으며, 이러한 성숙된 교원섬유의 증가는 골절의 위험을 감소시킬 것 이라고 주장하였다. 이상의 실험 결과 대황 추출물 투여에 의해 난소 절제로 인해 감소되었던 골 조직 중의 pyridinoline 함량이 증가하여 대황이 콜라겐 성숙가교 형성에 유익한 효과를 주는 것으로 사료되며, 본 실험에서는 조직 내 콜라겐 중의 pyridionline의 생성량을 측정하였으나 정확한 골 분해 평가를 위해 향후 소변 중의 pyridinoline 함량 측정 또한 수행하고자 한다.
폴리페놀성 물질은 활성 프리라디칼(reactive free radical)에 수소원자를 제공하여 안정한 비 라디칼(non-radical)을 만들어 줌으로써 항산화효과를 나타내며, 해조류 중의 polyphenol성 물질은 estrogen의 활성이 있는 것으로 보고된 바 있다(28). 폴리페놀 함량이 높은 추출 방법을 이용하는 것이 estrogen의 활성이 높을 것으로 예상되어 본 연구에서는 용매에 따른 폴리페놀 함량을 측정하였다. 대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과는 Table 3과 같다.
가설 설정
3)Values are mean±SD (n=10).
3)Values are mean±SD (n=7).
제안 방법
1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다.
FUJI DRI-CHEM SLIDE 위에 분리한 혈청 10 μL를 점착하여 DRY CHEM(3600i, Fuji Co, Asaka, Japan)을 사용하여 500 nm의 파장에서 분석하였다.
45 μm disc filter를 이용하여 여과시킨 후, Arakawa 등의 방법(27)에 의해 HPLC(Shimadzu LC, Kyoto, Japan)를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Table 2에서 나타낸 바와 같이 고정상으로 Inertsil ODS-2 column을 사용하였고, 이동상은 SDS와 Na2EDTA를 함유하는 acetonitrile와 0.1 M 인산완충액(pH 3.5, 25:75)을 이용하여 Ex 295 nm 및 Em 395 nm에서 수행하였다. 결과에 관한 분석은 standard의 peak를 이용하여 pyridinoline의 peak를 파악한 후 standard area % 농도와 시료의 area % 농도를 계산하여 pyridinoline/collagen으로 나타내었다.
본 실험에 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안일대에서 채취된 것을 구입하여 물로 7～8회 씻어 염분과 불순물을 제거하고 동결건조 후 분쇄하여 실험에 사용하였다. 건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다. 위의 과정을 2회 반복하여 얻은 추출물을 감압 하에 건조하여 각각의 폴리페놀 함량을 측정하였고, 동물실험은 체중 kg 당 투여량 1 mL 중 50 mg 및 200 mg 되도록 용해하여 사용하였다.
결과에 관한 분석은 standard의 peak를 이용하여 pyridinoline의 peak를 파악한 후 standard area % 농도와 시료의 area % 농도를 계산하여 pyridinoline/collagen으로 나타내었다.
이것은 난소절제 후 estrogen의 분비가 감소되는데 반해 대황 추출물이 estrogen 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시킨 것으로 추측되어진다. 대황 추출물이 골 손실 회복에 미치는 영향을 검토하기 위해 연골 및 골 조직의 콜라겐 함량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다. 연골 및 골조직의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 및 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 그 생성량이 감소한 것으로 나타났다.
동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50～55%를 유지시켰고 물과 식이는 제한을 두지 않고 제공하였으며, 실험 시료는 증류수로 용해하여 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다.
또한 대조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고 양측의 난소를 노출하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
체중이 200～205 g인 7주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐 40마리를 (주)오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후, 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다(Table 1). 즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다.
수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 일주일간 일반 식이로 상처를 회복시킨 후 각 추출물 시료를 증류수에 용해하여 경구 투여하였다. 또한 대조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고 양측의 난소를 노출하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 일주일간 일반 식이로 상처를 회복시킨 후 각 추출물 시료를 증류수에 용해하여 경구 투여하였다.
즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50～55%를 유지시켰고 물과 식이는 제한을 두지 않고 제공하였으며, 실험 시료는 증류수로 용해하여 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다.
우선 대황을 열수 및 에탄올로 추출하여 항산화 성분인 polyphenol 함량이 많이 포함된 추출물을 선택하여 동물실험에 이용하였다. 실험동물에 인위적으로 폐경을 야기하여 estrogen 분비가 저하되었을 때 대황 추출물을 투여하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성 및 결합조직 중의 콜라겐 합성량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다.
건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다. 위의 과정을 2회 반복하여 얻은 추출물을 감압 하에 건조하여 각각의 폴리페놀 함량을 측정하였고, 동물실험은 체중 kg 당 투여량 1 mL 중 50 mg 및 200 mg 되도록 용해하여 사용하였다.
수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다(Table 1). 즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 mL의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다.
체중이 200～205 g인 7주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐 40마리를 (주)오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후, 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다(Table 1).
혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식시킨 후 에테르 마취하에 개복한 후 복대동맥에서 채취하여 혈류 측정을 위해 헤파린 처리된 튜브를 사용하고, 혈액응고 실험을 위해 3.2% sodium citrate를 1:9의 비율로 혼합하여 분석에 사용하였다. 또한 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 혈청을 분리하여 사용하였다.
대상 데이터
열수를 이용하여 추출한 경우 에탄올보다 수득율은 높았으나 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 수득율은 열수에 비해 낮지만 폴리페놀 함량이 더 높은 대황 에탄올 추출물을 동물 실험의 시료로 사용하였다.
본 실험에 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안일대에서 채취된 것을 구입하여 물로 7～8회 씻어 염분과 불순물을 제거하고 동결건조 후 분쇄하여 실험에 사용하였다. 건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다.
본 연구에서는 대황 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하고자 하였다. 우선 대황을 열수 및 에탄올로 추출하여 항산화 성분인 polyphenol 함량이 많이 포함된 추출물을 선택하여 동물실험에 이용하였다. 실험동물에 인위적으로 폐경을 야기하여 estrogen 분비가 저하되었을 때 대황 추출물을 투여하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성 및 결합조직 중의 콜라겐 합성량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다.
본 연구에서는 갈조류인 대황 에탄올 추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 alkaline phosphatase(ALP) 활성, 결합조직 중의 콜라겐 함량 및 pyridinoline 함량을 측정하였다. 폴리페놀 함량이 높은 추출물을 이용하는 것이 estrogen의 활성이 높을 것으로 예상되어, 대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타나, 동물 실험의 시료로 사용하였다. ALP는 폐경 시 estrogen의 결핍으로 인하여 골 전환이 증가하므로 골 형성의 지표로써 널리 사용되고 있다.
데이터처리
실험군당 평균±표준오차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 p<0.05 수준에서 Tukey's test를 이용하여 상호 검정하였다.
연구결과 얻어진 자료를 SPSS(statistical package for social science, version 12.0, Raleigh, NC, USA) 통계 프로그램을 사용하여 통계 분석하였다. 실험군당 평균±표준오차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 p<0.
이론/모형
적출한 결합조직 골 및 연골에 6 N HCl 10 mL를 첨가하여 110℃에서 20시간 가수분해한 후 여과 농축하여 증류수로 5배 희석한 후 시료용액으로 하였다. 결합조직의 콜라겐 함량은 Woessner법(26)을 이용하여 분석하였다. Hydroxyproline의 정량분석을 위해 조제한 시료를 다시 증류수로 일정량 희석한 후 실험에 사용하였다.
총 페놀함량은 Folin-Denis법(25)으로 측정하였다. 시료 1 mL에 95% 에탄올 1 mL, 정제수 5 mL 및 50% FolinCiocalteu reagent(Sigma, St.
콜라겐 중의 가교물질인 pyridinoline 함량 측정은 위의 방법에서 얻어진 콜라겐 분석시료를 0.45 μm disc filter를 이용하여 여과시킨 후, Arakawa 등의 방법(27)에 의해 HPLC(Shimadzu LC, Kyoto, Japan)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
ALP는 폐경 시 estrogen의 결핍으로 인하여 뼈 전환이 증가하기 때문에 폐경 후 여성의 골다공증에서 증가하는 양상을 보이며(14), 성인기 여성에서는 골절과의 관련성을 보여 폐경 전후 여성에게 있어 뼈 형성 지표로써 널리 사용되고 있다(15). Table 6의 ALP 활성 결과에서 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 ALP 활성이 유의적으로 증가하는 경향을 보였으나, 대황 추출물의 투여 군에서는 OVX-CON군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 이것은 난소절제 후 estrogen의 분비가 감소되는 것에 반해 대황 추출물의 투여가 estrogen 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시켜준 것으로 추측되어 대황 추출물의 골 흡수 저해 효과가 기대된다.
난소절제 후 대황 추출물을 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다. 골 조직에서 또한 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교해 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다. 한편 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVXEB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하였다.
ALP는 폐경 시 estrogen의 결핍으로 인하여 골 전환이 증가하므로 골 형성의 지표로써 널리 사용되고 있다. 난소절제 시 estrogen 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제군에 비해 혈장 중의 ALP 활성이 증가되었으나, 난소 절제 후 대황 추출물을 투여한 군에서는 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소절제 후 estrogen의 분비가 감소되는데 반해 대황 추출물이 estrogen 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시킨 것으로 추측되어진다.
연골 및 골조직의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 및 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 그 생성량이 감소한 것으로 나타났다. 대황 추출물 투여에 의한 영향을 검토한 결과, 연골조직의 콜라겐 함량은 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다. 반면 골 조직의 콜라겐 함량의 경우, 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVX-EB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다.
반면 골 조직의 콜라겐 함량의 경우, 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVX-EB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 또한 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 HPLC로 분석한 결과, 골 조직의 pyridinoline 함량이 난소절제 후 감소하였으나, 대황 추출물을 투여한 군(OVXEB50)에서 대조군인 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 결과가 나타났다. 이상의 실험 결과는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 갈조류인 대황의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
대황 추출물 투여에 의한 영향을 검토한 결과, 연골조직의 콜라겐 함량은 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다. 반면 골 조직의 콜라겐 함량의 경우, 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVX-EB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하는 결과가 나타났다. 또한 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 HPLC로 분석한 결과, 골 조직의 pyridinoline 함량이 난소절제 후 감소하였으나, 대황 추출물을 투여한 군(OVXEB50)에서 대조군인 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 결과가 나타났다.
한편 난소절제 군에서의 체중 증가는 여러 연구 결과가 보고되어 있는데, 특히 Gale와 Sclafani(32)는 난소절제는 식이 섭취량과 식이효율을 증가시켜 과식증(hyperphagia)과 비만을 야기한다고 보고하였으며, Lee 등(33)은 난소 절제한 쥐들의 체중과 체지방 무게의 증가를 보고하였다. 본 연구에서도 난소절제 후 대황 추출물을 투여한 모든 군에서 정상군인 SHAM군과 비교해 높은 체중 증가량을 보였다. 이는 SHAM군에 비해 난소절제 군의 사료섭취량 증가로 인해 체중 증가를 초래한 것으로 추측된다.
난소절제 및 대황 추출물의 투여에 따른 체중 변화와 식이 섭취량은 Table 4와 같다. 실험 종료 시 체중은 난소를 절제한 군(OVX)이 난소를 절제하지 않은 군(SHAM)에 비하여 높은 경향을 보였다. 이는 흰쥐에서 난소를 제거하면 성장속도가 증가하여 체중이 증가하는 것이며, 체중 증가의 대부분은 체내 지방의 축적에 기인하는 것으로 보인다.
Table 8은 결합조직인 골 및 연골 콜라겐 중의 pyridinoline 함량을 나타낸 것이다. 연골 및 골조직 모두 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 콜라겐 성숙가교 형성이 제대로 이루어지지 않았음을 나타내었다. 연골의 경우 난소절제 후 pyridinoline 함량은 대조군에 비해 회복된 결과를 나타내지 않아 콜라겐 함량의 경우와 유사한 결과를 나타내었다.
대황 추출물이 골 손실 회복에 미치는 영향을 검토하기 위해 연골 및 골 조직의 콜라겐 함량 및 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 측정하였다. 연골 및 골조직의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 및 pyridinoline 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 그 생성량이 감소한 것으로 나타났다. 대황 추출물 투여에 의한 영향을 검토한 결과, 연골조직의 콜라겐 함량은 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다.
본 연구에서는 난소절제로 인하여 estrogen이 결핍되었을 때 콜라겐 생성 변화에 있어 대황 추출물의 영향에 대하여 검토하였다(Table 7). 연골의 경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX-CON군의 콜라겐 함량이 유의적으로 감소하여, 난소절제로 인한 estrogen 결핍으로 콜라겐 생성량이 감소한 것으로 나타났다. 난소절제 후 대황 추출물을 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 대조군인 OVX-CON군에 비해 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 수준은 아니었다.
대황의 열수와 에탄올 두 용매를 이용하여 추출한 결과는 Table 3과 같다. 열수를 이용하여 추출한 경우 에탄올보다 수득율은 높았으나 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출에서 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 수득율은 열수에 비해 낮지만 폴리페놀 함량이 더 높은 대황 에탄올 추출물을 동물 실험의 시료로 사용하였다.
또한 아울러 콜라겐의 대사에 관여하는 분해효소 matrix metalloproteinase-1(MMP1)의 발현을 조절하여 콜라겐의 분해를 억제하며, estrogen이 결핍되면 비정상적으로 골재형성과정이 촉진되고 조직 내의 콜라겐 손상은 연골 조직의 노화와 골 관절염, 골다공증 병인의 원인이 된다고 한다(40). 이상의 실험 결과, 연골보다 골 조직에서 난소 절제로 인하여 감소된 콜라겐의 함량이 대황 추출물을 투여함으로써 회복되는 경향을 보였다. 이러한 변화는 estrogen 부족으로 인한 골 손실에 대황 추출물이 유익한 영향을 줄 가능성이 있는 것으로 보이며, 대황 추출물 중의 phytoestrogen 및 항산화 물질 등이 복합적으로 작용하였을 것으로 사료되어진다.
연골의 경우 난소절제 후 pyridinoline 함량은 대조군에 비해 회복된 결과를 나타내지 않아 콜라겐 함량의 경우와 유사한 결과를 나타내었다. 한편 골 조직 중의 pyridinoline 함량은 난소절제로 인하여 감소하였으나, 난소 절제 후 대황 추출물을 투여한 군에서 pyridinoline 함량이 증가하는 경향을 나타내어 콜라겐 성숙가교 형성에도 대황 추출물이 영향을 주는 것으로 나타났다. Holland 등(41)은 폐경기 골다공증 환자에게 피하 estradiol 이식술을 시행한 결과 요추와 대퇴골의 근위부에서 골밀도의 현저한 증가와 함께 성숙된 가교가 증가되고 교원섬유는 감소되었으며, 이러한 성숙된 교원섬유의 증가는 골절의 위험을 감소시킬 것 이라고 주장하였다.
골 조직에서 또한 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교해 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다. 한편 난소를 절제한 후 대황 추출물을 50 mg/kg/day 투여한 OVXEB50군에서 대조군에 비해 콜라겐 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 mg/kg/day 투여한 OVX-EB200군의 경우 유의적으로 증가하였다. 따라서 골 조직의 콜라겐 합성에는 추출물의 양을 50 mg/kg/day 정도로는 부족하여 적어도 200 mg/kg/day 정도는 투여해야 할 것으로 추측된다.
후속연구
또한 콜라겐 성숙가교인 pyridinoline 함량을 HPLC로 분석한 결과, 골 조직의 pyridinoline 함량이 난소절제 후 감소하였으나, 대황 추출물을 투여한 군(OVXEB50)에서 대조군인 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 결과가 나타났다. 이상의 실험 결과는 estrogen 부족 시 일어날 수 있는 골 손실에 대한 예방 소재로써 갈조류인 대황의 활용 가능성을 시사하고 있으며, 이를 활용한 기능성 소재 개발도 가능할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
해조류 중 갈조류는 어떤 성분이 함유되어 있는가?
해조류는 식이성 섬유소인 복합다당류를 다량 함유하고 있을 뿐 아니라 여러 비타민과 무기질이 비교적 풍부하고 그 독특한 맛과 향기가 우수한 알칼리성 기호식품으로서 가치가 높은 것으로 알려져 있다(16). 특히 갈조류에는 중성 다당류인 laminaran과 황산기를 함유한 산성 다당류가 다량 함유되어 있으며, 그 대표적인 것이 함황 산성 다당류인 fucoidan과 alginate이고, fucoidan은 항산화 활성, 항 혈액응고 작용 이외에 면역 등의 활성이 있다는 보고가 있다(17-20). 우리나라 울릉도 부근에 주로 분포되어 있는 대황(Eisenia bicyclis)은 다시마목(Laminariales) 미역과(Alariaceae)에 속하는 다년생 식물로 연안 수심 10 m 내외에서 서식하고 있으며, 줄기는 원기둥 모양이고 뿌리는 수지상이고 길이는 1～2 m에 달하며 지름은 2～3 cm로 중앙부가 좀 굵고 실질이다(21).
갱년기로 인한 일차적 estrogen 결핍은 무엇을 유발하는가?
갱년기로 인한 일차적 estrogen 결핍은 bone turnover 증가 및 파골세포(osteoclast)의 활동력 증가, 골재흡수(bone resorption)의 증가로 인한 골 손실을 급속하게 유발하고, 이차적으로는 폐경기 여성에 있어 골 형성 능력이 감소하게 되어 서서히 골 손실이 일어나는 것으로 보고되고 있다(1). 또한 폐경 후 20년간 골 손실의 75% 이상은 estrogen 결핍에서 기인하는 것으로 알려져 있다(2).
폐경 후 20년간 골 손실의 대다수는 무엇에 기인하는가?
갱년기로 인한 일차적 estrogen 결핍은 bone turnover 증가 및 파골세포(osteoclast)의 활동력 증가, 골재흡수(bone resorption)의 증가로 인한 골 손실을 급속하게 유발하고, 이차적으로는 폐경기 여성에 있어 골 형성 능력이 감소하게 되어 서서히 골 손실이 일어나는 것으로 보고되고 있다(1). 또한 폐경 후 20년간 골 손실의 75% 이상은 estrogen 결핍에서 기인하는 것으로 알려져 있다(2). 골다공증은 다양한 발생 원인에 기인되고 그에 따라 서로 다른 여러 종류의 병인이 관련되어 있어 그 원인을 간단히 이해하기에는 어려운 질환에 해당한다.
Richelson LS, Wahner HW, Melton LJ 3rd, Riggs BL. 1984. Relative contributions of aging and estrogen deficiency to postmenopausal bone loss. N Engl J Med 311: 1273-1275.
Kim SY, Chang SY, Oh HJ. 1997. Comparison of bone mineral density and lipid profiles in pre and postmenopausal women. J Korean Acad Fam Med 18: 910-917.
Kimble RB, Vannice JL, Bloedowl DC, Thompson RC, Hopfer W, Kung VT, Brownfield C, Pacifici R. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovariectomized rats. J Clin Invest 93: 1959-1967.
Dempster DW, Birchman R, Xu R, Lindsay R, Shen V. 1995. Temporal changes in cancellous bone structure of rats immediately after ovariectomy. Bone 16: 157-161.
Fujimoto D, Hirama M, Iwa T. 1982. Histidinoalanine, a new crosslinking amino acid, in calcified tissue collagen. Biochem Biophys Res Commun 104: 1102-1106.
Kim MH, Otsuka M, Arakawa N. 1994. Age-related changes in the pyridinoline content of guinea pigs cartilage and achilles tendon collagen. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 40:95-103.
Kuboki Y, Mechanic GL. 1982. Comparative molecular distribution of cross-links in bone and dentin collagen. Structure- function relationships. Calcif Tissue Int 34: 306-308.
Robins SP, Bailey AJ. 1977. The chemistry of the collagen cross-links. Characterization of the products of reduction of skin, tendon and bone with sodium cyanoborohydride. Biochem J 163: 339-346.
Seigel RC. 1976. Collagen cross-linking. Synthesis of collagen cross-links in vitro with highly purified lysyl oxidase. J Biol Chem 251: 5786-5792.
Noda M, Roodon GA. 1989. Transcriptional regulation of osteopontin production in rat osteoblast-like cells by parathyroid hormone. J Cell Biol 108: 713-718.
Ninomiya Y, Showater AM, Olsen BR. 1984. The role of extracellular matrix in development. Alan R Liss Inc., New York, NY, USA. p 225.
Schiele F, Henny J, Hitz J, Petitclerc C, Gueguen R, Siest G. 1983. Total bone and liver alkaline phosphatases in plasma: biological variations and reference limits. Clin Chem 29: 634-641.
Sung JH, Ha S, Im MH, Im JG, Kang KS. 2002. Seaweed and health. In Foods and Health. Hyungseol Press Co., Seoul, Korea. p 190.
So MJ, Kim BK, Choi MJ, Kim KY, Rhee SH, Cho EJ. 2007. Protective activity of fucoidan and alginic acid against free radical-induced oxidative stress under in vitro and cellular system. J Food Sci Nutr 12: 191-196.
Hang D, Choi HS, Kang SC, Kim KR, Sohn ES, Kim MH, Pyo S, Son E. 2005. Effects of fucoidan on NO production and phagocytosis of macrophages and the proliferation of neuron cells. J Food Sci Nutr 10: 344-348.
Haroun-Bouhedja F, Ellouali M, Sinquin C, Boisson-Vidal C. 2000. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans. Thromb Res 100: 453-459.
Kang JW. 1968. Marine algae. In I llustrated encyclopedia of fauna & flora of Korea. Ministry of Education. Vol 8, p 148-151.
Jang YH, Choi SW, Cho SH. 2008. Effect of Eisenia bicyclis and its pill on serum status in rats fed high fat diet. Korean J Nutr 41: 5-12.
Kim YM, Han CK, Bang SJ, Park JH. 2006. Effects of laminaran from Eisenia bicyclis on serum lipids in rats fed high cholesterol diet. J Korean Soc Food Sci Nutr 35: 841-846.
Cahyana AH, Shoto Y, Kinoshita Y. 1992. Pyropheophytin a as an antioxidative substance from the marine alga, Arame (Eisenia bicyclis). Biosci Biotech Biochem 56: 1533-1535.
AOAC. 2005. Official Method of Analysis. 18th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC, USA. Vol 45, p 21-22.
Woessner JF Jr. 1961. The determination of hydroxyproline in tissue and protein sample containing small proportion of this imino acid. Arch Biochem Biophys 93: 440-447.
Arakawa N, Kim M, Otsuka M. 1992. An improved highperformance liquid chromatographic assay for the determination of pyridinoline in connective tissues. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 38: 375-380.
Lee S, Jang MK, Kim NY, Jang HJ, Lee DG, Kim M, Kim YY, Kim SG, Yoo BH, Lee SH. 2010. Verification of the fractions with strong estrogenic activities from brown algae. J Life Sci 20: 1807-1811.
Wronski TJ, Cintron M, Dann LM. 1988. Temporal relationship between bone loss and increased bone turnover in ovariectomized rats. Calcif Tissue Int 43: 179-183.
Jeong SH, Lee HH, Han MY, Ryu CY, Yoon MC. 2002. Effects of fenofibrate on body weight and lipid metabolism in female mice. Journal of the Institute of Natural Science, Mokwon University 11: 27-32.
Gale SK, Sclafani A. 1977. Comparison of ovarian and hypothalamic obesity syndromes in the female rat: effect of diet palatability on food intake and body weight. J Comp Physiol Psychol 91: 381-392.
Park WD, Hwang JS, Hur JW, Ahn SH, Park SK, Kwak CS. 1999. Activities of $\alpha$ -D-mannosidase and $\beta$ -D-mannosidase in patients with liver diseases. Korean J Gastroenterol 33: 211-221.
Riis BJ. 1993. Biochemical markers of bone turnover. II: Diagnosis prophylaxis, and treatment of osteoporosis. Am J Med 95: 17S-21S.
Kim IG, Kim SB, Kim JG, Kim KC, Chun KC, Park HK, Lee KS. 1993. Serum enzymes as indicators of radiation exposure in rat. J Radiation Protection 18(2): 37-44.
Mcconkey B, Fraser GM, Bligh AS, Whiteley H. 1963. Transparent skin and osteoporosis. Lancet 281: 693-695.
Odell WD, Heath H 3rd. 1993. Osteoporosis pathophysiology, prevention, diagnosis, and treatment. Dis Mon 39:789-867.
Clark AP, Schuttinga JA. 1992. Targeted estrogen/progesterone replacement therapy for osteoporosis: calculation of health care cost savings. Osteoporos Int 2: 195-200.
Holland EF, Studd JW, Mansell JP, Leather AT, Bailey AJ. 1994. Changes in collagen composition and cross-links in bone and skin of osteoporotic postmenopausal women treated with percutaneous estradiol implants. Obstet Gynecol 83:180-183.
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