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문제 정의
- 2007). 본 논문에서는 생명공학 들잔디 개발을 위한 연구 현황 및 동향을 이해하기 위하여, 현재까지 보고된 들잔디의 조직배양 및 형질전환체계를 분석하고 개발된 형질전환 들잔디의 연구 현황 등에 대해 알아보고자 한다.
- 이상과 같이 들잔디의 조직배양체계가 확립되어 실제 형질전환 들잔디 식물체 생산에 이용되고 있지만 식물체 재분화 능력이 있는 배발생 캘러스가 유도되는 효율이 매우 낮고 선발된 배발생 캘러스도 일정시간 (약 1~2년)이 지나면 재분화 능력을 상실하게 되는 등의 문제점이 있어, 보다 안정적인 형질전환 식물을 생산하기 위해서는 고효율의 배발생 캘러스 유도 및 유지･증식법의 개발이 필요하다. 이에 본 연구진은 선발된 배발생 캘러스의 효율적인 유지 및 증식에 현탁배양법의 적합성을 검토하였다. 그 결과 현탁배양에 의한 배발생 캘러스의 증식속도는 기존의 고체 배양법보다 빨랐으며, 캘러스의 형태도 고체배양한 것보다 균일함을 알 수 있었다.
제안 방법
- Bae 등 (2007)은 GMO격리포장에 식재된 제초제 저항성 들잔디의 근권세균을 포함한 토양미생물 및 풀무치의 장내 미생물로의 bar 유전자 및 hpt 유전자의 전달 여부를 Southern blot (Fig. 7) 및 genomicPCR (Fig. 8)을 이용하여 조사하였다. 그 결과 비선택성 제초제 저항성 들잔디로부터 토양 미생물이나 비표적생물인 풀무치의 장내 세균으로의 수평적 유전자전달은 확인되지 않았다.
- 4d). 또한 위와 같은 연구 결과들을 토대로 수립된 형질전환체계를 이용하여 제초제 저항성, 음지회피성 조절, 환경 스트레스 내성 관련 유전자 등을 도입한 형질전환 들잔디를 제조하여 그 특성을 분석하고 있다. 그러나 형질전환 들잔디 개발 관련 학술지발표는 현재까지도 10개가 되지 않을 정도로 미미한 결과를 보이고 있는데, 이는 재현성 있고 안정적인 형질전환이 매우 어려움을 단적으로 보여주는 것이라 생각된다.
- 2로 조정한 감염배지 및 공동배양 배지를 사용하여 Agrobacterium 을 접종하면 형질전환 효율이 증대됨을 보고 하였고, Kim 등 (2004)은 particle bombardment를 이용하여 캘러스에 상처를 유발 시킨 후 Agrobacterium을 감염시키면 무처리구에 비하여 3배 이상 높은 형질전환 효율을 보인다는 연구 결과를 보고한 바 있다. 본 연구진은 Agrobacterium 감염 직전의 캘러스를 초음파 처리하여 형질전환 효율에 미치는 영향을 검토 하였는데, 초음파 처리구는 무처리구에 비해 월등히 높은 형질전환 효율을 나타내었다 (Fig. 4b~c). 그러나 캘러스에 상처를 유발하는 전처리는 감염효율을 증대시키는 효과는 있었지만 박테리아의 과잉증식 등에 의한 영향으로 재분화 효율이 크게 감소하는 문제점이 있었다.
- 간단히 살펴보면, 선발된 재분화 능력이 좋은 배발생 캘러스를 Agrobacterium 접종 약 1주일 전에 전배양 배지에서 배양하고, Agrobacterium을 재현탁한 액체감염배지에서 약 24시간 동안 현탁 배양하여 감염 한 후 약 3일간 공동 배양한다. 이 후 bialaphos 또는 phosphinothricin (PPT)을 포함하는 캘러스 선발배지에서 약 3~6주간 배양하며 살아있는 캘러스를 선발한 후 재분화 배지에 치상하고 재분화를 유도한다. 유도된 재분화 식물체는 뿌리를 유도하고 충분히 증식시킨 후 목적유전자의 도입 여부를 확인한다.
- 2007). 이들 결과를 살펴보면, 감염시의 Agrobacterium의 농도가 높을수록 그리고 감염시간 및 공동배양 기간이 길어질수록 캘러스로의 유전자 도입 효율은 증가하였으나 박테리아에 의한 오염이 심각하여 공동배양 후의 캘러스를 멸균수 등으로 세정하는 과정을 필요로 했다. 그러나 한번 박테리아에 오염된 캘러스는 세정 등의 과정을 거치더라도 또다시 박테리아의 오염이 생길 가능성이 높고, 재분화 효율 역시 매우 낮아지게 되므로 성공적인 들잔디 형질전환을 위해서는 감염효율을 최대한 높이면서 동시에 박테리아의 과잉 증식이 되지 않는 감염조건의 확립이 필요하였다.
- 그러나 한번 박테리아에 오염된 캘러스는 세정 등의 과정을 거치더라도 또다시 박테리아의 오염이 생길 가능성이 높고, 재분화 효율 역시 매우 낮아지게 되므로 성공적인 들잔디 형질전환을 위해서는 감염효율을 최대한 높이면서 동시에 박테리아의 과잉 증식이 되지 않는 감염조건의 확립이 필요하였다. 이에 본 연구진은 전배양배지 (Pre-culture I 또는 Pre-culture II 배지)에서 전배양한 캘러스를 Agrobacterium의 농도를 OD600nm = 0.1로 조정한 감염배지에서 24시간 동안 감염하고 (현탁배양; 25℃, 110 rpm), 3일간 공동배양 함으로서 박테리아의 오염을 최소화 하면서도 형질전환 효율은 초음파 처리구 (Fig. 4c) 에 크게 뒤지지 않는 감염방법을 고안하였다 (Fig. 4d). 또한 위와 같은 연구 결과들을 토대로 수립된 형질전환체계를 이용하여 제초제 저항성, 음지회피성 조절, 환경 스트레스 내성 관련 유전자 등을 도입한 형질전환 들잔디를 제조하여 그 특성을 분석하고 있다.
- 형질전환에 의해 개발된 유전자 변형 식물의 상업화를 위해서는 반드시 환경위해성평가를 수행하여 유전자 변형 식물이 생태계에 유해한 영향을 미치지 않음을 증명해야 한다. 제초제 저항성 들잔디 (Zoysia japonica Steud. Jeju green21)는 환경위해성 평가 항목 중에서 매우 중요한 위치를 차지하는 화분의 비산에 따른 유전자의 이동성(Fig. 6, adopted from Bae et al. 2008)을 포함하여 비 표적 생물체로의 수평적 유전자 이동 (Horizontal Gene Transfer) 가능성 (Fig. 7~8, adopted from Bae et al. 2007), 인체에 대한 알러지 반응성 (Table 3, adopted from Bae et al. 2008) 등 각종 환경 위해성 평가를 수행하였다. 제초제 저항성 들잔디로부터 야생형 들잔디로의 유전자 이동 가능성은 여러 형태의 시험 모형을 이용하여 평가 되었다.
대상 데이터
- 그 결과 비선택성 제초제 저항성 들잔디로부터 토양 미생물이나 비표적생물인 풀무치의 장내 세균으로의 수평적 유전자전달은 확인되지 않았다. 또한 제조제 저항성 들잔디의 인체 알러지 반응성이 검사되었는데, 이 검사에는 20개의 공통항원을 포함하여 야생형과 제초제 저항성 들잔디의 화분단백질이 이용되었다. 검사 결과, 야생형과 제초제 저항성 들잔디의 알러지 감작률은 동일한 수치를 나타내었고(Table 3, adopted from Bae et al.
- 유도된 캘러스를 같은 배지에 계대배양하면서 1~3개월간 배양하면 Figure 1c의 상부처럼 밝은 노란색의 캘러스가 생성된다. 이런 형태의 캘러스만을 선발하여 캘러스 증식 및 유지 배지에 치상하고 4~6주 간격으로 계대 배양 후, 증식 능력이 좋고 재분화가 잘되는 형태 (Fig. 1d, yellow compact and very friable)의 배발생 캘러스 계통만을 선발한다. 이렇게 선발된 각 계통의 캘러스는 재분화 시험을 수행하여 (Fig.
성능/효과
- 또한 제조제 저항성 들잔디의 인체 알러지 반응성이 검사되었는데, 이 검사에는 20개의 공통항원을 포함하여 야생형과 제초제 저항성 들잔디의 화분단백질이 이용되었다. 검사 결과, 야생형과 제초제 저항성 들잔디의 알러지 감작률은 동일한 수치를 나타내었고(Table 3, adopted from Bae et al. 2008) 이는 들잔디의 알러지 유발성이 유전자 도입에 의한 영향을 받지 않았음을 시사한다. 이들 결과에서 제초제 저항성 들잔디는 환경에 대한 위해성이 매우 낮을 것으로 생각되고 있다.
- 8)을 이용하여 조사하였다. 그 결과 비선택성 제초제 저항성 들잔디로부터 토양 미생물이나 비표적생물인 풀무치의 장내 세균으로의 수평적 유전자전달은 확인되지 않았다. 또한 제조제 저항성 들잔디의 인체 알러지 반응성이 검사되었는데, 이 검사에는 20개의 공통항원을 포함하여 야생형과 제초제 저항성 들잔디의 화분단백질이 이용되었다.
- 이에 본 연구진은 선발된 배발생 캘러스의 효율적인 유지 및 증식에 현탁배양법의 적합성을 검토하였다. 그 결과 현탁배양에 의한 배발생 캘러스의 증식속도는 기존의 고체 배양법보다 빨랐으며, 캘러스의 형태도 고체배양한 것보다 균일함을 알 수 있었다. 또한, 현탁배양에 의해 증식된 캘러스는 고체배양한 캘러스와 같이 높은 재분화능을 유지함을 확인하였다 (Fig.
- 그 결과 현탁배양에 의한 배발생 캘러스의 증식속도는 기존의 고체 배양법보다 빨랐으며, 캘러스의 형태도 고체배양한 것보다 균일함을 알 수 있었다. 또한, 현탁배양에 의해 증식된 캘러스는 고체배양한 캘러스와 같이 높은 재분화능을 유지함을 확인하였다 (Fig. 2). 현재는 이 현탁배양법을 Agrobacterium 감염 직전의 캘러스 증식이나 전배양에 이용하고 있으며, 향후 재분화능을 유지하며 배양 할 수 있는 기간이 어느 정도인지 검토할 예정이다.
- 이런 과정을 통한 들잔디의 형질전환 효율은 약 1% 전후이고, 형질전환에 사용된 배발생 캘러스의 계통에 따라 그 효율 및 재현성에 큰 차이를 보이고 있다. 배발생 캘러스를 이용한 들잔디의 형질전환에서는 재분화 효율이 높고 Agrobacterium에 감염능이 좋은 배발생 캘러스를 선발하는 것이 가장 중요한 것으로 보이며, Agrobacterium 접종 단계에서의 처리방법 역시 형질전환 효율에 큰 영향을 미치는 것으로 여겨진다. Agrobacterium 접종 전단계로 캘러스를 Agrobacterium 접종 3~7일 전에 전배양배지에 처리하거나 접종 하루 전에 50 mg/L의 acetosyringone(AS)을 첨가한 액체감염배지에 처리하는 방법과 Agrobacterium 배양 시에 acetosyringone을 첨가하는 등 여러 조건이 검토되었고 이와 같은 처리들은 형질전환 효율을 높이는데 효과가 있는 것으로 생각되고 있다.
- 형질전환을 목적으로 한 들잔디의 조직배양에서 가장 중요한 점은 재분화 능력이 좋은 캘러스를 선발하고 그 캘러스를 균일한 형태로 유지･증식하는 것이다. 성숙종자로부터 재분화능이 좋은 배발생 캘러스를 유도하는데는 MS기본배지에 2,4-D와 BA의 혼용처리가 가장 적합하고, 선발된 재분화능이 좋은 배발생 캘러스를 균일한 형태로 유지 및 증식하는데는 2,4-D와 KI의 혼용처리가 가장 적합한 것으로 나타났다. 선발된 배발생 캘러스의 재분화에는 sucrose 대신에 maltose를 사용하는 것이 보다 효과적이었고, 호르몬 조합으로는 BA단독처리 (Toyama et al.
- 제초제 저항성 들잔디로부터 야생형 들잔디로의 유전자 이동 가능성은 여러 형태의 시험 모형을 이용하여 평가 되었다. 이 중 제초제 저항성 들잔디로부터 반경 9 m 이내의 야생형 들잔디와의 교배 가능성 검정 모형에서의 시험 결과, 0.5 m 거리에서 약 1.2%의 교배율이 관찰되었고 3 m 이상의 거리에서는 자연 교배된 식물체는 관찰되지 않았다 (Fig. 6). 따라서 비선택성 제초제 저항성 들잔디의 유전자 이동 가능성은 3 m 이상의 거리에서는 매우 낮을 것으로 생각되고 있다.
- 2006). 이 중에서 stolon을 이용한 형질전환은 방법이 간단하고 단시간에 형질전환 식물을 얻을 수 있는 장점이 있다고 생각되어 우리 연구소에서도 시도해 보았으나 안정적인 재료의 확보가 어렵고, 무엇보다 식물재료의 오염 제거가 쉽지 않은 문제점이 있어 실제로 형질전환에 적용하기에는 효율적이지 못한 측면이 있다고 판단되었다.
후속연구
- 그러나 형질전환 들잔디 개발 관련 학술지발표는 현재까지도 10개가 되지 않을 정도로 미미한 결과를 보이고 있는데, 이는 재현성 있고 안정적인 형질전환이 매우 어려움을 단적으로 보여주는 것이라 생각된다. 따라서 다양한 특성을 가진 실용적 가치가 있는 형질전환 들잔디의 개발을 위해서는 보다 효율적이고 안정적인 조직배양 및 형질전환체계를 확립하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 판단된다.
- 이들 결과에서 제초제 저항성 들잔디는 환경에 대한 위해성이 매우 낮을 것으로 생각되고 있다. 이러한 제초제 저항성 들잔디가 현재 진행중인 상업재배를 위한 농업용 유전자 변형 생물체의 환경위해성심사를 통과하여 상업화에 성공한다면 분자육종을 통한 신품종 작물개발의 좋은 모델이 되어 국내 작물육종 산업의 발전에 크게 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 다만, 2-IP와 GA3를 혼용처리 한 경우가 다른 처리구보다 multiple-shoots을 형성하는 경향이 있는 것으로 나타났다. 이상과 같이 들잔디의 조직배양체계가 확립되어 실제 형질전환 들잔디 식물체 생산에 이용되고 있지만 식물체 재분화 능력이 있는 배발생 캘러스가 유도되는 효율이 매우 낮고 선발된 배발생 캘러스도 일정시간 (약 1~2년)이 지나면 재분화 능력을 상실하게 되는 등의 문제점이 있어, 보다 안정적인 형질전환 식물을 생산하기 위해서는 고효율의 배발생 캘러스 유도 및 유지･증식법의 개발이 필요하다. 이에 본 연구진은 선발된 배발생 캘러스의 효율적인 유지 및 증식에 현탁배양법의 적합성을 검토하였다.
- 현재까지 개발된 형질전환 들잔디는 제초제 저항성과 해충 저항성의 두 종류에 불과하지만, 앞으로 환경 스트레스 저항성, 노화지연 등 고부가가치 형질이 도입된 형질전환 들잔디 식물체들이 개발되어, 지속적으로 증가하고 있는 잔디 품종에 대한 수요에 부응 할 수 있을 것으로 기대하고 있다.
- 2). 현재는 이 현탁배양법을 Agrobacterium 감염 직전의 캘러스 증식이나 전배양에 이용하고 있으며, 향후 재분화능을 유지하며 배양 할 수 있는 기간이 어느 정도인지 검토할 예정이다.
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