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문제 정의
- 그러나 국내히서는 hormone 분석을 통한 가축의 임신 진단에 대한 보고가 외국에 비해 상대적으로 적고, 젖소의 경우, 혈중 또는 우유 내 proges- terone을 ELEA 법으로 측정한 보고는 되어 있으나 (Kim 등2008), 돼지의 조기 임신 진단에 대한 뇨중 호르몬 대사산물에 대한 연구는 국내에서는 전무한 실정이었다. 따라서 본 연구에서는 돼지의 조기 임신 진단법을 개발하기 위한 방법으로 E1S와 교차 반응을 나타내는 ElQglu- ctuxmide)에 대한 항체를 이용한 'heterologous ELA'법을 개발하여 임신 및 비임신 돼지로부터 채취한 오줌 시료 내 E1S 농도를 측정, 분석함으로써 돼지의 임신 진단을 위한 기준을 설정하고 이후 돼지 임신 진단에 적용할 수 있는 kit 개발이나 새로운 분석 방법 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 돼지의 조기 임신 진단을 위한 방법으로 임신 돼지 오줌 내에 존재하는 E1S를 측정하는 ELISA 법에 관한 것이다. 임신한 돼지의 오줌에 존재하는 E1S는 다른 대사산물에 비하여 높은 농도가 생산되는 것으로 알려져있어 조기 임신 진단 방법으로 개발이 시도되었다(Almond 와 Dial, 1986; Atkinson 등, 1987).
- E1S의 면역 분석법 개발을 위하여 첫 번째로 E1S에 대한 항체의 생산이 요구되는데 E1S의 안정성 문제로 항체 생산이 극히 어려운 문제가 있어 개발에 어려움이 있었다(Seren 등, 1983; Almond 등, 1985). 이에 본 연구에선 이 점을 극복하기 위한 방법으로 E1S와 교차 반응을 하는 항체를 이용한 소위 'hetelogous system immxmoassay(Tagawa 등, 2000) 법을 개발하게 되었고 성공적으로 확립하였다. 성공적인 heterologous ELISA 분석을 위한 방법으로 가장 중요한 것은 항체의 교차 반응이 가장 중요한 요인이 된다(Ta- gawa 등, 2000).
제안 방법
- E1S에 대한 표준곡선을 얻기 위한 항체 역가를 결정하기 위하여 E1G에 대한 각 단일 클론 항체를 여러 농도 (50 pg~190 ng/ml)로 조정하여 ELISA plate의 각 well 에 100 μ g/well로 coating하고, 200배로 희석된 E1S-HRP conjugate 단독 혹은 1 E1S를 첨가하여 경쟁 정도도 함께 조사하였다. Fig.
- EIS와 경쟁적 반응을 하는 tracer는 E1G에 효소 HRP 를 붙인 E1G-HRP conjugate를 Stefanakis 등(2)의 방법을 일부 수정하여 실시하였다. 약술하면, 5 mg의 E1G, 4 mg의 ECD 및 5 mg 의 NHS를 300 μ1의 DMSO에 첨가하고 상온에서 2시간 동안 교반시킴으로 semi-stable amine-reactive NHS ester를 제조하였다.
- 회수율 조사는 PBS 에 각각 200, 800 pg 및 3000 ng/well로 E1S를 첨가 후 assay 결과 얻은 E1S의 함량을 측정하여 기대치와 측정치에 대한 bias(%)으로 표시하였다 (Table 2). Intra-assay에 대한 실험 결과 E1S 정량을 위한 범위인 156.3 pg~20 ng/ml에서 임의적으로 비교적 높은 함량의 3 ng, 중간인 800 pg, 그리고 비교적 낮은 함량인 200 pg/ml의 3가지로 함량을 정하였다. 분석을 위한 각 함량별 시료는 각각 10개씩 측정하였고, E1-3 정량을 위한 표준곡선에 적용하여 나온 결과를 Table 2에 제시하였다.
- 결정된 적정한 양의 항체(anti-ElG인 clone 155 항체) 를 ELISA plate에 coating 시키고 난 후 3% BSA로 block- ing하고 결정된 적정량의 E1G-HRP와 표준물질(625 pg~ 10 ng/ml 농도로 조정된 E1S)을 각 0.1 ml를 동시에 첨가하고, 상온에서 2시간 경쟁 반응시켰다. 반응 완료 후 각 well을 PBS-T로 3회 세척하고 TMB 기질을 첨가한 후 ELISA reader로 450 run에서 O.
- D가를 보여주는 최대 희석비로 결정하였다. 경쟁적 ELISA를 위한 항체가의 측정은 여러 농도로 조정된 anti-ElG 항체를 coating 후에 ElG-HRP(><200) conjugate 단독 혹은 1 Hg/ml의 E1S를 첨가한 후 그 반응성과 경쟁성을 함께 고려하여 결정하였다.
- 05% Tween 20; PB&T)로 3 회 세척 후 3% bovine serum albumin (BSA)으로 blocking 시켰다. 그 후, 여러 농도의 E1GHRP를 첨가하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 세척하고 기질 용액(IMB; Sig- ma-Aldrich)을 넣고 30분 반응시킨 후 2 M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, ELISA reader(ELX8O); Bio-tek instru- ment)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성한 E1G-HRP 의 농도는 anti-ElG와 최대 반응성을 나타내면서 적정한 O.
- 그 결과, 약 200배까지의 El&HRP의 첨가는 최고의 흡광도를 유지하였고, 400배 이하의 희석 비율부터 흡광도가 감소하는 농도 의존적인 경향을 보였다. 따라서 E1S에 대한 경쟁적 ELISA를 위한 E1S-HRP conjugate의 희석농도는 표준 곡선의 감도 및 비 특이성 반응(non-specific binding; NSB) 등을 고려하여 200배로 결정하였다(Fig. 1).
- 것이다. 따라서 E1S와 교차 반응성이 있는 항체의 선정을 위하여 done 8A3, clone 3F11 및 done 155를 각각 5 iig/100 ul/well로 coating 후 E1GHRP와 여러 농도의 E1S 및 E1G를 각각 첨가하여 경쟁 반응 정도로써 교차 반응 정도를 결정하였다(Barnard 등, 1989).
- 본 연구에서 개발하는 경쟁적 heterologous ELISA 분석법은 항체의 교차 반응을 이용한 방법이기에 분석법에 사용하는 E1G에 대한 항체 (done 8A3, 3F11, 155)가 E1S와 높은 교차 반응을 보여야 한다. 따라서 각 항체별로 E1G와 E1S에 대한 경쟁 반응을 보기 위하여, anti-ElG 항체가 coating된 plate의 각 well에 E1S-HRP 및 625 pg~10 ng/ml 농도로 조정된 E1S 및 E1G를 첨가하여 경쟁반응을 시켜 보았다. 그 결과 done 3F11과 clone 8A3의 경우는 E1S와의 교차 반응도가 각각 1.
- 따라서 합성한 E1GHRP의 적정 농도를 결정하기 위하여 항체가 coating(5 ug/well) 된 ELISA plate에 여러 농도의 E1G-HRP conjugate를 첨가하여 반응시켰다. 그 결과, 약 200배까지의 El&HRP의 첨가는 최고의 흡광도를 유지하였고, 400배 이하의 희석 비율부터 흡광도가 감소하는 농도 의존적인 경향을 보였다.
- 2%를 보임으로써 비교적 우수한 결과를 나타냈다. 또한 inter-assay는 총 6회에 걸쳐서 측정하였으며, 실험에 적용한 E1S의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다. 그 결과 CV 값은 실험에 적용한 함량인 3 ng/ml, 800 및 200 pg/ml의 모든 경우에서 10% 이내로 나타났다.
- 등, 1982). 반복 실험 후 본 assay sys- tem의 재현성은 각 농도에 대한 실험결과를 토대로 변이계수(coefficient variation: C.V)를 산줄함으로 결정하였다. 회수율 조사는 PBS 에 각각 200, 800 pg 및 3000 ng/well로 E1S를 첨가 후 assay 결과 얻은 E1S의 함량을 측정하여 기대치와 측정치에 대한 bias(%)으로 표시하였다 (Table 2).
- 6 의 carbonate-bicarbonate buffer(300 μ1)에 1 mg HRP 를 용해시킨 흑, 앞서 제조된 semi-stable amine-reactive NHS ester를 첨가하고 4℃에서 16시간 교반시켰다. 반응 완료 즉시' quenching bufferfthermo Scientific) 로 모든 반응을 정시시킨 후 Sephaayl S-400 High Resolution의 1-filtration 컬럼을 이용하여 합성된 E1GHRP와 반응하지 않은 E1G를 분리하였다. 용출 buffer로는 PBS를 이용하였으며 용출된 각 분획은 단백질정량(BCA assay)을 통하여 정량하였다.
- 1 ml를 동시에 첨가하고, 상온에서 2시간 경쟁 반응시켰다. 반응 완료 후 각 well을 PBS-T로 3회 세척하고 TMB 기질을 첨가한 후 ELISA reader로 450 run에서 O.D가를 측정하였다.
- 본 분석방법의 정확성을 평가하기 위하여 E1S 표준 곡선을 기초로 정량 범위인 0.15~20 ng/ul에서 4개의 서로 다른 농도의 표준물질을 동일한 시간에 10회씩 반복즉정하는 intra-assay와 다른 시간에 동일한 실험을 행한 inter-assay를 실시하였다. 실험에 적용한 E1S의 농도는 표준 곡선의 정량을 위한 범위에서 임의적으로 비교적 높은 농도인 20 ng/ml, 중간농도인 10 ng/μ1 및 5 ng/pl, 그리고 비교적 낮은 농도인 1 ng/ul의 4가지 농도를 정하여 실시하였다.
- 영향을 주는 방해요인이 있을 경우 일반적으로 표준 시료를 E1S가 없는 수퇘지의 오줌을 이용한 분석용 표준 시료 소위 'internal standard'를 사용하여야 한다(Kohen 등, 1980). 본 분석법의 감도와 임신 돼지의 E1S의 농도를 함께 고려할 때 50배 회석된 오줌이 가장 적합하다고 판단되어 표준 시료를 50배 희석된 수퇘지의 오줌을 사용하여 표준 적정 곡선을 작성하였다. 다행스럽게 50배 이상 희석하였을 시 PBS 완충 용액으로 작성한 것과 전혀 다른 차이를 보이지 않았다(결과 미 제시).
- 본 분석법의 정확성 (accuracy)을 평가하기 위하여 시료 중 E1S의 농도가 높은 것, 중간 그리고 낮은 것의 3개로 구분하여 한 시료 당 10회씩 반복 즉정하는 'intra-assay' 와 표준곡선을 달리하여 농도가 다른 3가지의 시료를 6회 반복 측정하는 소위 qnter-assaj/를 실시하여 반복성을 조사하였다(Kim 등, 1982). 반복 실험 후 본 assay sys- tem의 재현성은 각 농도에 대한 실험결과를 토대로 변이계수(coefficient variation: C.
- (Atkinson와 Williamson, 1987). 본 연구에서 개발하는 경쟁적 heterologous ELISA 분석법은 항체의 교차 반응을 이용한 방법이기에 분석법에 사용하는 E1G에 대한 항체 (done 8A3, 3F11, 155)가 E1S와 높은 교차 반응을 보여야 한다. 따라서 각 항체별로 E1G와 E1S에 대한 경쟁 반응을 보기 위하여, anti-ElG 항체가 coating된 plate의 각 well에 E1S-HRP 및 625 pg~10 ng/ml 농도로 조정된 E1S 및 E1G를 첨가하여 경쟁반응을 시켜 보았다.
- 15~20 ng/ul에서 4개의 서로 다른 농도의 표준물질을 동일한 시간에 10회씩 반복즉정하는 intra-assay와 다른 시간에 동일한 실험을 행한 inter-assay를 실시하였다. 실험에 적용한 E1S의 농도는 표준 곡선의 정량을 위한 범위에서 임의적으로 비교적 높은 농도인 20 ng/ml, 중간농도인 10 ng/μ1 및 5 ng/pl, 그리고 비교적 낮은 농도인 1 ng/ul의 4가지 농도를 정하여 실시하였다. 반복 실험 후 본 assay system의 재현성은 각 농도에 대한 실험결과를 토대로 coeffident va- riation(C.
- 일부 수정하여 실시하였다. 약술하면, 5 mg의 E1G, 4 mg의 ECD 및 5 mg 의 NHS를 300 μ1의 DMSO에 첨가하고 상온에서 2시간 동안 교반시킴으로 semi-stable amine-reactive NHS ester를 제조하였다. 그 후, pH 8.
- 반응 완료 즉시' quenching bufferfthermo Scientific) 로 모든 반응을 정시시킨 후 Sephaayl S-400 High Resolution의 1-filtration 컬럼을 이용하여 합성된 E1GHRP와 반응하지 않은 E1G를 분리하였다. 용출 buffer로는 PBS를 이용하였으며 용출된 각 분획은 단백질정량(BCA assay)을 통하여 정량하였다.
- 본 연구에서 사용한 세 가지 항체 즉, an- ti-ElG에 대한 단일 클론 항체인 clone 8A3, 3F11, 155를 이용하여 E1S와 교차 반응을 조사한 결과 clone 155의 경우 우수한 교차 반응을 보여 E1S의 분석에 가장 적합한 항체로 조사되었다. 이 결과에 따라 단일 클론 clone 155 항체를 이용하여 경쟁적 heterologous ELISA법에 의한 E1S의 표준 곡선을 작성하였고, 분석법의 정확성을 조사하기 위하여 반복성 및 회수율을 조사하였다. 그 결과, 본 방법은 반복성 및 회수율에서 모두 10% 이내의 안정된 결과를 보이므로써(Table 1, 2) 매우 안정된 방법임을 확인하였다(Kim 등, 1982; Park 등, 1996).
- internal standard를 사용하였다. 임신 돼지 및 비임신 돼지의 오줌은 각각 PBS로 50배 희석하여 분석하였다.
- 그 후, 여러 농도의 E1GHRP를 첨가하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 세척하고 기질 용액(IMB; Sig- ma-Aldrich)을 넣고 30분 반응시킨 후 2 M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, ELISA reader(ELX8O); Bio-tek instru- ment)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성한 E1G-HRP 의 농도는 anti-ElG와 최대 반응성을 나타내면서 적정한 O.D가를 보여주는 최대 희석비로 결정하였다. 경쟁적 ELISA를 위한 항체가의 측정은 여러 농도로 조정된 anti-ElG 항체를 coating 후에 ElG-HRP(><200) conjugate 단독 혹은 1 Hg/ml의 E1S를 첨가한 후 그 반응성과 경쟁성을 함께 고려하여 결정하였다.
- V)를 산줄함으로 결정하였다. 회수율 조사는 PBS 에 각각 200, 800 pg 및 3000 ng/well로 E1S를 첨가 후 assay 결과 얻은 E1S의 함량을 측정하여 기대치와 측정치에 대한 bias(%)으로 표시하였다 (Table 2). Intra-assay에 대한 실험 결과 E1S 정량을 위한 범위인 156.
대상 데이터
- E1G에 대한 항체는 이스라엘 와이즈만 연구소의 Dr. Kohen으로부터 기증 받은 단일 클론 항체를 사용하였다. 기증 받은 항체의 종류는 clone 8A3(rat IgGa2), done 3- Fll(rat I#G1) 및 deme 155(mouse IgG2b)였다(Barnard 등, 1989).
- EIS, E1G, bovine serum albumin(BSA), horseradish- peroxidase(HRP), dimethyl sulfoxide(DMSO 78.13 MW) 는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였고' 1-eth- yl-3-[3-diinethylaininopropyl]carbodiimide hydrodiloride (ECD), N-hydroxy-sulfosuccinimide(Nffi), 2-mercaptoe- thanol 및 단백질 정량을 위한 BCA kit는 Thermo Sci- entific(Fair Lawn, NJ, USA)에서 구입하였다. Sephacryl S-400 High Resolution 의 gel-filteration columne GE Healthca(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다.
- Louis, USA)에서 구입하였고' 1-eth- yl-3-[3-diinethylaininopropyl]carbodiimide hydrodiloride (ECD), N-hydroxy-sulfosuccinimide(Nffi), 2-mercaptoe- thanol 및 단백질 정량을 위한 BCA kit는 Thermo Sci- entific(Fair Lawn, NJ, USA)에서 구입하였다. Sephacryl S-400 High Resolution 의 gel-filteration columne GE Healthca(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다.
- 돼지 뇨 중의 E1S의 함량 분석을 위한 표준물질의 제조는 PBS 완충 용액으로 50배 희석된 수퇘지 오줌을 이용하는 internal standard를 사용하였다. 임신 돼지 및 비임신 돼지의 오줌은 각각 PBS로 50배 희석하여 분석하였다.
데이터처리
- 실험에 적용한 E1S의 농도는 표준 곡선의 정량을 위한 범위에서 임의적으로 비교적 높은 농도인 20 ng/ml, 중간농도인 10 ng/μ1 및 5 ng/pl, 그리고 비교적 낮은 농도인 1 ng/ul의 4가지 농도를 정하여 실시하였다. 반복 실험 후 본 assay system의 재현성은 각 농도에 대한 실험결과를 토대로 coeffident va- riation(C.V.) 값은 표준편차를 평균치로 나눈 백분율(%) 로 결정하였고, 회수율은 이미 지정되어 알고 있는 표준물질(기대치)에 대한 실재 측정치를 백분율로 그 차이 (bias %)로 표시하였다(Kim 등, 1982).
이론/모형
- 3). 이 결과는 done 155 항체가 E1S의 정량을 위한 heterologous ELISA 분석법에 이용할 수 있는 가장 적절한 항체임을 보여 주었고(Tagawa 등, 2000) 이 항체를 이용하여 E1S 측정을 위한 ELISA 표준 적정 곡선을 작성하였다. Fig.
성능/효과
- E1S를 정량할 수 있는 경쟁적 ELISA법의 정량 범위는 약 0.15-20 rml이고, 반복성 및 회수율 조사를 통한 정확도 실험에서도 bias가 10%를 넘기는 경우가 거의 없을 만큼 표준 적정 곡선과 그 정량법이 안정되어 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서 작성된 표준곡선에 대입하여비임신뇨 및 임신뇨를 이용한 E1S의 양을 정량하였고, 그 결과를 Fig.
- 그러나 가급적 같은 조건을 사용하기 위하여 모든 임신 진단 조사에서는 50배 희석된 오줌을 사용하였다. PBS로 50배 회석된 실제 돼지 오줌에 표준물질인 E1S를 희석한 후 본 연구의 heterologous ELISA법에 의한 E1S 의 표준곡선에서 검출 한계를 조사한 결과, 약 0.15 ng/ml 인 결과를 보였다. 본 면역 분석 방법의 의한 E1S의 검출한계 농도인 0.
- 따라서 이러한 기존 연구 결과는 본 연구의 heterologous ELISA 분석에 의한 결과인 40 ng/ml와 거의 일치하는 결과로 사료되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발된 E1G와 교차 반웅을 하는 항체를 이용한 heterologous ELISA 방법으로 돼지의 오줌 속에 존재하는 E1S를 측정함으로써 임신과 비임신을 구별할 수 있음을 확인하였다. 본 실험 결과는 아직 국내에서 이러한 방법으로 시도된 사례가 없는 처음 시도된 방법으로 향후 다른 비방사성 면역 분석법 개발이나 kit 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 inter-assay는 총 6회에 걸쳐서 측정하였으며, 실험에 적용한 E1S의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다. 그 결과 CV 값은 실험에 적용한 함량인 3 ng/ml, 800 및 200 pg/ml의 모든 경우에서 10% 이내로 나타났다. 따라서 본 방법의 반복성 및 회수율에서 매우 우수한 결과를 나타내어 정확도에서 충분히 E1S의 정량을 위한 가능한 분석법으로 평가되었다(Kim 등, 1982; Kohen 등, 1981).
- 따라서 각 항체별로 E1G와 E1S에 대한 경쟁 반응을 보기 위하여, anti-ElG 항체가 coating된 plate의 각 well에 E1S-HRP 및 625 pg~10 ng/ml 농도로 조정된 E1S 및 E1G를 첨가하여 경쟁반응을 시켜 보았다. 그 결과 done 3F11과 clone 8A3의 경우는 E1S와의 교차 반응도가 각각 1.8% 및 18.6%인 결과를 보였으며, done 155 의 경우는 E1S와의 교차 반응이 약 91.3%인 결과를 보였다(Fig. 3). 이 결과는 done 155 항체가 E1S의 정량을 위한 heterologous ELISA 분석법에 이용할 수 있는 가장 적절한 항체임을 보여 주었고(Tagawa 등, 2000) 이 항체를 이용하여 E1S 측정을 위한 ELISA 표준 적정 곡선을 작성하였다.
- 이 결과에 따라 단일 클론 clone 155 항체를 이용하여 경쟁적 heterologous ELISA법에 의한 E1S의 표준 곡선을 작성하였고, 분석법의 정확성을 조사하기 위하여 반복성 및 회수율을 조사하였다. 그 결과, 본 방법은 반복성 및 회수율에서 모두 10% 이내의 안정된 결과를 보이므로써(Table 1, 2) 매우 안정된 방법임을 확인하였다(Kim 등, 1982; Park 등, 1996).
- 따라서 합성한 E1GHRP의 적정 농도를 결정하기 위하여 항체가 coating(5 ug/well) 된 ELISA plate에 여러 농도의 E1G-HRP conjugate를 첨가하여 반응시켰다. 그 결과, 약 200배까지의 El&HRP의 첨가는 최고의 흡광도를 유지하였고, 400배 이하의 희석 비율부터 흡광도가 감소하는 농도 의존적인 경향을 보였다. 따라서 E1S에 대한 경쟁적 ELISA를 위한 E1S-HRP conjugate의 희석농도는 표준 곡선의 감도 및 비 특이성 반응(non-specific binding; NSB) 등을 고려하여 200배로 결정하였다(Fig.
- 5 ng/ml)으로 하여 임신과 비임신의 여부를 판단하였다. 따라서 0.15 ng/ml의 감도를 가진 본 연구 결과는 실질적으로 돼지 농가에서 임신 및 비임신을 판단함에 있어 충분하게 적용될 수 있는 방법으로 판단된다. 본 연구 결과와 직접 비교할 수 있는 돼지 오줌 중의 E1S에 대한 기존 논문으로 Atkinson 둥(1987)은 수태한 돼지의 오줌의 E1S의 농도는 혈장 농도의 20~100배 정도 높다는 보고를 하였고, Wellenberg 등(1989)이 radio immunoassay 법으로 보고한 임신 돼지의 오줌 중의 E1S 농도는 50 ng/ml이라고 발표하였다.
- 한편, 임신뇨의 경우, 9개의 시료는 48 ng~ 100 rml 사이를, 8개의 시료는 100 ng/ml~180 ng/ ml 사이인 결과를 보였으며, 1개의 시료에서는 25 ng/ml인 결과를 보여 비임신뇨와의 구별이 어려웠다. 따라서 돼지에서 임신과 비임신을 구별할 수 있는 뇨의 E1S 농도는 약 40 ng/mT인 결과를 보였고, 이 결과는 본 ELISA 방법이 약 95%의 정확성을 가지고 임신 및 비임신을 진단할 수 있는 결과로 사료되었다(Wellenberg 등, 1989; Almond 등, 1985).
- 본 연구 결과와 직접 비교할 수 있는 돼지 오줌 중의 E1S에 대한 기존 논문으로 Atkinson 둥(1987)은 수태한 돼지의 오줌의 E1S의 농도는 혈장 농도의 20~100배 정도 높다는 보고를 하였고, Wellenberg 등(1989)이 radio immunoassay 법으로 보고한 임신 돼지의 오줌 중의 E1S 농도는 50 ng/ml이라고 발표하였다. 따라서 이러한 기존 연구 결과는 본 연구의 heterologous ELISA 분석에 의한 결과인 40 ng/ml와 거의 일치하는 결과로 사료되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발된 E1G와 교차 반웅을 하는 항체를 이용한 heterologous ELISA 방법으로 돼지의 오줌 속에 존재하는 E1S를 측정함으로써 임신과 비임신을 구별할 수 있음을 확인하였다.
- 15 ng/ml 인 결과를 보였다. 본 면역 분석 방법의 의한 E1S의 검출한계 농도인 0.15 ng/mle 이미 개발되어 실용화된 방사선 동위 원소법 (Gaustad-Aas 등, 2002)의 0.01 ng/ml보다는 낮았으나, 앞서 보고된 El%] 대한 rabbit-antiserums 이용한 homogeneous E1A의 감도인 0.3 ng/ml(Stefanakis 등, 2000)보다 다소 우수한 감도를 보였다. E1S의 분석을 통하여 임신 진단법 개발에 대한 이전의 연구는 주로 혈청 E1S의 농도를 즉정하는 것이었는데 Hattersley 둥 (1980)은 수태 후 26~29일된 임신 돼지 혈청의 E1S의 농도는 2.
- 성공적인 heterologous ELISA 분석을 위한 방법으로 가장 중요한 것은 항체의 교차 반응이 가장 중요한 요인이 된다(Ta- gawa 등, 2000). 본 연구에서 사용한 세 가지 항체 즉, an- ti-ElG에 대한 단일 클론 항체인 clone 8A3, 3F11, 155를 이용하여 E1S와 교차 반응을 조사한 결과 clone 155의 경우 우수한 교차 반응을 보여 E1S의 분석에 가장 적합한 항체로 조사되었다. 이 결과에 따라 단일 클론 clone 155 항체를 이용하여 경쟁적 heterologous ELISA법에 의한 E1S의 표준 곡선을 작성하였고, 분석법의 정확성을 조사하기 위하여 반복성 및 회수율을 조사하였다.
- 분석을 위한 각 함량별 시료는 각각 10개씩 측정하였고, E1-3 정량을 위한 표준곡선에 적용하여 나온 결과를 Table 2에 제시하였다. 세 가지 농도 E1S에 대한 intra-assay의 결과에서 CV 값은 8.50~9.67%로 모두 10% 이내에 들었고, bias도 -4.5 %, +5.6% 그리고 +7.2%를 보임으로써 비교적 우수한 결과를 나타냈다. 또한 inter-assay는 총 6회에 걸쳐서 측정하였으며, 실험에 적용한 E1S의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다.
- 5에 제시하였다. 조사한 결과, 비임신뇨의 경우 6개의 시료는 표준 곡선의 검줄 한계인 156 pg/ ml 이하의 결과를 보였고, 13개의 시료는 8.4-30 I/ml인 결과를 보였다. 한편, 임신뇨의 경우, 9개의 시료는 48 ng~ 100 rml 사이를, 8개의 시료는 100 ng/ml~180 ng/ ml 사이인 결과를 보였으며, 1개의 시료에서는 25 ng/ml인 결과를 보여 비임신뇨와의 구별이 어려웠다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에서 개발된 E1G와 교차 반웅을 하는 항체를 이용한 heterologous ELISA 방법으로 돼지의 오줌 속에 존재하는 E1S를 측정함으로써 임신과 비임신을 구별할 수 있음을 확인하였다. 본 실험 결과는 아직 국내에서 이러한 방법으로 시도된 사례가 없는 처음 시도된 방법으로 향후 다른 비방사성 면역 분석법 개발이나 kit 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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