[논문]섬기린초에서 엽록체 DNA 염기서열의 종내 변이와 지리적 분포 양상 연구

이웅; 박재홍

doi:10.11110/kjpt.2010.40.3.157

문제 정의

그러나 Sedum속 식물은 내건성 및 내한성이 뛰어나고 왕성한 번식력을 가지고 있기 때문에, 섬기린초는 해안암석지대를 터전으로 넓게 분포하여 울릉도 생태계의 중요한 부분을 차지하고 있다(Ohba, 1978; Chung and Kim, 1989). 따라서 섬기린초는 울릉도, 독도생성 이후 유입된 개척식물로서의 충분한 가능성과 가치를 가지고 있다고 판단하여 다음의 연구를 수행하였다.
본 연구는 울릉도와 독도에 자생하는 섬기린초에서 엽록체 DNA 염기서열의 종내 변이를 관찰하고 분자생물 지리 학적분포 양상을 파악함으로서 최종적으로 섬고유식물의 진화 역사를 연구하고, 울릉도와 독도의 식물지리학적 중요성과 보전의 필요성을 설명하는데 필요한 기초자료를 제시하고자 한다.
분포양상이 다양하게 나타난다. 섬고유식물의 연구에서 식물 종 및 집단간 유전적 변이를 면밀히 비교하여 지리적 분포 양상과 연결시키면, 관련 종들의 분포 유형의 기원과 이동 경로, 종분화 양상 및 정도 등을 파악하여 진화 역사에 대해 해석이 가능하도록 한다. 엽록체 DNA를 이용한 분자 생물지리학적 연구는 유럽과 북미, 일본 등지에 분포하는 식물들의 마지막 빙하기 이후의 이주 경로를 재현하는데 기여하였다 (Soltis et al.

제안 방법

6-bp indel 염기서열을 가지는 섬기린초(297 bp, 15개체)는 울릉도의 천부, 나리, 현포, 태하, 석포, 내수전, 도동, 사동, 남양 일대에서 관찰되었다. 6-bp indel 염기서열을 가지지 않는 섬기린초 (291bp, 17개체)는 울릉도의 태하, 나리, 석포, 도동, 남양 일대와 독도의 동도, 서도 개체에서 확인하였다.
DNA 추출은 생체 및 건조표본을 이용하였다 Plant PCR Kit (SIGMA, USA)을 사용하여 추출하였으며, 모든 과정은 manual을 따라 수행하였다. 추출한 DNA는 1% agarose gel 에 전기영동하고 ethidiumbromide (EtBr)로 staining 한 후, UV 조명하에서 밴드를 확인하였다.
증폭과정은 95oC 에서 3분동안 initial denaturation 시킨 후 95oC에서 60초의 denaturation, 55oC에서 90초간 annealing, 72oC에서 60초간의 extension으로 이루어지는 thermal cycle을 35회 반복하였으며, 72oC 에서 10분간 final extension 과정을 거쳤다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기 영동한 뒤, EtBr로 staining하여 밴드를 확인하고, Quick Gel Extraction kit (Invitrogen, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열을 확인하였다. 각각의 개체에 대하여 위의 과정을 2회 반복 수행하였다.
PCR 산물은 1% agarose gel에 전기 영동한 뒤, EtBr로 staining하여 밴드를 확인하고, Quick Gel Extraction kit (Invitrogen, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열을 확인하였다. 각각의 개체에 대하여 위의 과정을 2회 반복 수행하였다.
섬기린초는 울릉도와 독도(동도, 서도)의 주요 서식지 11개소에 대하여 현지 조사를 수행하였다. 총 32개체를 2006년부터 2009년까지 울릉도(27개체)와 독도(5개체)에서 채집하여 관찰하고 엽록체 DNA 염기서열 분석에 이용하였다.
엽록체 DNA의 trnL/F intergenic region의 증폭을 위하여 template DNA 4 μl, Water (PCR grade) 4 μl, REDExtract-N-Amp PCR reaction mix 10 pl, primer trnL (5'-AGGGTTCAAGTCCCTCIArCCC-3') 1 pl (10pmol/ul), primer trnF (5'-GAnTGAACTGGTGACACGAGG-3‘)1 pl (10 pmol/ul) (Taberlet et al., 1991)를 포함한 총 20 pl의 반응액을 제작하였다. 증폭과정은 95oC 에서 3분동안 initial denaturation 시킨 후 95oC에서 60초의 denaturation, 55oC에서 90초간 annealing, 72oC에서 60초간의 extension으로 이루어지는 thermal cycle을 35회 반복하였으며, 72oC 에서 10분간 final extension 과정을 거쳤다.
, 1991)를 포함한 총 20 pl의 반응액을 제작하였다. 증폭과정은 95oC 에서 3분동안 initial denaturation 시킨 후 95oC에서 60초의 denaturation, 55oC에서 90초간 annealing, 72oC에서 60초간의 extension으로 이루어지는 thermal cycle을 35회 반복하였으며, 72oC 에서 10분간 final extension 과정을 거쳤다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기 영동한 뒤, EtBr로 staining하여 밴드를 확인하고, Quick Gel Extraction kit (Invitrogen, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열을 확인하였다.
, 1997)을 이용하여 정렬하였다. 최종적으로 육안으로 확인하여 염기서열을 결정하였다. S.
총 32개체를 2006년부터 2009년까지 울릉도(27개체)와 독도(5개체)에서 채집하여 관찰하고 엽록체 DNA 염기서열 분석에 이용하였다. 추가로 이전 형태적 특성 (Lee et al., 2003)과 RAPD 분석 (Kwon et al., 1999) 등의 연구를 통해 섬기린초와 가까운 유연관계를 나타낸 기린초(S. kamtschaticumi)를 지리산 과 가야산에서 각각 1개체를 채집하여 염기서열을 비교하였다 (Table 1). 채집된 개체는 석엽표본으로 제작하여 경북대학교 표본관 (KNU) 에 보관하였다.
따라 수행하였다. 추출한 DNA는 1% agarose gel 에 전기영동하고 ethidiumbromide (EtBr)로 staining 한 후, UV 조명하에서 밴드를 확인하였다.

대상 데이터

2) 6 bp indel 염기서열을 가지는 TYPE 이은 울릉도에서 관찰되었고, 6 bp indel 염기서열을 가지지 않는 TYPE02는 울릉도와 독도 개체에서 확인되었다. 6-bp indel 염기서열을 가지는 섬기린초(297 bp, 15개체)는 울릉도의 천부, 나리, 현포, 태하, 석포, 내수전, 도동, 사동, 남양 일대에서 관찰되었다. 6-bp indel 염기서열을 가지지 않는 섬기린초 (291bp, 17개체)는 울릉도의 태하, 나리, 석포, 도동, 남양 일대와 독도의 동도, 서도 개체에서 확인하였다.
표본은 원기재문 (Nakai 1919)과 원색 대한 식물도감 (Lee, 2003), 원색한국기준식물도감 (Lee, 1996) 등을 참고하여 동정하였다. 실험에 사용한 모든 개체의 잎은 야외에서 채집한 즉시 silica gel을 이용하여 건조하였다.
대하여 현지 조사를 수행하였다. 총 32개체를 2006년부터 2009년까지 울릉도(27개체)와 독도(5개체)에서 채집하여 관찰하고 엽록체 DNA 염기서열 분석에 이용하였다. 추가로 이전 형태적 특성 (Lee et al.

이론/모형

Direct sequencing을 통하여 얻어진 섬기린초 32개체, 기린초 2개체의 염기서열을 Clustal X program (Thompson et al., 1997)을 이용하여 정렬하였다. 최종적으로 육안으로 확인하여 염기서열을 결정하였다.
일부 개체는 야장에 이식하여 재배하였다. 표본은 원기재문 (Nakai 1919)과 원색 대한 식물도감 (Lee, 2003), 원색한국기준식물도감 (Lee, 1996) 등을 참고하여 동정하였다. 실험에 사용한 모든 개체의 잎은 야외에서 채집한 즉시 silica gel을 이용하여 건조하였다.

성능/효과

(2002, 2006) 는 울릉도에 자생하는 특산식물인 섬단풍나무 (Acer takesimens@)와 우산고로쇠 (Acer okamotoanum)를 대상으로 엽록체 DNA의 염기서열을 이용하여 분자생물지리학적 연구를 수행한 결과, 울릉도의 섬단풍나무는 한반도의 당단풍나무(Acer pseudo-sieboldianum (Paxton) Kom.)를 기원 종으로 하여 향상진화 하였을 가능성이 높다는 연구결과를 제시하였으며, 우산고로쇠 역시 한반도의 고로쇠나무 (Acer mono Max.) 에서 유래하였을 가능성이 높다고 하였다. 또한, 섬바디 (Dstaenia takesimana)는 엽록체 DNA와 AFLP를 이용하여 일본에 자생하고 있는 Dystaenia ibukiensis가 울릉도에 유입되어 다양한 유전적 현상을 거친 후 향상진화의 과정을 밟았다는 가설을 제시한 바 있다.
따라서 울릉도와 독도에 자생하는 개체군 내에 진화 적으로 서로 다른 두 개의 계통(울릉도와 울릉도-독도)이 있음을 추정할 수 있다. 또한 우리는 울릉도와 독도 간 원거리 분산 기작의 가능성을 확인할 수 있었다. 섬기린초에서 확인된 TYPE01 과 TYPE02의 두 엽록체 DNA haplotypee 울릉도에서 특별한 지리적 구분 없이 관찰되는 것에 비하여 독도에서는 TYPE02 만을 확인할 수 있는 독특한 양상을 보여준다.
본 연구를 통해 섬기린초는 trnL/F intergenic spacer 염기서열에서 하나의 6-bp indel에 의하여 서로 다른 두 개의 엽록체 DNA haplotype이 확인되고, 각각의 haplotype 분포양상이 울릉도와 독도에서 뚜렷하게 구분됨이 처음으로 밝혀졌다. 따라서 울릉도와 독도에 자생하는 개체군 내에 진화 적으로 서로 다른 두 개의 계통(울릉도와 울릉도-독도)이 있음을 추정할 수 있다.
또한 우리는 울릉도와 독도 간 원거리 분산 기작의 가능성을 확인할 수 있었다. 섬기린초에서 확인된 TYPE01 과 TYPE02의 두 엽록체 DNA haplotypee 울릉도에서 특별한 지리적 구분 없이 관찰되는 것에 비하여 독도에서는 TYPE02 만을 확인할 수 있는 독특한 양상을 보여준다. 이전 연구를 살펴보면, 독도 섬기린초의 세포분류학적 특성에 기초한 연구에서 염색체 수는 울릉도산 섬기린초의 2n = 30 (Sun and Stuessy, 1998)과 차이가 없다고 보고하고, 동도에 생육하는 섬기린초는 식재되었으나 서도 물골 사면의 군락은 자생 가능성이 있다고 판단하였다.
섬기린초에서 확인된 두 개의 엽록체 DNA typee 울릉도와 독도에서 뚜렷한 지리적 분포양상을 보여준다(Fig. 2) 6 bp indel 염기서열을 가지는 TYPE 이은 울릉도에서 관찰되었고, 6 bp indel 염기서열을 가지지 않는 TYPE02는 울릉도와 독도 개체에서 확인되었다. 6-bp indel 염기서열을 가지는 섬기린초(297 bp, 15개체)는 울릉도의 천부, 나리, 현포, 태하, 석포, 내수전, 도동, 사동, 남양 일대에서 관찰되었다.
울릉도, 독도에 자생하는 섬기린초 32개체에서 엽록체 DNA의 trnL/F intergenic spacer 염기서열을 조사한 결과, 정렬된 염기서열 중 76번부터 81 번까지 위치하는 하나의 6-bp indel (-ATTCAC-)에 의하여 두 개의 type (S. takesimense1: 297bp와 S. takesimense2: 291bp, 이후 내용에서 TYPE01 과 TYPE02로 표시)을 확인할 수 있었다. 가야산과 지리산에서 채집한 기린초 2개체의 trnL/F intergenic spacer 염기서열은 291bp로 결정되었으며 정렬된 염기서열에서 6-bp indel을 가지지 않고 210번 위치에서 한 개의 염기변이(섬기린초:T/기린초:C) 에 의해 구분되었다 (Fig.
이상의 연구결과를 종합해 보면, 섬기린초와 관련 종들에 대한 지금까지의 연구는 일관성 없는 모습을 보여준다. 이상의 연구결과를 통해 엽록체 DNA의 염기서열 변이는 외부형태 형질에 기초한 연구보다 섬기린초의 종내 다양성을 확인하고 독특한 지리적 분포 양상을 밝히는데 유용한 형질인 것으로 판단된다. 끝으로 본 연구에서 얻어진 울릉도, 독도 섬기린초의 분자생물지리학적 기초자료와 연관 종의 추가 연구, 조사 지역의 확대, 실험방법의 다양화와 연구 결과 해석의 객관화 등을 통해 추후 섬기린초와 관련 종의 독특한 생물학적 진화양상과 종분화 과정이 연구되어야 하겠다.

후속연구

것으로 판단된다. 끝으로 본 연구에서 얻어진 울릉도, 독도 섬기린초의 분자생물지리학적 기초자료와 연관 종의 추가 연구, 조사 지역의 확대, 실험방법의 다양화와 연구 결과 해석의 객관화 등을 통해 추후 섬기린초와 관련 종의 독특한 생물학적 진화양상과 종분화 과정이 연구되어야 하겠다.

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섬기린초에서 엽록체 DNA 염기서열의 종내 변이와 지리적 분포 양상 연구
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