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문제 정의
- 따라서, 본 연구는, Antioxidant로 알려져 있는 성분인 resveratrol의 dimer, trimer, tetramer를 함유하고 있는 것으로 알려져 있는 원료 중 현재까지 많은 연구가 진행되지 않은, 골담초를 추출하여 세포 내 melanogenesis inhibition assay와 tyrosinase inhibition assay를 통해 미백 효능을 확인하고, 이러한 골담초를 발효한 후, 피부 효능 변화를 확인하여 미백 효능 화장품 소재로서 적용 가능성을 보고하고자 한다.
- 이미 다양한 연구를 통해, 골담초 내에 존재하는 다양한 resveratrol oligomer가 알려져 있으며[16], Park 등의 연구 결과[17]에 의하면, 골담초 추출물의 아질산염 소거능과 전자공여능이 있음이 보고되었다. 따라서, 본 연구에서 확인된 미백 효능에 대하여 발효여부에 따른 유효 성분의 변화 유무를 확인하기 위하여 골담초 내에 함유되어 있는 것으로 보고되어 있는 resveratrol의 함량을 확인하였다. HPLC 함량 분석 결과 표준품의 정량 곡선은 0.
- 본 연구는, 최근 천연 추출물에 대한 피부 및 인체 효능에 대한 관심이 고조되면서, 천연 추출물 제조 시 인체에 유해한 유기용매를 사용한다는 문제점을 해결하여 비자극적이고, 피부 질환 유발에 영향을 주지 않는 원료를 개발하고, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 항산화 효과 및 피부 미백 효과를 나타내는 화장품 천연 원료로서 골담초 발효 추출물을 적용할 수 있는지에 대한 효능 실험을 수행하였다. 골담초 추출물에 대한 항산화 효능은 이미 보고된 바 있으나, 이를 효모를 통해 발효한 골담초 추출물의 항산화 효능이 증가하였으며, 멜라닌 생성 억제 효능 실험 결과 농도 의존적으로 그 효능이 상승하였고, 양성 대조군으로 처리한 농도의 arbutin과 유사한 효능의 멜라닌 생성 억제 효능을 나타냈다.
제안 방법
- 1 µm pore size의 paper filter를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 회전감압농축기로 용매를 모두 휘발시킨 후, 최종적으로 골담초 발효 추출물을 회수하였다.
- 2.2와 같은 중량의 골담초를 건조 및 세절한 후, 추출 용매로 70 % ethanol을 넣어 골담초 추출물이 5 wt%가 되도록 하였다. 이를 골담초 발효 추출물과 같은 방법으로 추출, 여과하여 최종 골담초 추출물을 제조하였다.
- cells/mL의 농도로 접종하고 배양한 후, 골담초 발효 추출물 및 골담초 추출물을 무혈청 배지를 이용하여 각각 10, 20, 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 희석한 후, 24 h 동안 배양하였다. MTT 시약을 이용하여 세포의 생존율을 평가하였으며 대조군으로는 추출물을 함유하지 않은 무혈청 배지를 사용하였다.
- 골담초 발효 추출물에 대한 자유라디칼 소거능을 DPPH 방법을 변형하여 측정하였다[9]. 간단히 기술하면, 골담초 발효 추출물과 골담초 추출물 및 BHT를 24 well plate의 각 well에 500 uL씩 넣은 후, 메탄올에 0.
- 골담초 발효 추출물은 골담초 추출물에 대비하여 미생물의 발효를 통해 당 및 중합체의 형태로 존재하던 성분이 발효과정에 의해 분해되면서 나타날 수 있는 유효 성분의 변화 유무를 확인하기 위하여 골담초 내에 함유되어 있는 것으로 보고되어 있는 resveratrol을 HPLC 기기를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 Agilent Technologies의 1200 series HPLC, 칼럼은 Agilent Eclipse plus C18 (5 µm, 4.
- 골담초 발효 추출물의 세포 생존율을 측정하기 위하여 쥐 유래의 멜라닌 세포(mouse melanocyte)를 96 well plate에 105 cells/mL의 농도로 접종하고 배양한 후, 골담초 발효 추출물 및 골담초 추출물을 무혈청 배지를 이용하여 각각 10, 20, 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 희석한 후, 24 h 동안 배양하였다.
- 골담초 발효 추출물의 피부 자극 유발 여부를 평가하기 위하여 인체 첩포 시험(Human patch test)을 통하여 인체에 대한 1차 자극 시험 및 누적 자극 시험을 수행하였다.
- 누적첩포 시험은 피부 질환 병력이 없는 성인 20명을 대상으로 하여 Finn Chamber에 골담초 발효 추출물 20 µL를 적하시킨 후, 이것을 시험 부위인 양쪽 팔 안쪽에 Scanpor tape로 고정하고 24 h 적용 후 patch를 제거시키고, 24 h 경과한 후, 동일한 부위에 동일한 방법으로 총 9번의 반복적인 적용을 수행하여 피부의 자극 발생 여부를 육안으로 확인하였다.
- cerevisiae KCTC 7913는 접종 24 h 전에 35 ℃에서 YM액체배양하여 준비하였으며, 이를 희석하여 발효의 접종균으로 사용하였다. 발효가 완료된 골담초 발효물에 70 % 에탄올을 5 L를 가하고, 3 h 동안 발효물 내의 유효성분을 추출하였다. 1 µm pore size의 paper filter를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 회전감압농축기로 용매를 모두 휘발시킨 후, 최종적으로 골담초 발효 추출물을 회수하였다.
- 배양된 세포에 골담초 발효 추출물과 골담초 추출물을 적용하기 위하여 혈청과 세포의 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려진 αMSH를 함께 처리하여 10, 50, 100 µg/mL의 농도로 희석하였다.
- 실험군과 대조군에 대한 흡광을 측정 후, DPPH 라디칼 소거 효능을 환산하여 그 결과를 나타내었다.
- 양성 대조군으로 arbutin을 사용하였으며 대조군은 αMSH만 함유된 배지를 처리하였다.
- 2와 같은 중량의 골담초를 건조 및 세절한 후, 추출 용매로 70 % ethanol을 넣어 골담초 추출물이 5 wt%가 되도록 하였다. 이를 골담초 발효 추출물과 같은 방법으로 추출, 여과하여 최종 골담초 추출물을 제조하였다.
대상 데이터
- Finn Chamber (Alpharma AS, Norway)를 사용하였고, 흡광 측정을 위해 ELISA reader (VICTOR3®, PerkinElmer)를 사용하였다.
- S. cerevisiae KCTC 7913는 106 CFU/mL로 희석하여 준비된 골담초에 접종하였다. 미생물이 접종된 골담초는 25 ℃로 온도를 유지하면서 72 h 동안 발효하였다.
- Tyrosine을 기질로 사용하여 1.5 mM의 tyrosine 용액과 100 U/mL tyrosinase 용액을 준비하였다. 반응의 완충 용액으로 0.
- 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 CTFA 가이드라인(The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association. Inc. Washington, D.C., 20036, 1991)에 따라 실시하였다. Finn chamber에 시료 20 µL를 적하시킨 후, 이를 시험 부위인 인체의 팔 한쪽에 첩포하고 테이프로 고정시켰다.
- 건조된 골담초는 강원도 춘천시 대광 약업사로부터 구입하여 분쇄하여 분말화한 후, 300 g의 골담초 분말에 미생물의 생장을 위하여 1.2 L의 YM 액체 배지를 첨가하였다. 상온에서 2 h 정치하여 골담초 분말에 액체배지가 충분히 함습될 수 있도록 하였다.
- 골담초 발효 추출물을 제조하는 과정에서 사용된 미생물은 Saccharomyces cerevisiae KCTC 7913으로 한국 생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다. 발효를 위한 미생물 배양을 위하여 사용된 배지 조성으로 yeast extract (acumedia, USA) malt extract (merck, Germany), Bacto™peptone (BD, France), dextrose anhydrous (Junsei, Japan), agar (Junsei, Japan)를 사용하였다.
- 반응이 종료된 plate는 490 nm에서 흡광을 측정하였다. 대조군으로는 0.1 M의 인산염 완충 용액을 사용하였다.
- 5 mM의 tyrosine 용액과 100 U/mL tyrosinase 용액을 준비하였다. 반응의 완충 용액으로 0.1 M의 인산염 완충용액을 사용하였다. 96 well plate에 준비한 tyrosine 용액을 100 µL씩 넣고 골담초 발효 추출물과 골담초 추출물, kojic acid를 시료로 사용하였다.
- 발효를 위한 미생물 배양을 위하여 사용된 배지 조성으로 yeast extract (acumedia, USA) malt extract (merck, Germany), Bacto™peptone (BD, France), dextrose anhydrous (Junsei, Japan), agar (Junsei, Japan)를 사용하였다.
- 미생물이 접종된 골담초는 25 ℃로 온도를 유지하면서 72 h 동안 발효하였다. 발효에 사용한 미생물인 S. cerevisiae KCTC 7913는 접종 24 h 전에 35 ℃에서 YM액체배양하여 준비하였으며, 이를 희석하여 발효의 접종균으로 사용하였다. 발효가 완료된 골담초 발효물에 70 % 에탄올을 5 L를 가하고, 3 h 동안 발효물 내의 유효성분을 추출하였다.
- 분석조건은 Agilent Technologies의 1200 series HPLC, 칼럼은 Agilent Eclipse plus C18 (5 µm, 4.6 mm id × 250 mm), 검출기는 UV detector, 파장은 306 nm로 하였다.
- 골담초 발효 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과 측정은 식품의약품안전청에 고시된 “기능성 화장품 효능 평가법”가이드라인을 참고하였다. 실험에 사용된 세포주는 쥐 유래의 멜라닌세포를 이용하였으며, 세포를 6 well plate에 105 cells/mL의 농도로 접종하여 24 h 동안 37 ℃의 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 배양된 세포에 골담초 발효 추출물과 골담초 추출물을 적용하기 위하여 혈청과 세포의 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려진 αMSH를 함께 처리하여 10, 50, 100 µg/mL의 농도로 희석하였다.
- 실험에 사용된 세포주인 B16F10(Melanoma mouse, 58078645)는 American type culture collection (ATCC, USA)에서 구입하였으며, 세포 배양을 위해 Dulbecco's modified Egale's medium (DMEM, HyClone®, USA), fetal bovine serum (FBS, HyClone®, USA), antibiotics (penicillin 100 unit/mL, streptomycin 100 unit/mL, HyClone®, USA)를 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 세포주인 B16F10(Melanoma mouse, 58078645)는 American type culture collection (ATCC, USA)에서 구입하였으며, 세포 배양을 위해 Dulbecco's modified Egale's medium (DMEM, HyClone®, USA), fetal bovine serum (FBS, HyClone®, USA), antibiotics (penicillin 100 unit/mL, streptomycin 100 unit/mL, HyClone®, USA)를 구입하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 효소는 mushroom tyrosinase(Sigma, USA)를 사용하였다. Finn Chamber (Alpharma AS, Norway)를 사용하였고, 흡광 측정을 위해 ELISA reader (VICTOR3®, PerkinElmer)를 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma, USA), alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH, Sigma, USA), tyrosine (Sigma, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA), butylated hydroxytoluene (BHT, Sigma, USA), arbutin (Sigma, USA), Kojic acid (Sigam, USA), melanin (Sigma, USA)을 사용하였다.
이론/모형
- 골담초 발효 추출물의 tyrosinase 효소 활성 저해 효과 측정 방법은 식품의약품안전청에 고시된 “기능성 화장품 효능 평가법” 가이드라인을 참고하였다.
- 골담초 발효 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과 측정은 식품의약품안전청에 고시된 “기능성 화장품 효능 평가법”가이드라인을 참고하였다.
성능/효과
- 따라서, 본 연구에서 확인된 미백 효능에 대하여 발효여부에 따른 유효 성분의 변화 유무를 확인하기 위하여 골담초 내에 함유되어 있는 것으로 보고되어 있는 resveratrol의 함량을 확인하였다. HPLC 함량 분석 결과 표준품의 정량 곡선은 0.997 이상으로 양호하였다(data not shown). 동일한 기기분석 조건으로 추출물을 3번의 반복실험 결과 Table 1과 같이 나타났다.
- 각각의 추출물을 0.05 wt% 농도로 처리하였을 때, 골담초 추출물은 42.21 %, 골담초 발효 추출물은 83.78 %의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 이는, 골담초 추출물에 비해 골담초 발효 추출물의 항산화 활성이 증가하였음을 의미한다.
- 동일한 기기분석 조건으로 추출물을 3번의 반복실험 결과 Table 1과 같이 나타났다. 골담초 발효 추출물은 골담초 추출물과 비교하여 resveratrol의 추출율이 다소 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 발효 공정을 이용할 경우, 추출물 내의 resveratrol 추출 수율 증가를 가져올 수 있음을 의미한다.
- 골담초 추출물과 발효 추출물에 대한 미백효능 평가를 위해, 쥐 유래의 멜라닌 세포인 B16F10에 농도별로 추출물을 처리한 결과, 골담초 발효 추출물의 경우에는 골담초 추출물에 비하여 동일한 농도를 처리하였을 때, 세포내 멜라닌 생성 억제 효과가 농도별로 약 5 ~ 10 %씩 증가함을 확인 할 수 있었다. 이는 큰 폭의 효능 증가는 아니지만, 위에서 언급한 바와 같이 골담초 추출물의 경우에 세포 독성이 나타나, 보다 안전하고 우수한 미백 효능 소재로 골담초 발효 추출물이 적용 가능할 것으로 사료된다(Figure 4).
- 골담초 추출물과 발효 추출물의 B16F10 멜라닌 세포에 대한 세포 독성을 평가한 결과, 골담초 추출물 50 µg/ mL 이상의 농도에서 대조군(시료무처리군)과 비교하였을 때 농도 의존적으로 세포 독성 또한 증가하였다.
- 본 연구는, 최근 천연 추출물에 대한 피부 및 인체 효능에 대한 관심이 고조되면서, 천연 추출물 제조 시 인체에 유해한 유기용매를 사용한다는 문제점을 해결하여 비자극적이고, 피부 질환 유발에 영향을 주지 않는 원료를 개발하고, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 항산화 효과 및 피부 미백 효과를 나타내는 화장품 천연 원료로서 골담초 발효 추출물을 적용할 수 있는지에 대한 효능 실험을 수행하였다. 골담초 추출물에 대한 항산화 효능은 이미 보고된 바 있으나, 이를 효모를 통해 발효한 골담초 추출물의 항산화 효능이 증가하였으며, 멜라닌 생성 억제 효능 실험 결과 농도 의존적으로 그 효능이 상승하였고, 양성 대조군으로 처리한 농도의 arbutin과 유사한 효능의 멜라닌 생성 억제 효능을 나타냈다. 또한, 멜라닌 생성의 주요한 단백질인 tyrosinase의 활성 억제 효능 실험 결과, 골담초 추출물보다 현저하게 높은 효소 활성 억제 효능이 확인 되었다.
- 골담초 추출물의 경우, 농도별로 희석하여 mushroom tyrosinase 활성 저해 효능을 확인한 결과, 효소 저해 활성이 거의 없거나 미미한 것으로 나타난 반면, 골담초 발효 추출물은 tyrosinase 활성 저해 효능이최대 시험농도인 100 µg/mL의 농도에서 대조군(시료무처리군) 대비 40 %까지 증가하는 것으로 확인되었으며 이는 농도 의존적인 효능을 나타냈다.
- 골담초 추출물의 경우, 농도별로 희석하여 mushroom tyrosinase 활성 저해 효능을 확인한 결과, 효소 저해 활성이 거의 없거나 미미한 것으로 나타난 반면, 골담초 발효 추출물은 tyrosinase 활성 저해 효능이최대 시험농도인 100 µg/mL의 농도에서 대조군(시료무처리군) 대비 40 %까지 증가하는 것으로 확인되었으며 이는 농도 의존적인 효능을 나타냈다. 따라서, 본 실험 결과를 미루어 볼 때, 골담초 발효 추출물은 발효 전의 골담초 추출물 보다 효소 수준에서 피부 미백 효능이 있음을 의미한다(Figure 3).
- 골담초 추출물에 대한 항산화 효능은 이미 보고된 바 있으나, 이를 효모를 통해 발효한 골담초 추출물의 항산화 효능이 증가하였으며, 멜라닌 생성 억제 효능 실험 결과 농도 의존적으로 그 효능이 상승하였고, 양성 대조군으로 처리한 농도의 arbutin과 유사한 효능의 멜라닌 생성 억제 효능을 나타냈다. 또한, 멜라닌 생성의 주요한 단백질인 tyrosinase의 활성 억제 효능 실험 결과, 골담초 추출물보다 현저하게 높은 효소 활성 억제 효능이 확인 되었다. 본 연구자들은 골담초 내에 존재하는 대표적인 항산화 성분인 resveratrol에 따른 영향을 확인하기 위하여 HPLC 기기분석을 수행한 결과, 유효성분인 resveratrol의 함량이 골담초 추출물에 비해 다소 증가함을 확인하였다.
- 또한, 멜라닌 생성의 주요한 단백질인 tyrosinase의 활성 억제 효능 실험 결과, 골담초 추출물보다 현저하게 높은 효소 활성 억제 효능이 확인 되었다. 본 연구자들은 골담초 내에 존재하는 대표적인 항산화 성분인 resveratrol에 따른 영향을 확인하기 위하여 HPLC 기기분석을 수행한 결과, 유효성분인 resveratrol의 함량이 골담초 추출물에 비해 다소 증가함을 확인하였다. 그러나, 이러한 결과가 발효를 통한 resveratrol의 함량을 증가에 기인하는 것인지에 대한 기전 연구는 더 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이는, 골담초 추출물에 비해 골담초 발효 추출물의 항산화 활성이 증가하였음을 의미한다. 양성 대조군으로 사용한 BHT는 0.005 %의 농도에서 97.92 %의 우수한 DPPH 라디칼 소거 효능을 나타났다(Figure 1). 양성대조군으로 사용된 BHT에 비해 다소 효능은 낮으나, BHT의 경우에는 단일 성분임을 감안할 때에 골담초 발효 추출물의 항산화 효능을 통한 원료 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 그러나, 이러한 결과가 발효를 통한 resveratrol의 함량을 증가에 기인하는 것인지에 대한 기전 연구는 더 이루어져야 할 것으로 사료된다. 이러한 골담초 발효 추출물의 항산화 및 미백 효능과 더불어, 피부 자극 임상 실험 결과를 미루어 볼 때, 시료 첩포 부위에 피부 자극이 일어나지 않아 골담초 발효 추출물은 피부에 문제가 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 골담초 발효 추출물의 경우 골담초 추출물에 비해 항산화, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 피부 노화 및 미백 효능 원료로 사용이 가능할 것으로 판단된다.
- 피부 질환 및 기타 질환을 나타내지 않은 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 인체에 대한 피부 자극 시험을 평가한 결과, patch를 첩포하지 않은 부위와 비교하여 골담초 발효 추출물을 처리한 부위에 자극이 유발되지 않았으며 피부에 적용하기에 안전한 소재임을 확인할 수 있었다(Table 2). 또한, 이러한 효능은 단회 첩포 뿐 아니라, 누적 첩포 후, 72 h 후에도 역시 자극 유발을 확인할 수 없었다(Table 3).
후속연구
- 본 연구자들은 골담초 내에 존재하는 대표적인 항산화 성분인 resveratrol에 따른 영향을 확인하기 위하여 HPLC 기기분석을 수행한 결과, 유효성분인 resveratrol의 함량이 골담초 추출물에 비해 다소 증가함을 확인하였다. 그러나, 이러한 결과가 발효를 통한 resveratrol의 함량을 증가에 기인하는 것인지에 대한 기전 연구는 더 이루어져야 할 것으로 사료된다. 이러한 골담초 발효 추출물의 항산화 및 미백 효능과 더불어, 피부 자극 임상 실험 결과를 미루어 볼 때, 시료 첩포 부위에 피부 자극이 일어나지 않아 골담초 발효 추출물은 피부에 문제가 없는 것으로 확인되었다.
- 이러한 골담초 발효 추출물의 항산화 및 미백 효능과 더불어, 피부 자극 임상 실험 결과를 미루어 볼 때, 시료 첩포 부위에 피부 자극이 일어나지 않아 골담초 발효 추출물은 피부에 문제가 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 골담초 발효 추출물의 경우 골담초 추출물에 비해 항산화, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 피부 노화 및 미백 효능 원료로 사용이 가능할 것으로 판단된다.
- 이는, 골담초 추출물과 비교하였을 때, 세포에 독성을 미칠 수 있는 성분이 발효 공정을 통해 저감되었을 것으로 사료된다(Figure 2). 따라서, 발효 공정을 통해 피부 세포에 보다 안전한 소재를 개발 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 92 %의 우수한 DPPH 라디칼 소거 효능을 나타났다(Figure 1). 양성대조군으로 사용된 BHT에 비해 다소 효능은 낮으나, BHT의 경우에는 단일 성분임을 감안할 때에 골담초 발효 추출물의 항산화 효능을 통한 원료 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 골담초 추출물과 발효 추출물에 대한 미백효능 평가를 위해, 쥐 유래의 멜라닌 세포인 B16F10에 농도별로 추출물을 처리한 결과, 골담초 발효 추출물의 경우에는 골담초 추출물에 비하여 동일한 농도를 처리하였을 때, 세포내 멜라닌 생성 억제 효과가 농도별로 약 5 ~ 10 %씩 증가함을 확인 할 수 있었다. 이는 큰 폭의 효능 증가는 아니지만, 위에서 언급한 바와 같이 골담초 추출물의 경우에 세포 독성이 나타나, 보다 안전하고 우수한 미백 효능 소재로 골담초 발효 추출물이 적용 가능할 것으로 사료된다(Figure 4).
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