종자 발달과 발아는 수분과 양분 함량의 급격한 변화를 수반하는 복합적인 과정이다. 본 연구에서는 유전자 발현과 단백질 구조 비교 분석을 통해 벼 종자의 발아와 발달과정에 관여하는 액포막 aquaporin (tonoplast intrinsic protein)을 규명하였다. OsTIP3;1, OsTIP3;2는 종자 특이적인 TIP로 종자가 성숙되는 시기에 발현되었다가, 종자가 발아하면서 전사체가 사라지는 양상을 보였으며, ABA 처리에 의해 발현이 유도되었다. 단백질 구조 예측 결과로부터 OsTIP3;1, OsTIP3;2가 단백질의 N-말단, B와 E loop에 다른 TIP와 뚜렷이 구분되는 인산화 잔기 특징을 확인하였다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3은 종자가 발달하는 과정에서 유전자 발현이 감소하였다가, 종자 발아 후기에 뿌리와 배축의 신장이 활발한 시기에 발현이 급증하였다. 특히 OsTIP2;1은 뿌리에서 강한 발현을 보였으므로, 뿌리 생장에 필요한 팽압 공급에 중요한 기능을 할 것으로 제안된다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3 단백질의 N-말단에는 특징적으로 메틸화 (methylation) 가능성이 높은 아미노산 잔기가 예측되었다. OsTIP2;2는 OsTIP2;1과는 달리 종자 침윤 후 7시간 이내에 발현이 빠르게 유도되며, 발아가 억제되는 조건에서도 유전자 발현이 유지되는 것으로 보아 종자의 초기 수화 과정에 관여할 것으로 추측된다. OsTIP2;2 단백질의 N-말단에는 OsTIP2;1에 존재하는 인산화 Ser 잔기와 메틸화 잔기가 결실된 특징을 보였다. 이런 결과들은 벼 종자의 발달과 발아 과정에서 나타나는 액포의 종류와 기능에 따라 서로 다른 TIP가 선택적으로 유전자 발현수준에서 조절되며, 인산화, 메틸화 등 단백질 수식에 의한 활성조절 기작 역시 매우 다르다는 것을 시사한다.
종자 발달과 발아는 수분과 양분 함량의 급격한 변화를 수반하는 복합적인 과정이다. 본 연구에서는 유전자 발현과 단백질 구조 비교 분석을 통해 벼 종자의 발아와 발달과정에 관여하는 액포막 aquaporin (tonoplast intrinsic protein)을 규명하였다. OsTIP3;1, OsTIP3;2는 종자 특이적인 TIP로 종자가 성숙되는 시기에 발현되었다가, 종자가 발아하면서 전사체가 사라지는 양상을 보였으며, ABA 처리에 의해 발현이 유도되었다. 단백질 구조 예측 결과로부터 OsTIP3;1, OsTIP3;2가 단백질의 N-말단, B와 E loop에 다른 TIP와 뚜렷이 구분되는 인산화 잔기 특징을 확인하였다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3은 종자가 발달하는 과정에서 유전자 발현이 감소하였다가, 종자 발아 후기에 뿌리와 배축의 신장이 활발한 시기에 발현이 급증하였다. 특히 OsTIP2;1은 뿌리에서 강한 발현을 보였으므로, 뿌리 생장에 필요한 팽압 공급에 중요한 기능을 할 것으로 제안된다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3 단백질의 N-말단에는 특징적으로 메틸화 (methylation) 가능성이 높은 아미노산 잔기가 예측되었다. OsTIP2;2는 OsTIP2;1과는 달리 종자 침윤 후 7시간 이내에 발현이 빠르게 유도되며, 발아가 억제되는 조건에서도 유전자 발현이 유지되는 것으로 보아 종자의 초기 수화 과정에 관여할 것으로 추측된다. OsTIP2;2 단백질의 N-말단에는 OsTIP2;1에 존재하는 인산화 Ser 잔기와 메틸화 잔기가 결실된 특징을 보였다. 이런 결과들은 벼 종자의 발달과 발아 과정에서 나타나는 액포의 종류와 기능에 따라 서로 다른 TIP가 선택적으로 유전자 발현수준에서 조절되며, 인산화, 메틸화 등 단백질 수식에 의한 활성조절 기작 역시 매우 다르다는 것을 시사한다.
Rice seed maturation and germination involve drastic changes in water and nutrient transport, in which tonoplast aquaporins may play an important role. In the present study, gene expression profiles of 10 tonoplast intrinsic proteins (TIP) from rice were investigated by RT-PCR during seed developmen...
Rice seed maturation and germination involve drastic changes in water and nutrient transport, in which tonoplast aquaporins may play an important role. In the present study, gene expression profiles of 10 tonoplast intrinsic proteins (TIP) from rice were investigated by RT-PCR during seed development and germination. OsTIP3;1 and OsTIP3;2 were specifically expressed in mature seeds. Their transcript level rapidly decreased after onset of seed germination and gene expression was induced by ABA treatment. In contrast, expression of OsTIP2;1 and OsTIP4;3 was not seed specific as transcripts were found in vegetative tissues as well. Their respective transcript levels decreased at an early stage of seed development, whereas they increased at a later stage of seed germination and elongation of embryonic roots and shoots. When seed germination was inhibited by various stress conditions and ABA, expression of OsTIP2;1 and OsTIP4;3 was completely suppressed. In contrast, the expression level of OsTIP2;2 rapidly increased after seed imbibition and the transcript level was maintained under conditions inhibiting seed germination. These results implicate that tissue specific and developmental transcriptional regulation of OsTIPs in rice seeds depends on their specific function. In addition, OsTIPs can be discriminated by different potential phosphorylation and methylation sites in their protein structures. OsTIP3;1 and OsTIP3;2 possess unique phosphorylation signatures at their N-terminal domain, loop B and loop E, respectively. OsTIP2;1 and OsTIP4;3 have a potential methylation site at their Nterminal domain. This suggests that activity of specific tonoplast aquaporins may be regulated by post-translational modification as well as by transcriptional control.
Rice seed maturation and germination involve drastic changes in water and nutrient transport, in which tonoplast aquaporins may play an important role. In the present study, gene expression profiles of 10 tonoplast intrinsic proteins (TIP) from rice were investigated by RT-PCR during seed development and germination. OsTIP3;1 and OsTIP3;2 were specifically expressed in mature seeds. Their transcript level rapidly decreased after onset of seed germination and gene expression was induced by ABA treatment. In contrast, expression of OsTIP2;1 and OsTIP4;3 was not seed specific as transcripts were found in vegetative tissues as well. Their respective transcript levels decreased at an early stage of seed development, whereas they increased at a later stage of seed germination and elongation of embryonic roots and shoots. When seed germination was inhibited by various stress conditions and ABA, expression of OsTIP2;1 and OsTIP4;3 was completely suppressed. In contrast, the expression level of OsTIP2;2 rapidly increased after seed imbibition and the transcript level was maintained under conditions inhibiting seed germination. These results implicate that tissue specific and developmental transcriptional regulation of OsTIPs in rice seeds depends on their specific function. In addition, OsTIPs can be discriminated by different potential phosphorylation and methylation sites in their protein structures. OsTIP3;1 and OsTIP3;2 possess unique phosphorylation signatures at their N-terminal domain, loop B and loop E, respectively. OsTIP2;1 and OsTIP4;3 have a potential methylation site at their Nterminal domain. This suggests that activity of specific tonoplast aquaporins may be regulated by post-translational modification as well as by transcriptional control.
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문제 정의
2008), 구조와 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 이 논문에서는 벼 유전자 발현분석을 통하여 종자발달과 발아와 연관된 OsTIP를 구분하였고, 단백질의 구조 비교분석을 통해 활성 조절 기작의 차이점에 대한 가능성을 논의하였다.
3B). 이런 결과들은 OsTIP3;1과 OsTIP3;2이 종자 특이적으로 발현되는 TIP로서 ABA에 의해서 조절되는 종자발달에 중요한 기능을 수행할 가능성을 강하게 시사하는 것이다. 최근 형광기법을 이용한 연구결과는 애기장대 종자성숙과 발아 초기단계의 배에서 오직 α-TIP만이 존재하고 있음을 보여준다 (Hunter et al.
종자 발달과 발아는 수분과 양분 함량의 급격한 변화를 수반하는 복합적인 과정이다. 본 연구에서는 유전자 발현과 단백질 구조 비교 분석을 통해 벼 종자의 발아와 발달과정에 관여하는 액포막 aquaporin (tonoplast intrinsic protein)을 규명하였다. OsTIP3;1, OsTIP3;2는 종자 특이적인 TIP로 종자가 성숙되는 시기에 발현되었다가, 종자가 발아하면서 전사체가 사라지는 양상을 보였으며, ABA 처리에 의해 발현이 유도되었다.
제안 방법
저온 스트레스는 20℃에서 처리하였으며, 150 mM NaCl 혹은 3 μM ABA가 포함된 완충액에서 각 시간별로 발아시킨 벼 종자의 배 (embryo)를 적출하여 유전자 발현을 조사하였다.
추출한 RNA 5 μg에서 Oligo (dT)12-18 primer를 이용해 역전사효소 (SuperScript Ⅲ, Invitrogen)로 50℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
저온 스트레스는 20℃에서 처리하였으며, 150 mM NaCl 혹은 3 μM ABA가 포함된 완충액에서 각 시간별로 발아시킨 벼 종자의 배 (embryo)를 적출하여 유전자 발현을 조사하였다. 벼 유묘기 단계의 유전자 발현을 조사하기 위하여 표면 소독한 종자를 1/2 MS 배지에 치상하여, 28℃ 배양실에서 암조건 혹은 명조건 (16L: 8D)에서 2주간 키운 뒤 줄기와 뿌리에서 각각 RNA를 분리하였다. 종자발달 단계의 유전자 발현을 조사하기 위하여 포장 조건에서 출수기를 기준으로 성숙 단계별로 종자를 채취하였다.
벼 유묘기 단계의 유전자 발현을 조사하기 위하여 표면 소독한 종자를 1/2 MS 배지에 치상하여, 28℃ 배양실에서 암조건 혹은 명조건 (16L: 8D)에서 2주간 키운 뒤 줄기와 뿌리에서 각각 RNA를 분리하였다. 종자발달 단계의 유전자 발현을 조사하기 위하여 포장 조건에서 출수기를 기준으로 성숙 단계별로 종자를 채취하였다.
벼 종자를 액체 질소에 잘 간 후 TLE 완충액 (0.2 M Tris, 0.1 M LiCl, 5 mM EDTA, pH 8.2)으로 전분을 침전 시킨 후 상등액에서 TRIZOL 용액 (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 5 μg에서 Oligo (dT)12-18 primer를 이용해 역전사효소 (SuperScript Ⅲ, Invitrogen)로 50℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA는 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. 벼의 액포막 aquapoin(TIP) 유전자 10종의 염기서열에 대한 특이 primer를 제작하였고 (Table 1), 이를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 5분, 30 cycles (94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 40초) 그리고 72℃ 7분으로 반응 시켰다.
벼의 TIP의 아미노산 서열을 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)을 이용해 비교 분석하였고, 단백질 계통 분석은 ClustalW/Treeview program (http://align.genome.jp/sit-bin/clustalw)을 이용하여 작성하였다. 인산화가 일어날 수 있는 잔기를 NetPhos 2.
발아 후 24시간에 어린 싹의 돌출이 관찰되며 72시간에 어린 뿌리와 줄기의 신장이 활발해진다. 본 연구에서는 발아하는 배에서 TIP 계열 유전자 10종의 발현 kinetics를 RT-PCR 방법으로 비교 분석하였다. Figure 2B는 벼 종자발아 단계에 따라서 TIP 유전자 발현이 차등적으로 조절되고 있음을 뚜렷이 보여준다.
수분흡수에 의한 배유의 팽창과 어린 싹의 돌출 등 물리적 과정이 부분적으로 진행되는 것에 비해 어린 줄기와 뿌리의 생장 과정은 완전히 저해되었으며, 이런 결과는 스트레스에 따라 종자발아 억제 양상이 차이가 난다는 것으로 보여준다. 이처럼 종자발아가 억제된 조건에서 배에서 TIP 유전자군의 발현을 조사하였다. 정상 조건에서 종자발아 후기에 유전자 발현이 크게 유도되었던 OsTIP2;1과 OsTIP4;3의 경우, 종자발아가 억제되는 모든 조건에서 유전자 발현이 완전히 사라지는 것으로 알 수 있었다 (Fig.
종자발아와 마찬가지로 종자의 성숙단계에서도 급격한 수분변화가 수반된다. 종자 발달과 연관된 OsTIP 유전자 발현 양상을 분석하기 위하여 포장에서 출수 후 시간 경과에 따라 종자를 채취하여 RNA를 분리하고, RT-PCR을 수행하였다. Figure 5에서 OsTIP3;1과 OsTIP3;2가 미성숙 종자에서는 전혀 발현되지 않다가 25 DAH와 45 DAH에서 급격히 발현이 증가하였는데, 이는 이들 유전자가 종자가 성숙되는 과정에서 발현되는 유전자임을 시사한다.
대상 데이터
PCR 조건은 94℃ 5분, 30 cycles (94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 40초) 그리고 72℃ 7분으로 반응 시켰다. 벼 actin 유전자 (OSJNBa 0078A17.12)의 발현을 대조군으로 사용하였다.
jp/sit-bin/clustalw)을 이용하여 작성하였다. 인산화가 일어날 수 있는 잔기를 NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)를 이용하여 예측하였다.
성능/효과
2010). 이런 결과들은 NIP 계열의 aquaporin이 식물의 중금속 독성 제거에 이용되고 있다는 것을 보여준다.
α-TIP는 종자에서 특이적으로 발현되며 단백질 저장 액포막에 다량으로 존재한다. OsTIP3;1는 AtTIP3;1과 64%의 상동성을 보였으며 OsTIP3;2는 AtTIP3;1과 54%의 상동성을 보였다. 그룹 II는 AtTIP1;1, OsTIP1;1과 OsTIP5;1을 포함하고 있으며 OsTIP1;1는 AtTIP1;1와 80%의 상동성을 보이고 있다.
그룹 III은 OsTIP2;1과 AtTIP2;2가 속해 있으며 이들은 77%의 상동성을 보이고 있다. 그룹 IV는 OsTIP4;3과 AtTIP4;1을 포함하고 있으며 59%의 상동성을 보였다. OsTIP2;1은 OsTIP3;1, OsTIP3;2와 각각 49%, 44%의 상동성을 보였으며 OsTIP4;3 또한 이들과 각각 46%, 43%의 상동성을 나타냈다.
그룹 IV는 OsTIP4;3과 AtTIP4;1을 포함하고 있으며 59%의 상동성을 보였다. OsTIP2;1은 OsTIP3;1, OsTIP3;2와 각각 49%, 44%의 상동성을 보였으며 OsTIP4;3 또한 이들과 각각 46%, 43%의 상동성을 나타냈다.
Figure 2B는 벼 종자발아 단계에 따라서 TIP 유전자 발현이 차등적으로 조절되고 있음을 뚜렷이 보여준다. 다섯 종류의 TIP 유전자 (OsTIP1;1, OsTIP2;1, OsTIP2;2, OsTIP4;3 및 OsTIP5;1)가 종자발아가 진행됨에 따라 유전자 발현이 증가하는 경향을 보였다. OsTIP1;2, OsTIP2;2와 OsTIP5;1 유전자는 어린 싹의 돌출이 시작되기 전인 발아 24시간 이내에 발현이 증가되므로 초기 수분흡수에 관여할 가능성을 시사한다.
Figure 3A는 20℃ 저온, 150 mM NaCl 및 3 μM ABA 처리에 의해 발아가 저해된 종자를 각각 보여주는 사진이다. 수분흡수에 의한 배유의 팽창과 어린 싹의 돌출 등 물리적 과정이 부분적으로 진행되는 것에 비해 어린 줄기와 뿌리의 생장 과정은 완전히 저해되었으며, 이런 결과는 스트레스에 따라 종자발아 억제 양상이 차이가 난다는 것으로 보여준다. 이처럼 종자발아가 억제된 조건에서 배에서 TIP 유전자군의 발현을 조사하였다.
이처럼 종자발아가 억제된 조건에서 배에서 TIP 유전자군의 발현을 조사하였다. 정상 조건에서 종자발아 후기에 유전자 발현이 크게 유도되었던 OsTIP2;1과 OsTIP4;3의 경우, 종자발아가 억제되는 모든 조건에서 유전자 발현이 완전히 사라지는 것으로 알 수 있었다 (Fig. 3B). 그러나 OsTIP1;1과 OsTIP2;2는 발아가 억제되는 조건에서도 여전히 유전자 발현이 종자 침윤 후 시간에 따라 증가하는 양상을 유지하는 특징을 보였다.
그러나 OsTIP1;1과 OsTIP2;2는 발아가 억제되는 조건에서도 여전히 유전자 발현이 종자 침윤 후 시간에 따라 증가하는 양상을 유지하는 특징을 보였다. OsTIP5;1은 NaCl 조건에서는 유전자 발현이 완전히 억제되었으나, ABA 혹은 저온처리 조건에서는 침윤 후 48-72시간에 발현이 유도된다는 것을 알 수 있었다. 종자 발아 시 유전자 발현이 빠르게 사라지는 OsTIP1;2, OsTIP3;1과 OsTIP3;2 유전자는 모두 특이하게도 ABA에 의해서 발현이 유도되는 특징을 보였다 (Fig.
OsTIP5;1은 NaCl 조건에서는 유전자 발현이 완전히 억제되었으나, ABA 혹은 저온처리 조건에서는 침윤 후 48-72시간에 발현이 유도된다는 것을 알 수 있었다. 종자 발아 시 유전자 발현이 빠르게 사라지는 OsTIP1;2, OsTIP3;1과 OsTIP3;2 유전자는 모두 특이하게도 ABA에 의해서 발현이 유도되는 특징을 보였다 (Fig. 3B). 한편 저온 및 염 스트레스 조건에서 이들 유전자 발현은 침윤 후 발현이 감소하는 양상을 보였으나, 정상조건에 비교해서 감소 kinetics가 뚜렷이 느려졌음을 알 수 있다.
한편 저온 및 염 스트레스 조건에서 이들 유전자 발현은 침윤 후 발현이 감소하는 양상을 보였으나, 정상조건에 비교해서 감소 kinetics가 뚜렷이 느려졌음을 알 수 있다. 이런 결과로부터 OsTIP 유전자군을 종자발아와 연관하여 크게 3개의 소그룹으로 나눌 수 있으며, 각 유전자는 특정 종자발아생리와 연관되어 차등적으로 유전자 발현수준에서 기능이 조절되고 있을 것으로 추정된다. Li 등은 (2008) OsTIP1;2가 4주된 벼의 줄기와 뿌리에서 NaCl 혹은 ABA 처리에 의해 발현이 일시적으로 크게 유도되는 것을 보고하였는데, 이는 OsTIP1;2의 기능이 종자발아에 한정되지 않다는 것을 시사한다.
OsTIP2;1와 OsTIP4;3이 종자발아 후기에 발현이 유도되며, 발아가 저해되는 다양한 조건에서 공통적으로 유전자 발현이 억제된다는 결과 (Fig. 2B, Fig. 3B)로부터, 이들 유전자가 어린 줄기와 뿌리 조직의 빠른 생장에 관여할 가능성을 보여주었다. Figure 4는 OsTIP2;1과 OsTIP4;3 유전자가 발아하는 종자뿐만 아니라 영양기관인 유묘의 줄기와 뿌리에서도 사실상 발현되고 있다는 것을 보여준다.
그러나 45 DAH에서 발현된 OsTIP2;1 전사체의 경우 다른 시기에 발현된 전사체보다 크기가 크게 나타난 것으로 보아, 비정상적인 유전자 발현기구가 작용하고 있다고 추정된다. RT-PCR 분석과 동일한 RNA 재료를 이용한 microarray 분석 (Agillent rice 44K oligo chip) 결과에서 OsTIP2;1과 OsTIP43의 유전자 발현이 45 DAH에서도 지속적으로 감소하는 것으로 나타났으므로 (결과 미제시), 이들은 종자가 성숙되면서 사라지는 유전자인 것으로 판단된다.
그러나 OsTIP1;2의 경우 다른 TIP와는 달리 막에서 단백질의 방향이 반대인 것으로 예측되었는데 (결과 미제시), 기능과 구조에 대한 추가 분석이 필요할 것으로 생각된다. 벼의 모든 TIP에서 aquaporin의 개폐에 중요한 역할을 하는 NPA motif가 loop B와 loop E에 잘 보전되어 있었으며, 특히 loop B의 인산화 잔기 (Ser 혹은 Thr) 가 완벽하게 보전되어 있었다 (Fig. 6, Fig. 7 화살표). 그러나 OsTIP3;1과 OsTIP3;2의 경우 다른 OsTIP과 달리 loop B의 인산화 motif가 RX(X)S/T의 형태로 존재하였으며 (Fig.
7 화살표). 그러나 OsTIP3;1과 OsTIP3;2의 경우 다른 OsTIP과 달리 loop B의 인산화 motif가 RX(X)S/T의 형태로 존재하였으며 (Fig. 7), loop E의 인산화 Ser 잔기가 보전되어 있지 않는 특징을 보였으므로, 인산화 조절 기작이 다를 것으로 예측되었다. 애기장대 (AtPIP2;1), 옥수수 (ZmPIP2;1, ZmPIP2;6), 시금치(SoPIP2;1)의 PIP 단백질은 C-말단에 두 개의 인산화 Ser 잔기가 잘 보전되어 있으며, C-말단의 인산화가 PIP 단백질의 세포막 분포를 조절한다고 보고된 바 있다 (Prak et al.
2006)가 특이적으로 발견되었으므로 그 기능 확인이 필요하다. 한편 종자 발아시 유전자 발현 패턴의 차이를 보였던 OsTIP2;1와 OsTIP2;2를 비교하였을 때, OsTIP2;2 단백질의 N-말단에는 OsTIP2;1에 존재하는 인산화 Ser 잔기와 메틸화 Lys 잔기가 결실된 특징을 보였다.
단백질 계통 분석 결과는 OsTIP3;1과 OsTIP3;2가 애기장대의 α-TIP과 유사성이 높다는 것을 보여준다 (Fig. 1).
이런 결과들을 고려할 때 OsTIP2;1과 OsTIP4;3이 γ-TIP의 일종으로 각각 줄기와 뿌리에서 선택적으로 발현되어 빠른 생장을 유발하는 주요인자라고 제안할 수 있다.
Ludevid 등은 (1992) 애기장대에서 α-TIP이 종자특이적인 PSV에 위치하고 있는 반면, γ-TIP는 잎, 뿌리, 줄기 등 영양기관에서 주로 발현되며, 두 종류의 TIP의 구조와 기능이 다르다는 것을 보고한 바 있다. 본 연구에서도 벼 종자의 성숙과 발아과정에서 유전자 발현이 상반적으로 조절되는 OsTIP를 뚜렷이 구분할 수 있었다. OsTIP3;1과 OsTIP3;2는 종자의 성숙기에 유전자 발현이 급증하였다가 종자가 발아하면서 전사체가 완전히 사라지며, 줄기와 뿌리 등 영양기관에서 발현되지 않는 특징을 보였다 (Fig.
본 연구에서도 벼 종자의 성숙과 발아과정에서 유전자 발현이 상반적으로 조절되는 OsTIP를 뚜렷이 구분할 수 있었다. OsTIP3;1과 OsTIP3;2는 종자의 성숙기에 유전자 발현이 급증하였다가 종자가 발아하면서 전사체가 완전히 사라지며, 줄기와 뿌리 등 영양기관에서 발현되지 않는 특징을 보였다 (Fig. 2B, Fig. 3B, Fig. 4). 단백질 계통 분석 결과는 OsTIP3;1과 OsTIP3;2가 애기장대의 α-TIP과 유사성이 높다는 것을 보여준다 (Fig.
OsTIP2;1과 OsTIP4;3은 생장하는 영양조직의 세포 팽창에 필요한 수분 포텐셜을 유지하는 기능을 하는 것으로 생각된다. 본 연구결과에서 OsTIP2;1와 OsTIP4;3이 어린 싹의 생장이 활발해지는 발아 후기에 유전자 발현이 유도되기 시작한 반면 (Fig. 2B), 발아가 억제되는 다양한 조건에서는 전혀 전사체가 나타나지 않았으며 (Fig. 3B), 또한 종자가 아닌 줄기와 뿌리 등 영양기관에서 유전자가 발현된다는 사실 (Fig. 4)이 이를 뒷받침해준다. 특히 OsTIP2;1은 줄기보다는 뿌리에서 발현이 강한 특징을 보였으므로 뿌리 생장과 연관된 고유 기능이 있다고 추정된다 (Fig.
X선 결정 모델에 따르면 aquaporin monomer는 6개의 막 도메인과 5개의 연결 루프(A-E)로 구성되어 있다. 본 연구의 단백질 topology 분석을 통해 벼의 TIP 역시 유사한 기본구조를 형성하고 있음을 알 수 있었다 (Fig. 6). Aquaporin은 다양한 환경자극에 반응해서 물과 물질의 수송이 효율적으로 일어날 수 있도록 활성이 조절되는 것으로 보고되었다.
이런 결과들은 aquaporin의 인산화가 단백질의 활성과 세포내 분포를 조절하는 주요인자라는 것을 보여준다. 본 연구에서 벼 TIP 계열 단백질간에 예측되는 인산화 잔기가 뚜렷한 차이가 있음을 알 수 있었다 (Fig. 7).
특히 NPA motif가 보전된 loop B와 loop E에서 종자 특이적으로 발현되는 OsTIP3;1과 OsTIP3;2의 인산화 잔기 양상이 다른 TIP 그룹과 차이를 보였다. OsTIP3;1과 OsTIP3;2은 loop B에서 CDPK/CRK의 인식부위로 알려진 (Vlad et al.
7), 조절 기작이 서로 많이 다를 것으로 추측된다. 인산화 잔기 이외에도 PIP의 활성조절에 관여할 가능성이 높은 것으로 보고된 D loop의 수소이온화 (protonation) histidine 잔기가 OsTIP3;1에서만 발견되었고, N-말단의 메틸화 (metylation) lysine 잔기가 OsTIP4 그룹과 OsTIP2;3에서만 발견된다는 것을 알 수 있었다 (Fig. 7). 이런 결과는 OsTIP 각 그룹 특이적인 활성 조절작용이 있음을 시사한다.
본 연구에서는 유전자 발현과 단백질 구조 비교 분석을 통해 벼 종자의 발아와 발달과정에 관여하는 액포막 aquaporin (tonoplast intrinsic protein)을 규명하였다. OsTIP3;1, OsTIP3;2는 종자 특이적인 TIP로 종자가 성숙되는 시기에 발현되었다가, 종자가 발아하면서 전사체가 사라지는 양상을 보였으며, ABA 처리에 의해 발현이 유도되었다. 단백질 구조 예측 결과로부터 OsTIP3;1, OsTIP3;2가 단백질의 N-말단, B와 E loop에 다른 TIP와 뚜렷이 구분되는 인산화 잔기 특징을 확인하였다.
OsTIP3;1, OsTIP3;2는 종자 특이적인 TIP로 종자가 성숙되는 시기에 발현되었다가, 종자가 발아하면서 전사체가 사라지는 양상을 보였으며, ABA 처리에 의해 발현이 유도되었다. 단백질 구조 예측 결과로부터 OsTIP3;1, OsTIP3;2가 단백질의 N-말단, B와 E loop에 다른 TIP와 뚜렷이 구분되는 인산화 잔기 특징을 확인하였다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3은 종자가 발달하는 과정에서 유전자 발현이 감소하였다가, 종자 발아 후기에 뿌리와 배축의 신장이 활발한 시기에 발현이 급증하였다.
OsTIP2;1과 OsTIP4;3 단백질의 N-말단에는 특징적으로 메틸화 (methylation) 가능성이 높은 아미노산 잔기가 예측되었다. OsTIP2;2는 OsTIP2;1과는 달리 종자 침윤 후 7시간 이내에 발현이 빠르게 유도되며, 발아가 억제되는 조건에서도 유전자 발현이 유지되는 것으로 보아 종자의 초기 수화 과정에 관여할 것으로 추측된다. OsTIP2;2 단백질의 N-말단에는 OsTIP2;1에 존재하는 인산화 Ser 잔기와 메틸화 잔기가 결실된 특징을 보였다.
후속연구
Figure 4는 OsTIP2;1과 OsTIP4;3 유전자가 발아하는 종자뿐만 아니라 영양기관인 유묘의 줄기와 뿌리에서도 사실상 발현되고 있다는 것을 보여준다. 특히 OsTIP2;1은 뿌리에서 매우 강한 발현을 보였으므로, 뿌리의 생장 조절 기능에 대한 향후 연구가 필요할 것으로 사료된다. 한편 종자발아가 시작되면서 유전자 발현이 급격히 억제되었던 OsTIP3;1과 OsTIP3;2 유전자는 뿌리와 줄기에서 전혀 발현되지 않는 특징을 보였으므로 종자 특이적인 기능을 수행할 것으로 추정된다(Fig.
N-말단과 C-말단, B와 D 루프는 항상 세포질 쪽으로, A/C/E 루프는 액포내로 단백질의 방향이 예측되었다. 그러나 OsTIP1;2의 경우 다른 TIP와는 달리 막에서 단백질의 방향이 반대인 것으로 예측되었는데 (결과 미제시), 기능과 구조에 대한 추가 분석이 필요할 것으로 생각된다. 벼의 모든 TIP에서 aquaporin의 개폐에 중요한 역할을 하는 NPA motif가 loop B와 loop E에 잘 보전되어 있었으며, 특히 loop B의 인산화 잔기 (Ser 혹은 Thr) 가 완벽하게 보전되어 있었다 (Fig.
7), 그 기능을 조사할 필요가 있다고 생각된다. 종자 발아 후반부에 발현되어 줄기와 뿌리의 생장에 관여하는 것으로 생각되는 OsTIP2;1와 OsTIP4;3은 N-말단에 애기장대 AtPIP2;1에서 알려진 메칠화 (methylation) Lys 3 잔기 (Santoni et al. 2006)가 특이적으로 발견되었으므로 그 기능 확인이 필요하다. 한편 종자 발아시 유전자 발현 패턴의 차이를 보였던 OsTIP2;1와 OsTIP2;2를 비교하였을 때, OsTIP2;2 단백질의 N-말단에는 OsTIP2;1에 존재하는 인산화 Ser 잔기와 메틸화 Lys 잔기가 결실된 특징을 보였다.
2007). 이와 마찬가지로 OsTIP3;1과 OsTIP3;2도 PSV와 연관된 종자특이적 기능을 수행할 것으로 예측된다. Li 등은 (2008) OsTIP3;2가 물 수송 기능보다는 glycerol 수송활성이 더 높은 것에 주목하면서 종자성숙기에 세포삼투조절과 액포 성숙 과정에 작용한다고 제안한바 있다.
줄기/잎과 뿌리의 세포에서 서로 다른 종류의 액포가 발달하는지는 아직 정확히 알려져 있지 않으나, 이처럼 조직과 발생단계에 따라 특이적인 OsTIP 유전자가 선택적으로 발현된다는 사실은 이들 단백질의 구조와 기능이 다르다는 것을 시사한다. 또한 OsTIP2;1과 OsTIP4;3이 뿌리와 줄기의 생장을 촉진하거나, 스트레스 조건에서 뿌리의 수분흡수를 조절하는데 생명공학적으로 이용될 가능성이 있는지 추가 연구가 필요할 것이다. 한편 종자발아 후기에 발현하는 OsTIP2;1과 달리 OsTIP2;2은 종자 침윤 후 7시간 이내에 빠르게 유전자 발현이 증가하기 시작하며 (Fig.
OsTIP2;2는 종자의 발아 초기 수분 흡수 단계에 관여하고 있으며 OsTIP2;1과 OsTIP4;3는 발아 후반부에 식물체의 뿌리와 줄기 조직의 생장과 관련되어 있는 것으로 보인다. 이들이 수분 이외에도 종자 발아과정에서 가수분해되는 다양한 물질 수송에도 관여하는지 연구가 필요하다. Chaumont 등은 (2005) 서로 다른 종류의 aquaporin monomer가 이성집합체 (heteromers)를 구성하여 수분통로를 형성한다고 제시한 바 있다.
Chaumont 등은 (2005) 서로 다른 종류의 aquaporin monomer가 이성집합체 (heteromers)를 구성하여 수분통로를 형성한다고 제시한 바 있다. 이를 바탕으로 발현 양상에서 동일한 양상을 보이는 OsTIP3;1/OsTIP3;2 또는 OsTIP2;1/OsTIP4;3간의 heteromer 형성 가능성을 조사해 볼 필요가 있다.
따라서 OsTIP의 단백질 수식에 의한 활성조절기작이 매우 다양하며 특이적인 기능과 밀접히 연관되어있을 것으로 생각된다. 본 연구에서 밝혀진 OsTIP가 종자의 발달과 발아과정에서 어떤 기능을 수행하며 환경과 발달 자극에 의해 어떻게 특이적으로 활성이 조절되는지에 대한 지속적인 연구가 필요하다.
OsTIP2;1과 OsTIP4;3은 종자가 발달하는 과정에서 유전자 발현이 감소하였다가, 종자 발아 후기에 뿌리와 배축의 신장이 활발한 시기에 발현이 급증하였다. 특히 OsTIP2;1은 뿌리에서 강한 발현을 보였으므로, 뿌리 생장에 필요한 팽압 공급에 중요한 기능을 할 것으로 제안된다. OsTIP2;1과 OsTIP4;3 단백질의 N-말단에는 특징적으로 메틸화 (methylation) 가능성이 높은 아미노산 잔기가 예측되었다.
특히 OsTIP2;1은 뿌리에서 매우 강한 발현을 보였으므로, 뿌리의 생장 조절 기능에 대한 향후 연구가 필요할 것으로 사료된다. 한편 종자발아가 시작되면서 유전자 발현이 급격히 억제되었던 OsTIP3;1과 OsTIP3;2 유전자는 뿌리와 줄기에서 전혀 발현되지 않는 특징을 보였으므로 종자 특이적인 기능을 수행할 것으로 추정된다(Fig. 4). Sakura 등은 (2005) 벼의 aquaporin 유전자군이 조직특이적 발현양상을 보이며, OsPIP2 계열 유전자와 OsTIP2;1가 벼의 뿌리의 물 수송과 연관된 발현양상을 보인다고 보고한 바 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Aquaporin은 무엇인가?
Aquaporin은 23-31 kDa 크기로 6개의 막내재성 (transmembrane) 도메인을 가진 단백질로 박테리아, 식물 그리고 동물에 폭넓게 존재한다 (Maurel et al. 2008).
Aquaporin 단백질은 기능과 구조에 따라 4개의 그룹으로 어떻게 나누어지는가?
2008). Aquaporin 단백질은 기능과 구조에 따라 4개의 그룹, 즉 PIP (plamamembrane intrinsic proteins), TIP (tonoplast intrinsic proteins), NIP (nodule 26-like intrinsic proteins) 그리고 SIP (small and basic intrinsic proteins)로 나누어진다 (Sakurai et al. 2005).
4개의 그룹으로 나누어진 Aquaporin 단백질 각각은 어디에 존재하는가?
2005). PIP 그룹은 세포막에, TIP 그룹은 액포막에, NIP 그룹은 세포막 혹은 소포체(endoplasmic reticulum) 막에, SIP는 소포체막에 존재하는 것으로 알려지고 있다 (Kaldenhoff et al. 2007).
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