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문제 정의
- 골다공증은 주로 노화와 깊은 관련이 있는 질환인 까닭에노인, 특히 폐경기 여성에게서 빈번하게 발생된다. 따라서 우리는 폐경에 따른 골다공증 동물모델로 널리 알려진 난소절제 흰쥐 모델을 이용하여 애엽 추출물이 골다공증 예방에 미치는 영향을 알아보았다. 이에 앞서 우리는 애엽 추출물의 유효 투여량과 투여기간을 결정하기 위해 난소절제 흰쥐 모델을 이용한 골다공증 관련 선행연구들을 살펴보았다.
- 본 연구에서 우리는 애엽 추출물이 골대사에 중요한 파골세포의 분화 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 또한 폐경에 의해 유발되는 골다공증 모델로 잘 알려진 난소절제 흰쥐를 이용하여 애엽 추출물이 골대사에 미치는 영향을 확인하였다.
- 따라서 우리는 폐경에 따른 골다공증 동물모델로 널리 알려진 난소절제 흰쥐 모델을 이용하여 애엽 추출물이 골다공증 예방에 미치는 영향을 알아보았다. 이에 앞서 우리는 애엽 추출물의 유효 투여량과 투여기간을 결정하기 위해 난소절제 흰쥐 모델을 이용한 골다공증 관련 선행연구들을 살펴보았다. 그결과 투여량과 투여기간은 연구자에 따라 각기 다르지만, 천연물의 경우 투여량은 500 mg/kg 내외, 투여기간은 12주가 일반적이었다(25-28).
- 파골세포의 증가는 골대사 질환에 매우 중요하게 작용하므로, 애엽 추출물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 알아보았다. 이를 위해 애엽 추출물을 5, 10, 20, 30 μg/mL로 처리하여 3일간 배양한 후, TRAP 양성 다핵세포의 형성을 관찰하였다.
제안 방법
- 1 mm로 선택하여 수행하였다. BMD 값은 XCT Research SA(Stratec, Pforzeim, Germany)를 이용하여 8주 동안 총 4회 측정하였다.
- BMD는 성장판으로부터 2 mm 떨어져 있는 PTM(proximal tibial metaphysic)에서 측정하였고, 하나의 화소 크기를 0.1 mm로 선택하여 수행하였다. BMD 값은 XCT Research SA(Stratec, Pforzeim, Germany)를 이용하여 8주 동안 총 4회 측정하였다.
- 반응이 끝난 세포는 hematoxylin 용액으로 대조 염색하였으며, 한 세포당 핵이 3개 이상인 다핵의 TRAP 양성세포를 파골세포로 간주하였다. 각 well당 형성된 다핵 파골세포의 개수를 측정하여 비교하였다.
- 다음으로 애엽 추출물이 파골세포의 TRAP 활성도에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 애엽 추출물 5, 10, 20, 30 μg/mL 처리군에서의 TRAP 활성도는 대조군과 비교하여각각 91.
- 따라서 인산칼슘으로 피막된 OAAS™ plate를 사용하여 파골세포의 뼈 재흡수 억제효과를 확인하였다.
- 본 연구에서 우리는 애엽 추출물이 골대사에 중요한 파골세포의 분화 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 또한 폐경에 의해 유발되는 골다공증 모델로 잘 알려진 난소절제 흰쥐를 이용하여 애엽 추출물이 골대사에 미치는 영향을 확인하였다.
- 마지막으로 애엽 추출물이 골대사, 나아가 골다공증에 미치는 영향을 알아보았다. 이를 위해 난소를 절제한 흰쥐에 애엽 추출물을 8주간 매일 투여하면서 총 4회(초기, 2, 4, 8주)에 걸쳐 proximal tibial metaphysic(PTM)의 골밀도(BMD)를 측정하였다.
- 실험군은 총 4개 군으로써, 난소 절제를 하지 않은 군(normal; n=6), 난소 절제 후 생리식염수를 투여한 군(OVX-control; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을 400 mg/kg을 투여한 군(APE400 mg/kg; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을800 mg/kg을 투여한 군(APE800 mg/kg; n=6)으로 나누었다. 모든 실험군에는 일반 식이와 멸균수를 무제한으로 제공하였으며, 투여는 금속제 경구용 존대를 이용하여 매일 1회씩 8주간 실시하였다.
- 물모델을 이용하여 애엽 추출물이 골대사에 미치는 영향을 살펴보았다. 애엽 추출물이 파골세포의 분화 및 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스 골수유래 전구세포에M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도한 후, TRAP 염색법을 실시하고 TRAP 활성도를 측정하였다.
- , Cheonan, Korea)에서 애엽 추출물이 농도별(0, 5, 10, 20, 30 μg/mL)로 포함된 배양액으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 5% sodium hypochlorite(Sigma) 용액을 5분간 처리하여 세포를 떼어낸 다음, 흡수된 면적을 image-analyzing software, Image Pro PlusTM(version 3.0, Media Cybernetics Inc., MD, USA) 프로그램을 이용하여 측정하였다.
- 따라서 우리는 애엽 추출물의 투여량을 일반적인 용량인 400 mg/kg과 고용량인 800 mg/kg로 정하였으며, 투여기간은 대부분의 연구에서 6주가지난 시점부터는 효과에 차이가 있는 것을 감안하여 8주로결정하였다. 본 연구를 위해 우리는 흰쥐의 난소를 절제한후, 8주 동안 총 4회에 걸쳐 흰쥐 PTM의 BMD를 측정하였다. PTM의 BMD 측정은 항골다공증 약물의 효능을 검증하는데 매우 효과적인 방법 중 하나로 알려져 있으며(31), 본연구에서 사용된 pQCT(peripheral quantitative computed tomography) 시스템은 동물 골밀도의 용적을 측정하는데 적합한 방법으로써 사용되고 있다(32,33).
- 본 연구에서 우리는 30% 에탄올을 이용하여 애엽으로부터 추출물을 얻은 다음, 먼저 파골세포 분화 및 활성 억제효과를 알아보았다. 이를 위해 생쥐의 골수세포를 M-CSF와 RANKL이 함유된 배지에서 파골전구세포로 배양하였고, TRAP 양성이면서 3개 이상의 핵을 갖는 다핵세포만을 파골세포로 간주하여 연구를 진행하였다.
- 골다공증 동물모델 제작을 위해 Sprague-Dawley계(12주령) 암컷 흰쥐를 총 24마리 구입하여 양쪽 난소를 절제하였다. 실험군은 총 4개 군으로써, 난소 절제를 하지 않은 군(normal; n=6), 난소 절제 후 생리식염수를 투여한 군(OVX-control; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을 400 mg/kg을 투여한 군(APE400 mg/kg; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을800 mg/kg을 투여한 군(APE800 mg/kg; n=6)으로 나누었다. 모든 실험군에는 일반 식이와 멸균수를 무제한으로 제공하였으며, 투여는 금속제 경구용 존대를 이용하여 매일 1회씩 8주간 실시하였다.
- 애엽 추출물이 파골세포에 의한 골흡수에 미치는 영향을알아보기 위하여 파골세포를 인산칼슘이 피막된 OAAS™plate에서 애엽 추출물을 처리한 후, 24시간 배양하였다.
- 물모델을 이용하여 애엽 추출물이 골대사에 미치는 영향을 살펴보았다. 애엽 추출물이 파골세포의 분화 및 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스 골수유래 전구세포에M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도한 후, TRAP 염색법을 실시하고 TRAP 활성도를 측정하였다. 그 결과 애엽 추출물은 TRAP 양성 다핵세포의 형성과TRAP 활성을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 파골세포의 골흡수 또한 애엽 추출물의 최고농도(30 μg/mL) 처리 시약 90%까지 억제되는 것을 확인하였다.
- 마지막으로 애엽 추출물이 골대사, 나아가 골다공증에 미치는 영향을 알아보았다. 이를 위해 난소를 절제한 흰쥐에 애엽 추출물을 8주간 매일 투여하면서 총 4회(초기, 2, 4, 8주)에 걸쳐 proximal tibial metaphysic(PTM)의 골밀도(BMD)를 측정하였다.
- 본 연구에서 우리는 30% 에탄올을 이용하여 애엽으로부터 추출물을 얻은 다음, 먼저 파골세포 분화 및 활성 억제효과를 알아보았다. 이를 위해 생쥐의 골수세포를 M-CSF와 RANKL이 함유된 배지에서 파골전구세포로 배양하였고, TRAP 양성이면서 3개 이상의 핵을 갖는 다핵세포만을 파골세포로 간주하여 연구를 진행하였다. 그 결과, 애엽 추출물이 TRAP 양성 다핵세포수를 감소시킴으로써 파골세포의 분화를 억제하는 것을 확인하였으며(Fig.
- 이를 위해 애엽 추출물을 5, 10, 20, 30 μg/mL로 처리하여 3일간 배양한 후, TRAP 양성 다핵세포의 형성을 관찰하였다.
- 추가 배양 후, 부착세포를 회수하여 1×105 cells/well이 되도록 분주하고 M-CSF(30 ng/mL), RANKL (50 ng/mL; Peprotech)과 함께 애엽 추출물을 농도별(0, 5, 10, 20, 30 μg/mL)로 처리하여 3일간 배양하였다.
- 파골세포의 특이한 표지자로 알려진 TRAP 활성도를 측정하였다. 이를 위해 96 well plate에서 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고, 10% 포르말린으로 고정한 다음, substrate solution(1.
- 파골세포의 활성을 알아보기 위하여 파골세포를 인산칼슘으로 피막된 OAASTM plate(Oscotec Inc., Cheonan, Korea)에서 애엽 추출물이 농도별(0, 5, 10, 20, 30 μg/mL)로 포함된 배양액으로 24시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 5주령 ICR 생쥐의 대퇴골과 경골을 무균적으로 분리하여 양 끝을 절단하고 뼈속질 공간을 주사기로 수세하여 골수세포를 수집하였다. 수집된 골수세포는 10% FBS와 M-CSF (30 ng/mL, Peprotech, NJ, USA)가 첨가된 α-minimum essential medium(α-MEM, Gibco BRL, NY, USA) 배지에서24시간 동안 배양한 후, 미부착세포를 수집하여 2일간 추가 배양하였다.
- 골다공증 동물모델 제작을 위해 Sprague-Dawley계(12주령) 암컷 흰쥐를 총 24마리 구입하여 양쪽 난소를 절제하였다. 실험군은 총 4개 군으로써, 난소 절제를 하지 않은 군(normal; n=6), 난소 절제 후 생리식염수를 투여한 군(OVX-control; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을 400 mg/kg을 투여한 군(APE400 mg/kg; n=6), 난소 절제 후 애엽 추출물을800 mg/kg을 투여한 군(APE800 mg/kg; n=6)으로 나누었다.
- 본 연구에 사용된 애엽은 중국산으로써 경기도 부천시에 소재한 대영제약에서 구입하였다. 증류수로 2번 세척된 애엽 100 g에 30% 에탄올 500 mL를 첨가하여 상온에서 2시간동안 2회 추출한 후 농축, 동결 건조시켜 11.
- 수집된 골수세포는 10% FBS와 M-CSF (30 ng/mL, Peprotech, NJ, USA)가 첨가된 α-minimum essential medium(α-MEM, Gibco BRL, NY, USA) 배지에서24시간 동안 배양한 후, 미부착세포를 수집하여 2일간 추가 배양하였다.
데이터처리
- Values with asterisk are significantly different at p<0.01 by Student’s t-test.
- 본 연구의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 세포실험의 통계처리는 Student’s t-test 방법을 사용하였고, 동물실험의 통계처리는 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey’s multiple comparison test로 검정하였다.
- 세포실험의 통계처리는 Student’s t-test 방법을 사용하였고, 동물실험의 통계처리는 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey’s multiple comparison test로 검정하였다.
성능/효과
- 그 결과 대조군에서는 375개의 TRAP 양성 다핵세포가 관찰된 반면, 애엽 추출물 5, 10, 20, 30 μg/mL 처리군에서는 각각 256, 66, 51, 36개의 TRAP 양성 다핵세포가 관찰되었다(Fig. 1).
- 그 결과 애엽 추출물 5, 10, 20, 30 μg/mL 처리군에서의 TRAP 활성도는 대조군과 비교하여각각 91.60, 76.69, 55.07, 44.40%로 나타났으며, 이 또한 애엽추출물 농도에 의존적임을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 그 결과 애엽 추출물은 TRAP 양성 다핵세포의 형성과TRAP 활성을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 파골세포의 골흡수 또한 애엽 추출물의 최고농도(30 μg/mL) 처리 시약 90%까지 억제되는 것을 확인하였다.
- 그 결과, 애엽 추출물이 5, 10, 20, 30 μg/mL 처리된 군은 대조군에 비하여 각각 96.06, 72.49, 16.34, 9.49%의 골흡수율을 나타내었다(Fig. 3).
- 이를 위해 생쥐의 골수세포를 M-CSF와 RANKL이 함유된 배지에서 파골전구세포로 배양하였고, TRAP 양성이면서 3개 이상의 핵을 갖는 다핵세포만을 파골세포로 간주하여 연구를 진행하였다. 그 결과, 애엽 추출물이 TRAP 양성 다핵세포수를 감소시킴으로써 파골세포의 분화를 억제하는 것을 확인하였으며(Fig. 1), 파골세포의 TRAP 활성 또한 애엽 추출물에 의해 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 2).
- 따라서 인산칼슘으로 피막된 OAAS™ plate를 사용하여 파골세포의 뼈 재흡수 억제효과를 확인하였다. 그결과, 파골세포에 의한 뼈 재흡수 영역이 애엽 추출물에 의 해 강하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 하지만 Shirke 등(29,30)은 강남콩(P haseolus vulgaris) 메탄올 추출물과 커민(Cuminum cyminum) 메탄올 추출물을 1,000 mg/kg 용량으로 10주간 매일 경구투여 했을 시, 난소절제 흰쥐 모델에서 어떠한 부작용 없이 골밀도가 증가되는 것을 확인함으로써 골다공증예방효과가 있음을 보고하였다. 따라서 우리는 애엽 추출물의 투여량을 일반적인 용량인 400 mg/kg과 고용량인 800 mg/kg로 정하였으며, 투여기간은 대부분의 연구에서 6주가지난 시점부터는 효과에 차이가 있는 것을 감안하여 8주로결정하였다. 본 연구를 위해 우리는 흰쥐의 난소를 절제한후, 8주 동안 총 4회에 걸쳐 흰쥐 PTM의 BMD를 측정하였다.
- 난소절제 혹은 애엽 추출물 투여에 따른 골밀도 변화를 알아보기 위하여 BMD를 측정한 결과, 난소절제에 따른 골밀도는 2주부터조금씩 차이를 보이다가 4주 무렵에서는 확연한 차이를 있음을 알 수 있었다. 또한 애엽 추출물 투여에 따른 골밀도변화는 난소절제 직후엔 큰 차이를 보이지 않다가 8주가 경과한 시점에서는 많은 차이가 있음을 확인하였다. 이는 애엽추출물이 난소절제에 따른 골소실을 막아줌으로써 폐경기여성들에게서 빈번하게 발생하는 골다공증 예방에 효과적인 물질임을 시사한다고 할 수 있다(Table.
- 이상의 결과에서 애엽 추출물은 파골세포의 분화 및 활성억제를 통하여 골 흡수를 저해하는 것으로 나타났다. 또한 애엽 추출물이 난소를 절제한 흰쥐에서 골밀도 손실을 막아주는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 비록 애엽 추출물의 활성성분은 아직 밝혀지지는 않았지만, 이는 애엽이 에스트로겐 분비감소로 인하여 급격한 골 손실이 나타나는 폐경기여성의 골다공증 예방에 효과가 있는 기능성식품 후보로 사용되어도 손색이 없을 것으로 사료된다.
- 반면에 애엽 추출물 400 및 800 mg/kg 투여군의 8주 경과 뒤의 BMD 값은 각각 222.75±14.18, 235.07±8.46mg/cm2로, 대조군에 비해 적게 감소되는 것을 알 수 있었다(Table 1).
- 이상의 결과에서 애엽 추출물은 파골세포의 분화 및 활성억제를 통하여 골 흡수를 저해하는 것으로 나타났다. 또한 애엽 추출물이 난소를 절제한 흰쥐에서 골밀도 손실을 막아주는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 난소절제 동물모델을 이용한 실험에서도 애엽 추출물이 난소절제에 따른 급격한 골밀도 감소를 막아준다는 사실을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때, 애엽 추출물이 에스트로겐 분비감소로 인하여 급격한 골 손실이 나타나는 폐경기 여성의 골다공증 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
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