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문제 정의
- , 2007)있으나, 이들 병원체의 국내 이동에 대해서는 전혀 보고된 바 없다. 본 연구는 전라북도에 소재한 무지개송어 양식장에서 IHNV를 분리하였고, 분리된 IHNV의 G 단 백질 유전자를 분석하여 IHNV가 어디에서 이동되었는지를 추정하였으며, 국내의 IHNV의 유전자적 변이율에 대해서도 검토하였다.
제안 방법
- (2009)의 논문에 기입된 것을 참고하였다. Alignment된 유전자들은 Mega4 프로그램 (Tamura et al., 2007)의 neighbor joining criteria를 사용하여 계통학적 분석을 실시하였으며, Radial tree는 NJplot와 Unrooted (Perriere and Gouy, 1996) 소프트웨어를 사용하여 제작하였다.
- CPE가 나타난 세포에서의 바이러스 게놈 RNA는 RNA 분리 키트 (Isogen, Nippon Gene, Japan)를 사용하여 RNA를 추출하였고, 그 추출된 RNA는 역전사 반응 (Reverse transcription)을 위해 One Step RT-PCR Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 반응은 합성된 cDNA 2 ㎕, 1.
- PCR 반응은 합성된 cDNA 2 ㎕, 1.25 U Ex Taq DNA polymerase (Takara, Japan), 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2와 Nishizawa et al. (2006)에 의해 디자인 된 HG(-31:-12)(5’- AGA ACG CAA CTC GCA GAG AC - 3’)와 HG (1602:1622)(5’- GTG GGG AGG AAG TGA AGA TTG - 3’)의 IHNV의 G gene open reading frame (ORF) 부분의 primer를 각각 1 μM씩 혼합하여 최종 volume이 20 ㎕가 되도록 준비하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 PCR Purification Kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제하였으며, 정제 후 T-easy vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 그 후 plasmid extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 plasmid DNA를 분리하였고, 분리된 plasmid DNA는 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing하였다. Sequencing에 사용된 primer는 T7, SP6 primer와 ID4 primer (5’-CTC TGG ACA AGC TCT CCA AGG-3’) (Miller et al.
- 세포는 epithelioma papillosum cyprinid (EPC)를 사용하였고, 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 100 IU/mL 페니실린 G와 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 MEM (Gibco, USA)배지와 함께 25 ㎠ T-Flask (Falcon, USA)에 15℃의 배양기에서 배양했으며, 2주간 배양된 세포를 24 well plate (Corning, USA)에 1 ml/well씩 분주한 후, 15 ℃ 배양기에서 overnight 배양하였다. 그 후, 준비된 세포 접종액 100 ㎕를 세포에 접종하여 15℃ 배양기에서 2주간 배양하면서 세포변성효과 (cytopathic effect; CPE)를 관찰하였다.
- 5 mL micro-tube에 넣었다. 시료는 MEM으로 10배 희석하고 마쇄하였고, 6,000rpm, 4℃, 30분의 조건으로 원심 분리하여 4℃ 냉장고에서 overnight 한 후 상층액을 세포 접종용으로 사용하였다.
- 염기서열 data는 Bioedit program을 사용하여 결과를 분석하였고, clustal X (Thompson et al., 1994; 1997)를 사용하여 Genbank에 등록된 세계의 IHNV G ORF full 유전자 49 분리주들과 함께 alignment하였다. 49개의 IHNV G gene sequence data의 Genbank 등록번호는 Kim et al.
- 0과 1mM EDTA) gel을 사용하여 전기영동하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR Purification Kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제하였으며, 정제 후 T-easy vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 그 후 plasmid extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 plasmid DNA를 분리하였고, 분리된 plasmid DNA는 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing하였다.
대상 데이터
- Sequencing에 사용된 primer는 T7, SP6 primer와 ID4 primer (5’-CTC TGG ACA AGC TCT CCA AGG-3’) (Miller et al., 1998)를 사용하였다.
- 세포는 epithelioma papillosum cyprinid (EPC)를 사용하였고, 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 100 IU/mL 페니실린 G와 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 MEM (Gibco, USA)배지와 함께 25 ㎠ T-Flask (Falcon, USA)에 15℃의 배양기에서 배양했으며, 2주간 배양된 세포를 24 well plate (Corning, USA)에 1 ml/well씩 분주한 후, 15 ℃ 배양기에서 overnight 배양하였다. 그 후, 준비된 세포 접종액 100 ㎕를 세포에 접종하여 15℃ 배양기에서 2주간 배양하면서 세포변성효과 (cytopathic effect; CPE)를 관찰하였다.
이론/모형
- , 1994; 1997)를 사용하여 Genbank에 등록된 세계의 IHNV G ORF full 유전자 49 분리주들과 함께 alignment하였다. 49개의 IHNV G gene sequence data의 Genbank 등록번호는 Kim et al. (2007)과 Mochizuki et al. (2009)의 논문에 기입된 것을 참고하였다. Alignment된 유전자들은 Mega4 프로그램 (Tamura et al.
성능/효과
- 전라북도 소재의 양식장에서 양식된 무지개송어 친어 5마리 중 1마리의 난과 난액에서 IHNV가 분리되었다. IHNV HG primer set를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 약 1.6kb의 PCR산물이 증폭되었고, 증폭된 산물은 IHNV G 단백질의 508 아미노산이 코딩된 1.527 base의 단일 ORF가 포함되어 있음이 확인되었다 (data not shown, Genbank accession number; HM021723). IHNV ORF Full 길이 G 유전자 염기서열을 기초로 한 방사상의 계통학적 분석 tree는 Fig.
- 무지개 송어 발안란의 이동 이력과 IHNV G gene 염기서열의 계통학적 분석에 의해 IHNV의 국내 이동에 대해서 처음으로 조사되었다. IHNV RtWanju09 분리주는 IHNV RtPy91과 RtJe00의 JRt Shizuoka lineage에 속하는 것으로 나타났으며, 강원도에서 분리된 IHNV RtPy91과 RtWanju09 사이의 G gene의 유전적 차이는 1.77%였고, 약 20년간 우리나라의 JRt Shizuoka lineage에 속하는 한국 분리주들은 최대 3.03%의 유전적 차이를 나타내 계속적으로 바이러스가 진화하는 것을 알 수 있었다. 또한 전라북도 지역에서 분리된 IHNV RtWanju09 분리주는 IHNV가 오염된 강원도 지역산 발안란이 전라북도에 전파되었을 것으로 사료된다.
- 이 발안란은 어느 한 시점에 외국에서 수입되었으며, 그 후 양식기술의 발달로 계속적인 완전생산이 가능해 생산된 발안란 또는 무지개송어는 양식업자 사이에서는 한국산 무지개송어라 불리우는 것이었다. IHNV RtWanju09의 G 유전자를 분석한 결과 JRt Shizuoka에 속해 있는 것으로 확인되었으며 (Fig. 1), IHNV RtJe00과 RtPy91과 계통학적으로 유사한 JRt Shizuoka의 Korean isolates 그룹에 함께 포함되었으며, 유전적으로 강원도의 RtPy91과의 유전적 차이는 1.77% 였다 (Table 1). 따라서, 전라북도에 위치한 무지개송어 양식장에서의 IHNV는 발안란의 이동 이력과 IHNV의 계통학적 분석을 통해 이 바이러스는 JRt Shizuoka에 속하는 한국의 강원도에서 전라북도 소재의 양식장으로 이동되었을 가능성이 높다.
- 03%여서 바이러스의 변이가 계속 진행중인 것으로 사료되었다. 그러나, JRt Nagano lineage 사이의 두 바이러스의 변화율은 0.68%에 불과하며, JRt Shizuoka lineage와 JRt Nagano lineage 사이의 바이러스 변화율은 최대 5.03% 인 것으로 나타나 lineage와 lineage 사이의 바이러스 유전자는 큰 폭의 차이가 있음이 밝혀졌다 (Table 1).
- 77% 였다 (Table 1). 따라서, 전라북도에 위치한 무지개송어 양식장에서의 IHNV는 발안란의 이동 이력과 IHNV의 계통학적 분석을 통해 이 바이러스는 JRt Shizuoka에 속하는 한국의 강원도에서 전라북도 소재의 양식장으로 이동되었을 가능성이 높다. 또한 이 바이러스는 RtPy91 이 기원으로 제천과 전라북도에 이동된 것으로 추정되며 (Fig.
- 따라서, 전라북도에 위치한 무지개송어 양식장에서의 IHNV는 발안란의 이동 이력과 IHNV의 계통학적 분석을 통해 이 바이러스는 JRt Shizuoka에 속하는 한국의 강원도에서 전라북도 소재의 양식장으로 이동되었을 가능성이 높다. 또한 이 바이러스는 RtPy91 이 기원으로 제천과 전라북도에 이동된 것으로 추정되며 (Fig. 1), 약 20여년이 지나는 사이에 JRt Shizuoka lineage 사이의 바이러스의 변화율은 최대 3.03%여서 바이러스의 변이가 계속 진행중인 것으로 사료되었다. 그러나, JRt Nagano lineage 사이의 두 바이러스의 변화율은 0.
후속연구
- 본 연구에서 분리된 IHNV RtWanJu09는 고병원성인 JRt Shizuoka lineage에 속하는 것으로 나타나, 발안란 또는 무지개송어의 이동에 있어 소독을 철저히 하고, 이러한 고병원성의 바이러스가 확산되지 않도록 주의해야할 필요가 있을 것으로 사료된다.
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