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문제 정의
- 하지만, 세포 표면 특이인자가 존재하지 않으며, 형태학적으로 구분이 어려운 내배엽성 세포의 경우에는 새로운 정제 방법의 개발이 절실히 요구된다. 따라서, 본 연구에서는 배상체형 성을 통한 인긴 배아 줄기세포의 분화 과정 동안에 내배엽성 세포 분화를 촉진시키고자 성장인자 Activin-A를 처리한 후, 배상체의 형태학적 변화에 대한 분석과 대표적인 내배엽성 표지인자인 AFP 발현 세포들의 발현 패턴을 면역염색법으로 분석하여, 내배엽성 세포 만을 효과적으로 분리하고자 하였다.
- 1C, arrow head)(Sachlos와 Auguste, 2008), mesoendoderm 분화의 특징을 나타낸다는 보고가 있다(Conley 등, 2004). 본 연구진은 일반적인 cavity 배상체(Fig. IB)를 대조군으로 이용하여, Activin-A 가 cystic 배상체 형성에 미치는 영향과 미분화 인간 배아줄기세포로부터 Activin-A 처리에 의해 배상체 내에 증가된 내배엽성 세포의 발현 패턴을 분석하여, 고순도 내배엽성 세포만을 효과적으로 정제할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.
제안 방법
- Activin-A 처리군의 배상체에서 증가된 내배엽성 세포의 발현 패턴과 분포도를 조사하기 위하여' Activin-A 처리 군과 비처리군에서의 cystic 배상체를 미분화 특이 항체인 CH4, 내배엽성 세포 특이 항체인 AFP, 배상체의 표면에 특이적으로 발현되는 외배엽성 세포 특이 항체인 TuJl을 이용하여 면역염색법으로 분석하였다. 미분화 특이 항체 Oct4의 경우, Activin-A 비처리군의 cystic 배상체에서 약하게 발현되는 세포가 관찰되었으며(Fig.
- Activin-A의 처리군 배상체와 비처리군 배상체의 유전자 발현 패턴을 조사하기 위하여, 대표적인 미분화 표지 인자인 Oct4 유전자와 삼배엽성 세포의 표지인자인 AFP(내배엽), Brachyury(중배엽), Tubb3(외배엽) 유전자에 대하여 실시간 중합효소 연쇄 반응 기법으로 분석하였다. 그 결과, Oct4 유전자 발현의 경우, 미분화 인간 배아 줄기 세포군에서만 강하게 발현되고, ActiBn-A의 비처리군과 처리군 모두에서는 Oct4 유전자의 발현이 약하고 두 군간의 발현 차이는 없었다(Fig.
- 03% Tri ton X-lOO(Sigma) 이 포함된 PBS(Gibco)를 이용하여 세 번 세척하였다. 그리고 고정된 배상체에 5% BSA(bovine se rum albumin)를 첨가하여 한 시간 동안 블로킹한 후, Oct-4(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), AFP (R&D System), TuJl(Millipore, Chicago, IL)과 같은 일차 항체를 4°C에서 12시간 동안 반응시켰으며, PBS를 이용하여 세 번 세척하였다. 세척 후, Cy3(Molecular Probes Inc.
- 내배엽성 세포가 특이적으로 강하게 발현되는 Activin- A 처리군의 배상체에서 고순도 내배엽성 세포만을 효과적으로 분리하기 위하여, Activin-A 처리군의 배상체를 형태학적으로 non-cystic과 cystic 배상체로 구분하여 젤라틴이 코팅된 배양 접시에 부착하여 AFP 발현세포의 양상을 면역염색법으로 분석하였다. 배양접시에 부착된 non-cystic과 cystic 배상체는 부착된 지점을 중심으로 cluster와 mono- layer 부분으로 구분하여, AFP 발현 패턴을 면역 염색법으로 분석하였다.
- 내배엽성 세포를 분리하기 위하여, Activin-A에 의해 분화 유도된 cystic 배상체를 0.2% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에 부착하여 5일 동안 배양하였다. 부착된 배상체는 부착지점으로부터 세포가 outgrowth 부위로 이동하여 cluster 부분과 monolayer 부분이 관찰되었고, monolayer 부분만을 유리 파이펫을 이용하여 물리적으로 분리하여 새로운 배 양접 시 에 재 부착하였으며, DMEM high glucose(Gibco), 10% fetal bovine serum(HyClone, Logan, Utah), 1 mM L- glutamine(Gibco), 1% nonessential amino adds(Gibco), 100 mM beta-mercaptoethanol(Gibco)로 조성된 배양액을 이용하여 배양하였다.
- 면역염색을 위하여, 세포 시료를 4% 파라포름알데하이드로 15분간 상온에서 고정시킨 다음, 0.03% Tri ton X-lOO(Sigma) 이 포함된 PBS(Gibco)를 이용하여 세 번 세척하였다. 그리고 고정된 배상체에 5% BSA(bovine se rum albumin)를 첨가하여 한 시간 동안 블로킹한 후, Oct-4(Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포(H9-hESC)를 0.2% 젤라틴으로 코팅된 배양접시 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서, 세포 성장 억제 물질인 mitomycin C(Sigma, St Louis, MO, USA)를 10 pg/ml 농도로 90분 동안 처리하여 준비된 지지세포(mouse embryonic fibroblast: MEF) 와 함께 공배 양하였다. 이 때, 인간 배아 줄기세포는 DMEM/F12(50: 50, Gibco, Gaithersberg, MD, USA), 20% (v/v) serum re- placement(Gibco), 1 mM L-glutamine(Gibco), 1% noness ential amino adds(Gibco), 100 mM beta-mercaptoethanol (Gibco), 4 ng/mL bFGF(Sigma) 로 조성 된 배양액을 사용하였다.
- Activin-A에 의해 분화 유도된 배상체에서.발현되는 내배엽성 세포 유전자를 분석하기 위하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 사용한 세포 시료는 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 Maxime RT PreMixKit(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Sxmg- nam, Kyungki-Do, Korea) 를 사용하여 cDNA로 합성되었다.
- 등, 2007; Cho 등, 2007). 배상체를 이용한 내배엽성 세포로의 분화 유도를 위해 100ng/ml 농도의 Acti- vin-A(R&D System, Minneapolis, MN)를 배상체 형성을 통한 분화 유도하는 초기 3일간 처리한 후, 5〜7일간 배양하였다 (Fig. 1A).
- 이 때, 인간 배아 줄기세포는 DMEM/F12(50: 50, Gibco, Gaithersberg, MD, USA), 20% (v/v) serum re- placement(Gibco), 1 mM L-glutamine(Gibco), 1% noness ential amino adds(Gibco), 100 mM beta-mercaptoethanol (Gibco), 4 ng/mL bFGF(Sigma) 로 조성 된 배양액을 사용하였다. 배양액은 매일 교체해 주고, 5일에서 7일 간격으로 새로운 지지세포에 계대배양하였으며, 세포 배양은 37°C, 5% CO2, 95% 습도를 유지하면서 진행하였다(Thomson 등, 1998).
- 분석하였다. 배양접시에 부착된 non-cystic과 cystic 배상체는 부착된 지점을 중심으로 cluster와 mono- layer 부분으로 구분하여, AFP 발현 패턴을 면역 염색법으로 분석하였다. 부착된 non-<ystic 배상체의 경우' mono- layer 부분에서는 다양한 세포의 형태가 관찰되었으며(Fig.
- 2% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에 부착하여 5일 동안 배양하였다. 부착된 배상체는 부착지점으로부터 세포가 outgrowth 부위로 이동하여 cluster 부분과 monolayer 부분이 관찰되었고, monolayer 부분만을 유리 파이펫을 이용하여 물리적으로 분리하여 새로운 배 양접 시 에 재 부착하였으며, DMEM high glucose(Gibco), 10% fetal bovine serum(HyClone, Logan, Utah), 1 mM L- glutamine(Gibco), 1% nonessential amino adds(Gibco), 100 mM beta-mercaptoethanol(Gibco)로 조성된 배양액을 이용하여 배양하였다.
- , Santa Cruz, CA), AFP (R&D System), TuJl(Millipore, Chicago, IL)과 같은 일차 항체를 4°C에서 12시간 동안 반응시켰으며, PBS를 이용하여 세 번 세척하였다. 세척 후, Cy3(Molecular Probes Inc., Eugene, OR), FITC(Molecular Probes)와 같은 이차 항체들을 상온에서 1시간 동안 처리한 후에 PBS를 이용하여 세 번 세척하였다 면역 염색이 끝난 배상체는 4, 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)7} 함유되 어 있는 glycerol- ba sed mounting solution을 이용하여 마운팅 한 뒤, LSM 510 META 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc.; Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- 인간 배아 줄기세포 유래의 내배엽성 세포로의 분화를 촉진하는 성장인자로 알려진 AdivM-A가 배상체 형성과정에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 본 연구에서는 100 ng/ml 농도의 Activin-A(D'Amour 등, 2005; Yang 등, 2008) 를 배상체 형성을 통해 분화를 유도하는 초기 3일간 처리한 후 5〜7일간 배양하여(Fig. 1A) Activin-A 처 리군과 비 처리 군의 형태학적 변화를 비교하였다. Adivin-A의 비처리군에서는 다양한 크기의 배상체가 관찰되었지만, 형태학적으로 cystic을 형성한 배상체(Fig.
- 최초 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포(Fig. 6A)를 Activin-A 성장인자의 처리에 의해 내배엽성 발현세포의 분포가 많은 cystic 배상체의 분화 효율을 60% 이상 증가시켰으며(Fig. 6B), 내배엽성 발현세포의 분포가 많은 cystic 배상체 만을 선택적으로 구분하여 젤라틴이 코팅된 배양접시에 부착하였다. 일정기간 배양된 세포 중, AFP 발현 세포로 구성되어 있는 monolayer 부분 만을 물리적인 방법으로 분리하는 과정을 통해(Fig.
대상 데이터
- 발현되는 내배엽성 세포 유전자를 분석하기 위하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 사용한 세포 시료는 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 Maxime RT PreMixKit(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Sxmg- nam, Kyungki-Do, Korea) 를 사용하여 cDNA로 합성되었다. 실시간 중합효소 연쇄 반응은 Faststart DNA Mas terplus SYBR Green I kit(Roche Diagnostics, Burgess Hill, U.
- 2% 젤라틴으로 코팅된 배양접시 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서, 세포 성장 억제 물질인 mitomycin C(Sigma, St Louis, MO, USA)를 10 pg/ml 농도로 90분 동안 처리하여 준비된 지지세포(mouse embryonic fibroblast: MEF) 와 함께 공배 양하였다. 이 때, 인간 배아 줄기세포는 DMEM/F12(50: 50, Gibco, Gaithersberg, MD, USA), 20% (v/v) serum re- placement(Gibco), 1 mM L-glutamine(Gibco), 1% noness ential amino adds(Gibco), 100 mM beta-mercaptoethanol (Gibco), 4 ng/mL bFGF(Sigma) 로 조성 된 배양액을 사용하였다. 배양액은 매일 교체해 주고, 5일에서 7일 간격으로 새로운 지지세포에 계대배양하였으며, 세포 배양은 37°C, 5% CO2, 95% 습도를 유지하면서 진행하였다(Thomson 등, 1998).
데이터처리
- 이용하여 나타내었다. 각 실험군 간의 다중 비교를 위하여 one-way analysis of variance (ANOVA)를 SPSS (SPSS 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램의 student t-test를 이용하여 유의성 검정하였으며, p값이 <0.05 일 때 통계학적으로 유의성 있는 차이가 있는 것으로 하였다.
- 대조군과 실험군에 대한 정량적인 결과는 평균값과 표준편차를 이용하여 나타내었다. 각 실험군 간의 다중 비교를 위하여 one-way analysis of variance (ANOVA)를 SPSS (SPSS 17.
이론/모형
- Acti&-A에 의해 분화 유도된 배상체에서 발현되는 내배엽성 세포 특이적 항체를 관찰하기 위해 면역염색법을 수행하였다. 면역염색을 위하여, 세포 시료를 4% 파라포름알데하이드로 15분간 상온에서 고정시킨 다음, 0.
- 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 사용한 세포 시료는 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 Maxime RT PreMixKit(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Sxmg- nam, Kyungki-Do, Korea) 를 사용하여 cDNA로 합성되었다. 실시간 중합효소 연쇄 반응은 Faststart DNA Mas terplus SYBR Green I kit(Roche Diagnostics, Burgess Hill, U.k)를 이용하여 Roche Lightcycler System을 통해 수행되었고, 정량화를 위하여 제조자(maruifacturer)의 지침에 따라 comparative Ct 방법을 이용하여 표적 유전자를 GA- PDH에 대하여 표준화 시켰다(Naito 등, 2006). Table 1은 본 실험에서 사용된 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
성능/효과
- Expression pattern and distribution of plurijKStency and markers (rf the germ layers in cystic EBs of Actvin-A tinted and non-treated groups. (A~D) The pluripotency marker, Oct4, ecto derm lineage marker, Tujl, and endoderm lineage marker, AFP, were shown to have significantly different expression and distribution between Actvin-A treatment and non-treatment as a control groups according to the immunocytochemistry results. DAPI staining indicates nuclei.
- 2A). 각 배엽성의 대표적인 표지인자 유전자의 발현 패턴에서, 내배엽 표지인자인 AFP 유전자는 미분화 인간 배아 줄기세포군과 비처리군에 비해 처리 군에서만 강하게 발현되었으며 (Fig. 2B), 중배엽 표지인자인 Brachyury 유전자와 외배엽 표지인자인 Tubb3 유전자의 경우, 미분화 인간 배아 줄기세포군과 처리군에서는 약하게 발현된 반면, 비처리'군에서는 강하게 발현되는 패턴을 보였다(Fig. 2C). 따라서 우리는 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석을 통해, 배상체의 대부분이 cavity 형태인 Acti vin-A 비처리군의 경우(Fig.
- 중합효소 연쇄 반응 기법으로 분석하였다. 그 결과, Oct4 유전자 발현의 경우, 미분화 인간 배아 줄기 세포군에서만 강하게 발현되고, ActiBn-A의 비처리군과 처리군 모두에서는 Oct4 유전자의 발현이 약하고 두 군간의 발현 차이는 없었다(Fig. 2A). 각 배엽성의 대표적인 표지인자 유전자의 발현 패턴에서, 내배엽 표지인자인 AFP 유전자는 미분화 인간 배아 줄기세포군과 비처리군에 비해 처리 군에서만 강하게 발현되었으며 (Fig.
- 3Q. 내배엽성 특이 항체 AFP의 경우, 처리군과 비처리군의 cystic 배상체 모두에서 AFP 발현세포가 관찰되었으며' 특히, 처리군의 cystic 배상체에서의 AFP 발현이 비처리군의 cystic 배상체보다 강한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B와 3D). 따라서, Activin-A 처리에 의해 형성된 cystic 배상체가 비처리군의 cystic 배상체보다 내배엽성 세포 분화가 촉진되었다는 것을 알 수 있었다.
- 2C). 따라서 우리는 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석을 통해, 배상체의 대부분이 cavity 형태인 Acti vin-A 비처리군의 경우(Fig. IB), 삼배엽성 세포가 고루 분포하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며 (Fig. 2B-2D), 특이적으로 중배엽성 세포의 발현이 강한 것을 확인할 수 있었다 (Fig 2C) (Yang 등, 2008; Cho 등, 2007). 반면, 배상체의 대부분이 cystic 형태인 Activin-A 처리군의 경우(Fig.
- 3A-3D). 따라서, Activin-A 처리에 의해 내배엽성 세포가 증가한 cystic 배상체에서는 외배엽성 세포의 발현이 현저히 감소된다는 것을 알 수 있었다. 상기 결과는, 유전자 발현 패턴과 비슷한 양상(Fig.
- 3B와 3D). 따라서, Activin-A 처리에 의해 형성된 cystic 배상체가 비처리군의 cystic 배상체보다 내배엽성 세포 분화가 촉진되었다는 것을 알 수 있었다. 외배엽 특이 항체 Tujl의 경우, 처리군의 cystic 배상체에 비해 비처리군의 cystic 배상체에서 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었t*Fig.
- 배양접시에 부착된 non-cystic과 cystic 배상체는 부착된 지점을 중심으로 cluster와 mono- layer 부분으로 구분하여, AFP 발현 패턴을 면역 염색법으로 분석하였다. 부착된 non-<ystic 배상체의 경우' mono- layer 부분에서는 다양한 세포의 형태가 관찰되었으며(Fig. 4A), 면역 염색 결과에서 AFP 발현세포가 monolayer의 일부분에서만 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다. Fig.
- 4D). 부착된 non-cystic 배상체와 cystic 배상체의 duster와 monolayer 부분을 물리적으로 분리하여' AJFP 유전자 발현 양상을 실시간 중합효소 연쇄반응 분석법을 이용하여 분석한 결과, 상대적으로 부착된 cystic 배상체의 monolayer에서 AFP 유전자의 발현이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4E). 상기 결과로부터, Activin-A 처리군의 cystic 배상체를 선택적으로 구분한 후, 일정 기간 배양접시에서 배양하여 monolayer 부분의 세포군 만을 물리적인 방법으로 분리하는 것이 고순도 내배엽성 세포를 효과적으로 정제할 수 있는 방법이라 판단하였고, 물리적으로 분리한 세포를 새로운 배양접시에 옮겼을 때, 균일한 형태로 세포가 배양되고 있다는 것을 알 수 있었으며(Fig.
- 따라서, Activin-A 처리에 의해 내배엽성 세포가 증가한 cystic 배상체에서는 외배엽성 세포의 발현이 현저히 감소된다는 것을 알 수 있었다. 상기 결과는, 유전자 발현 패턴과 비슷한 양상(Fig. 2A-2D)을 보였으며, Activin-A는 cystic 배상체의형성을 증가시킴과 동시에 내배엽성 세포로의 분화를 촉진시키는데 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
- 4E). 상기 결과로부터, Activin-A 처리군의 cystic 배상체를 선택적으로 구분한 후, 일정 기간 배양접시에서 배양하여 monolayer 부분의 세포군 만을 물리적인 방법으로 분리하는 것이 고순도 내배엽성 세포를 효과적으로 정제할 수 있는 방법이라 판단하였고, 물리적으로 분리한 세포를 새로운 배양접시에 옮겼을 때, 균일한 형태로 세포가 배양되고 있다는 것을 알 수 있었으며(Fig. 5A), AFP 발현세포를 면역염색법으로 분석한 결과 전체 세포 중 70% 정도의 세포가 AFP가 발현되는 내배엽성 세포임을 알 수 있었다(Fig. 5B와 5C).
- 2B)(Conley 등, 2004; Sachlos와 Auguste, 2008). 상기 결과로부터, 배상쳐 분화 과정에 처리한 Activin-A는 미분화 유전자의 발현 패턴에는 크게 관여하지 않으나, 삼배엽 관련 유전자 중 특히, 내배엽 관련 유전자 발현 패턴에 중요한 성장인자로 작용한다는 것을 판단할 수 있었다.
후속연구
- 6D). 본 연구 결과로부터, Activin-A 성장인자는 내배엽성의 세포 분화에 효과적으로 이용될 수 있으며, 면역세포 분석기법을 통한 AFP 발현 세포의 패턴을 조사하여 물리적으로 분리 정제하는 방법은 세포 특이 표면인자가 없어 유세포 분석기를 통해 내배엽성 세포를 정제할 수 없는 현시점에서 고순도 내배엽 성세포를 효과적으로 정제할 수 있는 대안책으로 이용할 수 있을 것으로 판단되며, 이러한 분화방법은 내배엽성 세포의 분화뿐 아니라, 인간 배아 줄기세포 유래의 분화된 다양한 세포의 분화 및 효과적인 정제 방법으로 활용될 수 있을 것이라 기대한다.
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