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문제 정의
- 본 연구에서는, 이러한 세포 공급의 한계가 없는 중간엽 줄기세포의 획득을 위해 무한 자가 증식이 가능한 인간 배아 줄기세포를 이용하여 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하였다. 인간 배아 줄기세포의 배양 및 분화 과정 동안의 이종간 오염을 방지하기 위해 feoier free 배양법을 이용하였으며 (Wagner와 Vemuri, 2010), 보다 효과적인 분화 유도를 위한 2-D direct differentiation 방법을 도입하여 분화를 유도하였다.
- 그러나 현재까지 인간 배아 줄기세포를 배양하는 방법으로는 생쥐의 섬유아세포를 지지세포로 이용함으로써 인간에 적용 가능한 최종 임상 치료 목적으로 사용될 시 이종 간의 오염 문제의 가능성이 문제점으로 지적되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해본 연구에서는 지지세포를 사용 없이 유지 배양된 인간배아 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 기술을 개발하고' 동시에 분화된 중간엽 줄기세포에 대한 단백체 분석을 통해 성체 중간엽 줄기세포와 분화 유도된 세포의 특성을 파악하며, 세포 분화 과정에서의 일어나는 다양한 분자-세포 수준의 이해와 함께 새로운 분화 인자의 발굴 가능성을 탐색하기 위해 본 연구를 실시하였다.
- 이에 단백체학 분석을 통해 동정화된 단백질들이 이런 분화 효율 인자로써의 중요한 단백질로써 역할을 하리라 추측할 수 있었으며' 이에 기존 보고서 자료에 의한 기능, 역할에 대해서 알아보았다. 먼저, 골수 유래 중간엽 줄기세포 특이적으로 과발현된 단백질 중 annexin A2는 칼슘의 존재량에 의해 발현량의 차이를 보이는 단백질로써, phospholipid bingding protein으로 널리 알려져 있으며, 다양한 세포 타입의 surface에 존재한다.
- 이러한 형태학적 특정 마커의 양성 발현 및 분화능의 확인은 분화된 세포가 중간엽 줄기세포의 특징을 가지고 있음을 의미하며, 이러한 특징 발현은 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포치료제로써 이용을 위한 가능성을 확인한 한 방법이라 할 수 있다. 하지만' 이러한 특성 확인만으로는 근본적인 특징 검사 및 중간엽 줄기세포로써 보일 수 있는 메커니즘에 관한 것은 확인할 수없으므로, 본 연구에서는 이러한 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 분자 수준에서의 발현 패턴을 골수 유래 중중간엽 줄기세포와의 단백체학을 이용한 비교연구를 통하여 보다 깊게 알아보았다. 단백체학을 이용한 실험 결과' 인간 배아 줄기세포와 성체 줄기세포 유래의중중간엽 줄기세포의 단백질 발현 양상은 90% 이상 유사성을 보였으며, 각각 5, 500〜6, 000개 정도의 단백질의 발현 양상을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 2-DE(Two-dimensional gel electrophoresis) 는 IEF(Iso- electric focusing)을 위한 Multiphor 시스템과 SDS-PA- GE 분석을 이용하였다. Iiranobiline Drystrips(18 cm, pH 3 to pH 11, NL)을 200 ii g의 단백질이 녹아 있는 DeS treak Rehydration Solution 위에 올려 rehydration(GE Healthcare) 상태를 실온에서 12시간 동안 유지하였으며, IEF는 20°C로 유지하면서 300 V에서 1분, 3z500 V에서 90 분 그리고 3, 500 V에서 8시간 동안 수행하였다.
- 배양하였다. 24시간 간격으로 배지를 교체하고 5〜6일 간격으로 새로이 코팅된 조직 배양 접시에 계대배양을 하였다.
- 위해 FACS 분석법을 실시하였다. FACS 분석을 위해 PBS(Gibco IX)로 세척하고, Trypsin-EDTA(Giboj)를 이용하여 단일 세포군으로 만든 뒤 2% FBS(Gibco) 가 함유된 PBS를 이용하여 분석을 실시하였다. 중간엽 줄기세포의 대표적인 양성 마커인 CD105(APC, R&D system), CD90 (PE, R&D system), CD73(PE, R&D system), CD44(PE, R&D system), 미분화 인간 배아 줄기세포 바커 인 SSEA- 4(APC, R&D system), AP(PE, R&D system), 중간엽 줄기세포 음성 마커인 CD133(APC, R&D system), CD31 (PE, R&D system), CD45(PE, R&D system)를 호.
- 분석을 이용하였다. Iiranobiline Drystrips(18 cm, pH 3 to pH 11, NL)을 200 ii g의 단백질이 녹아 있는 DeS treak Rehydration Solution 위에 올려 rehydration(GE Healthcare) 상태를 실온에서 12시간 동안 유지하였으며, IEF는 20°C로 유지하면서 300 V에서 1분, 3z500 V에서 90 분 그리고 3, 500 V에서 8시간 동안 수행하였다. IEF 이후 gel strip을 equilibration buffer(50 mM Tris-HCl pH 6.
- Tryptic peptide는 nano LC-Ms/Ms로 분석을 하였으며, peptide는 nano C18 column(75 y m><15 cm nano- Acquity™ UPLC™ column, waters)을 이용한 nano UP- LC system(waters)으로 분리하였다. Peptide는 0.
- 각각의 세포에서 특이적으로 과발현되는 단백질에 대한 정확한 정보를 확인하고자 EXPASY(http://www.expasy. org) 정보를 이용하여 molecular function과 biological process별로 기능적 관여 단백질과의 상관성을 도식화하였다. 그룹화 결과, 단백질의 기능성별 작용 기작의 연관성을 볼 수 있는 molecular function 그룹화 결과 protein binding(29%), catalytic activity(21%), nucleotide binding (12%), phospholipase inhibitor activity(5%), 그리고 enzy me bindmg(5%) 작용 기작에 관여하는 단백질이 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 단백질이 특이적으로 감소되는 경향이 확인되었으며, 신진 대사 기작의 연관성을 확인할 수 있는 biological process 그룹화 결과 negative regulation of biological process(18%), negative regula tion of cellular process(17%), negative regulation of ce llular metabolic process(10%), negative regulation of ma cromolecule metabolic process(10%) 그리고 positive re gulation of molecular function(7%) 작용 기작허 관여하는 단백질이 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 단백질이 대부분 과발현됨을 확인하였다(Fig.
- 2-DE를 통하여 proteome을 분석하였다. 골수 유래 중 간엽 줄기세포와 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 각각을 2-DE와 LC/MS를 이용하여 서로 다르게 나타나는 단백질들을 관찰하였다. 각각의 샘플에서 얻은 200 ug의 단백질을 IPG strips(pH 3~11, non-linear)을이용하여 IEF한 후에 전기영동을 수행한 결과, 서로 다르게 증가하는 44개의 단백질들을 찾았으며 이들 단백질 중 19개는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 증가하였고, 나머지 25개는 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포에서 증가하였다(Fig.
- 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포가 생리학적으로 어떻게 다르며, 이때 분화에 관련된 단백질이 무엇인지 알아보기 위해 2-DE를 통하여 proteome을 분석하였다. 골수 유래 중 간엽 줄기세포와 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 각각을 2-DE와 LC/MS를 이용하여 서로 다르게 나타나는 단백질들을 관찰하였다.
- 분화된 세포를 Oil Red O의 염색 방법으로 지방세포를 확인할 수 있었다. 또한, 골아 세포로의 분화 유도를 위해 분화 배양액(St empro® Osteocyte Differentiation Basal Medium) 에서 3 일에 한 번씩 배양액을 교체해 주고, 3주 동안 배양을 하여 골아 세포로의 분화를 유도하였다. 분화된 세포는 Von- kossa's 염색을 통하여 칼슘이 침착되는 것을 확인할 수 있었다.
- 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포(H9, CHA-hESC15) 를 Matrigel™hESC-qualified Mat&x(BD)로 코팅된 60 mm 조직 배양 접시에 mTeSR™1 medium ldt(stem cell) 배지를 이용하여 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포를 유지 배양하였다. 24시간 간격으로 배지를 교체하고 5〜6일 간격으로 새로이 코팅된 조직 배양 접시에 계대배양을 하였다.
- 본 연구에서 BM-MSC(Lonza)는 세포 특성 및 단백체 학 분석을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. BM-MSC는 100 mm 조직 배양 접시에 2xl()5개의 세포를 3~4일에 한 번씩 MSCGM™(Lonza) 배양액으로 교체하고 7일에 한 번씩 계대배양을 하였다.
- 본 연구의 분화 방법을 토대로 획득된 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 유세포 분석 및 지방세포, 골아세포로의 분화를 유도를 통해 중간엽 줄기세포로서의 특성 분석을 실시하였다.
- 인간 배아 줄기세포 및 골수에서 유래된 흐간엽 줄기세포를 4well plate에 6×O5, 세포를 seeding 후 분화 배양액 (Stempro® adipocyte Differentiation Basal Medium) 에서 3일에 한 번씩 배양액을 교체해 주고 4주 동안 배양을 하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 분화된 세포를 Oil Red O의 염색 방법으로 지방세포를 확인할 수 있었다.
- 인간 배아 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포는 EBM 배지에 2% FBS가 첨가된 배양액을 이용하여 3일에 한 번씩 계대배양을 하였으며, 양성대조군인 성체 중간엽 줄기세포와 함께 형태학적 분석과 특정 마커의 발현을 분석하였다. 중간엽 줄기세포의 양성 마커인 CD44, CD105, CD73, CD90과 음성 마커인 CD45, CD31, CD44, CD133 를 각각 확인하였으며, 그 결과 인간 배아 줄기세포 유래
- 5% iodoacetamide# 첨가하였다. 전기영동은 12% separation gel과 4% stacking gel로 만든 SDS polyacrylamide vertical slab gel을 이용하였고, gel을 silver staining(GE Healthcare) 하여 단백질을 염색하였다.
- 혈관세포 성장을 위한 기본 배양액으로 알려진 EBM 배양액에(Lonza) 2% FBS가 첨가된 배양액에서 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포를 60 mm 조직 배양 접시 내 유지 배양하면서 5일 동안 분화를 유도하고, 분화된 세포를 100 mm 조직 배양 접시에 계대배양 이후 EBM(Lonza) 2% FBS 배지 조건에서 3일에 한 번씩 계대배양하였다.
대상 데이터
- 분석 전에 질량분석기는 [* Glu^fibrinopeptide 사용하여 교정하였다. LC-MS/MS 데이터는 DDA(data dependent ac quisition) mode로 수집하였다.
- 가공된 데이터는 IPI human database# 사용하여 탐색하였다. 데이터의 탐색은 PLGS와 MASCOT DAEMON pro- grams(http://www.matrixscience.com)'S; 사용하였다.
- 인간 배아 줄기세포를 Matrigel™ hESC-qualified Ma- trix(BDz Bioscience)가 코팅된 배양 접시에 부착 후 mTe- SR™1 Medium kit(Stem cell Tedmology)로 배양하였다. Feeder-free 상태에서 8 계대까지 콜로니의 형성과 정상적인 핵형이 유지됨을 관찰할 수 있었다.
이론/모형
- 지방세포로 분화를 유도하였다. 분화된 세포를 Oil Red O의 염색 방법으로 지방세포를 확인할 수 있었다. 또한, 골아 세포로의 분화 유도를 위해 분화 배양액(St empro® Osteocyte Differentiation Basal Medium) 에서 3 일에 한 번씩 배양액을 교체해 주고, 3주 동안 배양을 하여 골아 세포로의 분화를 유도하였다.
- 이러한 배상체 형성을 통한 분화법의 단점을 극복하고, 보다 효율적인 분화 유도를 위하여' fee der free 법을 이용해 배양된 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포에 분화 .유도를 위한 배양액을 직접 첨가해 주는 2-D direct differentiation 방법을 도입하였다. 2-D direct differentiation법을 이용한 분화 과정 시 배상체 형성에서 오는 시간과 노동력 소모를 방지할 수 있었으며, 분화를 위해 배상체 형성 시 요구되는 인간 배아 줄기세포의 양보다 적은 양의 세포로도 분화 유도가 가능함을 확인할 수 있었다.
- 하지만 배상체 형성 과정 중 자연적으로 cystic 혹은 cavity 형태의 배상체가 형성되며, 이러한 형태학적 차이로 인한 분화 효율의 차이가 보고되어 있으며, 배상체 형성 및 배양 과정 동안 일반 세포와 달리 부유배양법을 이용해야 하므로 이에 따른 시간과 노동력은 상당량 소모된다. 이러한 배상체 형성을 통한 분화법의 단점을 극복하고, 보다 효율적인 분화 유도를 위하여' fee der free 법을 이용해 배양된 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포에 분화 .유도를 위한 배양액을 직접 첨가해 주는 2-D direct differentiation 방법을 도입하였다.
- 유도하였다. 인간 배아 줄기세포의 배양 및 분화 과정 동안의 이종간 오염을 방지하기 위해 feoier free 배양법을 이용하였으며 (Wagner와 Vemuri, 2010), 보다 효과적인 분화 유도를 위한 2-D direct differentiation 방법을 도입하여 분화를 유도하였다. 인간 배아 줄기세포의 분화 방법 중 가장 널리 이용되는 방법은 배상체 형성을 통한 분화 유도이다.
- 중간엽 줄기세포로서의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위해 FACS 분석법을 실시하였다. FACS 분석을 위해 PBS(Gibco IX)로 세척하고, Trypsin-EDTA(Giboj)를 이용하여 단일 세포군으로 만든 뒤 2% FBS(Gibco) 가 함유된 PBS를 이용하여 분석을 실시하였다.
성능/효과
- 유도를 위한 배양액을 직접 첨가해 주는 2-D direct differentiation 방법을 도입하였다. 2-D direct differentiation법을 이용한 분화 과정 시 배상체 형성에서 오는 시간과 노동력 소모를 방지할 수 있었으며, 분화를 위해 배상체 형성 시 요구되는 인간 배아 줄기세포의 양보다 적은 양의 세포로도 분화 유도가 가능함을 확인할 수 있었다. 또한, 배상체 형성 시 배상체가 가지는 구상의 세포 덩어리 구조로 인해 배상체 내부의 세포에는 외부에서 주어지는 배양액의 분화 유도 인자가 잘 전달되어지지 않는 단점을 극복할 수 있었다.
- Feeder-free 상태에서 8 계대까지 콜로니의 형성과 정상적인 핵형이 유지됨을 관찰할 수 있었다. 8 계대 동안 의미분화 인간 배아 줄기세포를 FACS 분석을 통하여 SS- EA-4(77.90%)와 AP(90.84%)가 지속적으로 발현되었으며, 이러한 결과 분석을 통하여 8 계대 동안의 인간 배아 줄기세포가 미분화 상태의 세포임을 확인하였다(Fig. 1).
- 배양하였다. Feeder-free 상태에서 8 계대까지 콜로니의 형성과 정상적인 핵형이 유지됨을 관찰할 수 있었다. 8 계대 동안 의미분화 인간 배아 줄기세포를 FACS 분석을 통하여 SS- EA-4(77.
- 골수 유래 중 간엽 줄기세포와 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 각각을 2-DE와 LC/MS를 이용하여 서로 다르게 나타나는 단백질들을 관찰하였다. 각각의 샘플에서 얻은 200 ug의 단백질을 IPG strips(pH 3~11, non-linear)을이용하여 IEF한 후에 전기영동을 수행한 결과, 서로 다르게 증가하는 44개의 단백질들을 찾았으며 이들 단백질 중 19개는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 증가하였고, 나머지 25개는 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포에서 증가하였다(Fig. 4).
- org) 정보를 이용하여 molecular function과 biological process별로 기능적 관여 단백질과의 상관성을 도식화하였다. 그룹화 결과, 단백질의 기능성별 작용 기작의 연관성을 볼 수 있는 molecular function 그룹화 결과 protein binding(29%), catalytic activity(21%), nucleotide binding (12%), phospholipase inhibitor activity(5%), 그리고 enzy me bindmg(5%) 작용 기작에 관여하는 단백질이 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 단백질이 특이적으로 감소되는 경향이 확인되었으며, 신진 대사 기작의 연관성을 확인할 수 있는 biological process 그룹화 결과 negative regulation of biological process(18%), negative regula tion of cellular process(17%), negative regulation of ce llular metabolic process(10%), negative regulation of ma cromolecule metabolic process(10%) 그리고 positive re gulation of molecular function(7%) 작용 기작허 관여하는 단백질이 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 단백질이 대부분 과발현됨을 확인하였다(Fig. 5).
- 하지만' 이러한 특성 확인만으로는 근본적인 특징 검사 및 중간엽 줄기세포로써 보일 수 있는 메커니즘에 관한 것은 확인할 수없으므로, 본 연구에서는 이러한 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 분자 수준에서의 발현 패턴을 골수 유래 중중간엽 줄기세포와의 단백체학을 이용한 비교연구를 통하여 보다 깊게 알아보았다. 단백체학을 이용한 실험 결과' 인간 배아 줄기세포와 성체 줄기세포 유래의중중간엽 줄기세포의 단백질 발현 양상은 90% 이상 유사성을 보였으며, 각각 5, 500〜6, 000개 정도의 단백질의 발현 양상을 확인할 수 있었다. 발현되는 전체 단백질의 발현 양상을 보다 정확하게 확인하기 위하여 이미지 분석기를 이용하여 발현량의 차이를 분석한 결과, 인간 배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포에서 44개의 단백질 이과 발현됨을 확인하였으며, 44개중 최종 25개의 과발현 단백질을 동정화할 수 있었으며, 성체 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포에서 과발현되는 30개의 단백질 중 19개 의과 발현 단백질을 동정화 하는데 성공하였다(Table 1).
- 2-D direct differentiation법을 이용한 분화 과정 시 배상체 형성에서 오는 시간과 노동력 소모를 방지할 수 있었으며, 분화를 위해 배상체 형성 시 요구되는 인간 배아 줄기세포의 양보다 적은 양의 세포로도 분화 유도가 가능함을 확인할 수 있었다. 또한, 배상체 형성 시 배상체가 가지는 구상의 세포 덩어리 구조로 인해 배상체 내부의 세포에는 외부에서 주어지는 배양액의 분화 유도 인자가 잘 전달되어지지 않는 단점을 극복할 수 있었다. 분화 유도를 위해 사용된 배양액은 EBM(endofhelial basal medium)으로 혈관내피세포 배양을 위해 생성된 배양액이지만, 혈관 전구세포 등의 각종 전구세포의 배양에 또한 널리 사용되고 있다.
- 단백체학을 이용한 실험 결과' 인간 배아 줄기세포와 성체 줄기세포 유래의중중간엽 줄기세포의 단백질 발현 양상은 90% 이상 유사성을 보였으며, 각각 5, 500〜6, 000개 정도의 단백질의 발현 양상을 확인할 수 있었다. 발현되는 전체 단백질의 발현 양상을 보다 정확하게 확인하기 위하여 이미지 분석기를 이용하여 발현량의 차이를 분석한 결과, 인간 배아줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포에서 44개의 단백질 이과 발현됨을 확인하였으며, 44개중 최종 25개의 과발현 단백질을 동정화할 수 있었으며, 성체 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포에서 과발현되는 30개의 단백질 중 19개 의과 발현 단백질을 동정화 하는데 성공하였다(Table 1).
- 이러한 미세 환경 변화만으로도 분화 유도가 가능한 인간 배아 줄기세포의 특징을 이용하여, 본 연구에서는 2-D 상태에서 미분화 상태 유지를 위한 배양액 제거 후, 전구세포 등의 배양을 위해 사용되는 기본 배지로의 교환이 가져오는 기초적인 미세 환경변화가 특정 성장인자 등의 영향 없이도 분화가 가능함을 확인하였으며, 이를 이용하여 분화된 세포는 중간엽줄기세포의 특징을 보임을 확인하였다. 분화된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가지는 형태학적 특징과 매우 유사한 형태를 보였으며 (Mbroblastic and spindle-like morphology), 중간엽줄기세포 양성 마커 발현(CD73, CD90, CD105, CD44) 과지방 및 골아세포로의 분화가 가능한 특징을 보였다. 이러한 형태학적 특정 마커의 양성 발현 및 분화능의 확인은 분화된 세포가 중간엽 줄기세포의 특징을 가지고 있음을 의미하며, 이러한 특징 발현은 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포치료제로써 이용을 위한 가능성을 확인한 한 방법이라 할 수 있다.
- 줄기세포의 분화에는 영향을 주는 대표적인 인자로는 성장 인자가 가장 잘 알려져 있지만, 줄기세포가 가지는 분화능은 줄기세포가 배양되고 있는 미세한 환경변화로도 분화가 가능하다. 이러한 미세 환경 변화만으로도 분화 유도가 가능한 인간 배아 줄기세포의 특징을 이용하여, 본 연구에서는 2-D 상태에서 미분화 상태 유지를 위한 배양액 제거 후, 전구세포 등의 배양을 위해 사용되는 기본 배지로의 교환이 가져오는 기초적인 미세 환경변화가 특정 성장인자 등의 영향 없이도 분화가 가능함을 확인하였으며, 이를 이용하여 분화된 세포는 중간엽줄기세포의 특징을 보임을 확인하였다. 분화된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가지는 형태학적 특징과 매우 유사한 형태를 보였으며 (Mbroblastic and spindle-like morphology), 중간엽줄기세포 양성 마커 발현(CD73, CD90, CD105, CD44) 과지방 및 골아세포로의 분화가 가능한 특징을 보였다.
- 이미지 분석을 통하여 전체 단백질의 발현 양상의 차이를 분석한 결과, 기존 인간 배아 줄기세포와의 단백질 발현 양상이 70% 정도의 유사성을 보인데 반해 상당한 유사성을 보임으로써 중간엽 줄기세포의 발현 단백 질의양상과 비슷함을 확인하는 결과로 중간엽 줄기세포와 유사한 성격의 세포로써의 추측을 가능하게 하였다. 하지만두 종류의 중중간엽 줄기세포는 특정 마커 단백질의 발현양 상은 비슷하나, 골아 세포와 지방세포로의 분화 시간과 분화효율은 각각 차이를 보였다.
- 형성되는 것을 알 수 있었다. 이와 반대로 골아 세포의 분화는 다른 차이가 없이 비슷하게 분화가 진행됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 중간엽 줄기세포는 0)44(96.34%), CD105(95.10%)z CD73 (97.17%), CD90(97.92%)를 확인하고, 음성 마커 인 SSEA- 4(2.15%), 0)45(5.48%), CD31(2%%), CD34Q35%), 8133 (3.65%) 등이 현저히 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 성체 중간엽 줄기세포 분석 결과 CD44 (96.20%), OD105 (91.62%), CD73(99.89%), CD90(95.99%), 음성 마커인 CD45(1.41%), CD31(1.71%), CD34(1.%%), CD133(1.17 %), SSEA4Q7.91%)로 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽줄기세포와 성체 유래 중간엽 줄기세포에서 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(Fig. 2). 한편, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포분화능 분석을 위해 지방세포와 골아세포로의 분화 유도능을 성체 유래의 중간엽줄기세포와 비교한 결과, 인간 배아 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포는 골아 세포로 분화하는 시기가 약 18일 후에 분화되며, 지방세포는 30일 후에 분화가 일어나는 반면, 성체 유래 중간엽 줄기세포는 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포보다 빠른 14일에 지방세포와 골아 세포로 분화가 되는 것을 확인하였다.
- 중간엽 줄기세포는 지방질이 작으며, 부분적으로 지방질이 형성되는 것을 알 수 있었다. 이와 반대로 골아 세포의 분화는 다른 차이가 없이 비슷하게 분화가 진행됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 2). 한편, 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포분화능 분석을 위해 지방세포와 골아세포로의 분화 유도능을 성체 유래의 중간엽줄기세포와 비교한 결과, 인간 배아 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포는 골아 세포로 분화하는 시기가 약 18일 후에 분화되며, 지방세포는 30일 후에 분화가 일어나는 반면, 성체 유래 중간엽 줄기세포는 인간 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포보다 빠른 14일에 지방세포와 골아 세포로 분화가 되는 것을 확인하였다. 또한, 성체 유래 중간엽 줄기세포에서 지방세포는 모든 세포에서 지방질이 크고 선명하게 형성되는 반면, 인간 배아 줄기세포 유래
후속연구
- 인간 배아 줄기세포를 이용하여 난치병 치료를 위한 세포 치료제를 만들기 위한 기본적인 배양 조건과 특성 세포로의 효율적인 분화 유도 방법 및 분리 정제 기술은 대량 생산을 위하여 개발되어야 할 부분으로써, 본 연구에서 새로운 배양 조건의 변화와 효율적인 특정세포 분화 방법은 차후, 세포치료제 개발을 위한 대량 생산 부분에 응용되리라 기대되며, 단백체학 분석 방법을 이용하여 두 종류의 세포 주 특이적으로 과발현 또는 감소하는 단백질의 정보를 통하여 중간엽 줄기세포의 분화 조절인자로써의 가능성을 제시하였으며, 보다 효율적인 분화 배양조건 설립 시 관련 기작에 대한 기본적인 정보로써의 활용도가 기대된다.
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