선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 다양한 기능적 특성을 가지는 단백질 가수분해물의 개발을 위해 casein, 대두분리단백(ISP), wheat gluten, gelatin 등 4종류의 대표적인 동물성 및 식물성 단백질을 대상으로 alcalase, bromelain, neutrase, papain, trypsin 등 상업적으로 활용되고 있는 단백질 가수분해 효소를 이용하여 각 단백질 종류에 따른 효소들의 가수분해 특성을 조사하고, 단백질 기질과 효소의 조합에 의해 생성된 가수분해물의 용해성과 쓴맛에 대해 비교하였다.
제안 방법
- 5로 조절하였다. 180분 동안 효소 가수분해 반응을 진행시켜 각 단백질에 대해 시간에 따른 효소의 가수분해도를 확인하였으며, 시간을 조정하여 각 단백질의 가수분해도(degree of hydrolysis, DH)를 10%로 조절하여 가수분해물을 제조하였다. 각 가수분해물은 2,000×g에서 20분간 원심분리 하여 그 상등액을 실험에 이용하였다(26,27).
- Casein, 분리대두 단백(ISP), wheat gluten, gelatin 등 4종류의 단백질에서 각 단백질 가수분해효소(alcalase, bromelain, neutrase, papain, trypsin)의 종류에 따른 가수분해도를 반응시간의 경과에 따라 비교하였다(Fig. 1). 대부분의 가수분해 반응은 초기 30분 이내에 빠른 가수분해 속도를 나타내었으며, 그 후 완만하고 계속적인 가수분해 양상을 나타내었다.
- Qunine-HCl의 농도는 0.08×10-4~1×10-4 M로 농도별 10단계로 조절하여 비슷한 정도의 쓴맛을 내는 표준용액을 찾도록 하였다.
- 각 단백질 용액은 6% 수용액으로 제조하였으며, ISP와 wheat gluten인 경우는 거품이 형성되지 않도록 조금씩 물을 첨가하면서 현탁액을 제조하였다. Casein은 1 N NaOH를 사용하여 pH 6.
- 다양한 기능적 특성을 가지는 단백질 가수분해물의 개발을 위하여, casein, ISP, wheat gluten, gelatin의 4종류 단백질 기질을 alcalase, bromelain, papain, neutrase, trypsin 등의 효소를 이용하여 가수분해물을 제조하였다. 각 단백질에 대한 효소 분해과정을 확인하기 위하여 pH-stat 방법을 이용하여 시간에 따른 단백질 가수분해도(DH)를 측정하였고, 단백질 종류와 효소 종류에 의한 쓴맛 정도와 단백질 가수분해물의 용해성을 검토하고자 DH 10%에서 가수분해를 종결짓고, pH 6.5에서 각각의 용해성과 쓴맛을 NSI(nitrogen soluble index) 측정과 관능검사로 비교하였다. 시간에 따른 가수분해도는 단백질에 따라 다양하게 나타났으며, Casein, ISP, wheat gluten, gelatin의 순으로 높게 나타났다.
- 실험에 사용된 각 효소의 특성은 Table 1에 나타내었다. 각 효소의 최적 pH는 대체로 6~8 범위에 있으며 최종 산물의 염 생성량을 최소로 하기 위하여 각 단백질 용액의 초기 pH에 가장 근접하는 pH 6.5를 선택하였다. 효소 종류에 따른 casein의 가수분해도는 alcalase에서 35.
- )로 표시하였다. 관능검사는 고려대학교 식품공학과 대학원생 6명을 관능검사 요원으로 선발하여 쓴맛에 대한 강도 훈련을 충분히 시킨 후 실시하였다.
- 다양한 기능적 특성을 가지는 단백질 가수분해물의 개발을 위하여, casein, ISP, wheat gluten, gelatin의 4종류 단백질 기질을 alcalase, bromelain, papain, neutrase, trypsin 등의 효소를 이용하여 가수분해물을 제조하였다. 각 단백질에 대한 효소 분해과정을 확인하기 위하여 pH-stat 방법을 이용하여 시간에 따른 단백질 가수분해도(DH)를 측정하였고, 단백질 종류와 효소 종류에 의한 쓴맛 정도와 단백질 가수분해물의 용해성을 검토하고자 DH 10%에서 가수분해를 종결짓고, pH 6.
- 단백질 가수분해도가 같다는 것은 가수분해된 평균 펩타이드의 크기가 비슷하다는 의미이며, 단백질 농도가 일정하다는 의미는 아니다. 따라서 각 단백질 가수분해물의 농도를 같은 0.5%로 조절하여 관능검사를 행하였다(Fig. 4).
- 반응이 끝난 각 가수분해물들의 상등액을 모아 단백질과 효소 종류별 쓴맛에 대한 관능 검사를 행하였다. 표준 용액으로 Qunine-HCl의 농도별 용액을 사용하였으며, scoring test를 통해 쓴맛 정도를 비교하였다(26).
- 각 단백질 가수분해물의 용해도는 수용성 단백질의 수율 측면에서 매우 중요한 가치를 가진다고 할 수 있다. 앞의 결과(Fig. 1)에서 효소별 각 단백질의 가수분해 패턴을 이용하여, 단백질 내의 소수성 잔기가 노출되기 직전으로 알려진 DH 10%에서 가수분해를 종결하고 그 가수분해물의 용해도를 NSI로 측정하였다. Fig.
- 용해도 측정은 다음 식에 따라 수용성 질소지수(NSI: nitrogen solubility index)를 구하여 비교하였다(31). 가수분해물의 15 mL을 취하여 증류수를 가하여 30 mL가 되도록 하였으며, 1분간 충분히 흔든 후, 2000×g에서 10분간 원심분리 하여 그 상등액을 취하였다.
- 반응이 끝난 각 가수분해물들의 상등액을 모아 단백질과 효소 종류별 쓴맛에 대한 관능 검사를 행하였다. 표준 용액으로 Qunine-HCl의 농도별 용액을 사용하였으며, scoring test를 통해 쓴맛 정도를 비교하였다(26). Qunine-HCl의 농도는 0.
- 효소 첨가 전에 단백질 용액을 water bath에서 50ºC에 도달하도록 하였고, 각 효소는 기질의 농도에 대한 효소의 역가(activity)가 일정하도록 효소량을 조절(20 AU/kg protein)하여 첨가하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 단백질은 분리대두단백질(ISP 630 Ralston Purina Co., St. Louis, MO, USA), casein milk (Junsei chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan), wheat gluten (Shany, Sungnam, Korea), gelatin(Shinyo pure chemicals Co. Ltd., Osaka, Japan)을 이용하였다. 효소는 alcalase(Novo Industri, Bagsvaerd, Denmark, serin protease from Bacillus licheniformis, activity: 2.
- , Osaka, Japan)을 이용하였다. 효소는 alcalase(Novo Industri, Bagsvaerd, Denmark, serin protease from Bacillus licheniformis, activity: 2.4 Anson units/g), bromelain(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, cystein protease from pineapple stem, activity: 1870 units/g solid), papain(Sigma Chemical Co., crude type II, cystein protease from papaya latex, activity: 2.4 BAEE unit/mg solid), neutrase(Novo Industri, metalloprotease from Bacillus amylo-liquefacience, activity: 0.5 Anson units/g), trypsin(Sigma Chemical Co., crude type II, serine protease from porcin, pancrase, activity: 1130 BAEE unit/m solid)의 5가지 단백 분해 효소를 사용하였다(Table 1).
이론/모형
- Enzymatic hydrolysis patterns of casein, ISP, wheat gluten, and gelatin treated with different proteases at 20 AU/kg protein of enzyme/substrate ratio, 50ºC, pH 6.5 and 6% substrate concentration by pH-stat method.
- pH-stat법(28)에 의한 가수분해도는 TITERLAB 91(Radiometer International Co. Ltd., Copenhagen, Denmark)을 사용하여 측정하였다. 단백질 용액이 담긴 반응조 속의 온도가 50ºC에 도달하면 1 N NaOH용액을 이용하여 단백질 용액을 pH 6.
- 가수분해물의 15 mL을 취하여 증류수를 가하여 30 mL가 되도록 하였으며, 1분간 충분히 흔든 후, 2000×g에서 10분간 원심분리 하여 그 상등액을 취하였다. 가수분해물 및 가수분해물의 상등액 중의 질소 함량은 Kjeldahl 방법으로 측정하였다(32).
- 5로 조정하여 가용화하였으며, gelatin의 경우는 가열하여 완전히 투명한 용액으로 제조한 후에 50ºC로 식힌 후 사용하였다. 각각의 단백질 함량은 Kjeldahl법에 따라 측정하였고, 각 단백질의 수분함량을 고려하여 용액을 제조하였다. 50ºC water bath에 10분간 담가두어 열적 평형에 도달하게 하였고, 1 N NaOH를 이용하여 pH 6.
성능/효과
- 0.5% 단백질 농도에서의 관능검사는 원래 농도보다 낮은 농도에서 행하게 되므로 쓴맛 정도가 전체적으로 떨어지는 경향을 나타내었다. Casein의 경우 여전히 쓴맛 정도는 강하였지만 전체적으로 쓴맛 정도가 낮아졌다.
- 반대로 gluten의 경우, 단백질 구조적 특성상, 노출되는 소수성 부위가 그다지 많지 않는 펩타이드가 생성되어 쓴맛이 강하지 않는 것으로 사료된다. Casein, ISP, gluten 3종류의 단백질에서 papain과 bromelain 가수분해물의 약한 쓴맛의 정도는 가수분해물의 농도에 의한 효과로 나타났다. 즉 쓴맛의 강도가 약한 펩타이드는 함량이 높은 경우 쓰고 그 농도가 감소 시에는 쓴맛의 정도도 감소하는 것으로 생각된다.
- 그러나 trypsin의 경우는 casein에서는 매우 높았지만, ISP에서는 가장 낮았다. DH 10%에서 casein은 trypsin 가수분해물이, ISP와 gluten은 brolmelain과 neutrase 가수분해물이, gelatin의 경우 사용된 모든 효소 가수분해물이 쓴맛이 약하고 용해도가 높아 좋은 기질-효소 조합으로 선택될 수 있었다. 따라서 쓴맛이 적고 용해도가 높은 단백질 가수분해물은 가수분해도의 조절과 단백질과 효소 조합의 선택, 단백질 가수분해물의 농도 조절 등으로 얻을 수 있었다.
- 특히 bromelain과 neutrase 가수분해물은 거의 쓴맛을 나타내지 않았으며, 용해성이 우수한 단백질 가수분해물이었다. Gelatin은 앞서 가수분해 패턴 비교에서와 같이, DH 10%까지 이르지 못하므로 최고 수준의 DH 6% 수준에서 행해졌으며, 그 결과 모든 효소 가수분해물의 쓴맛은 최소감미농도 이하였다.
- Gluten의 경우는 모든 효소 가수분해물이 거의 최소감미농도 수준으로 감소하는 결과를 보였다. Casein과 ISP에서 강한 쓴맛을 생성한 alcalase는 gluten 가수분해물에서는 그 농도가 감소함에 따라 급격히 쓴맛 정도가 감소하여 최소감미농도 수준으로 거의 쓰지 않는 결과를 나타내었다.
- Casein에 대해 특히 alcalase와 trypsin의 가수분해도가 높은 결과를 보였다. ISP의 경우에는 alcalase 23.01%, neutrase 16.44%, bromelain 16.11%, papain 13.33%, trypsin 6.83%의 가수분해도를 보였다. Wheat gluten의 180분 후의 가수분해도는 alcalase 12.
- Monti와 Jost(36)는 trypsin, papain, neutrase의 효소를 이용한 열변성 치이즈 단백질의 용해성 연구에서 이와 비슷한 결과를 보고하였다. NSI 22.32%의 ISP는 papain, bromelain, neutrase 가수분해물의 경우 용해도가 약 80%였으며, alcalase 60%, trypsin 43.7% 정도로 가용화 부분의 많은 양이 증가하였다. Gluten은 4.
- 64%(alcalase 처리 casein 가수분해물)로 다양한 값을 나타내었다. 각 단백질 종류에 따른 가수분해도는 casein의 경우에 대부분의 효소에서 가장 가수분해도가 높았으며, ISP, wheat gluten, gelatin의 순서를 보였다. Casein의 경우, 24.
- 5에서 비교한 결과이다. 각 단백질의 가수분해 이전의 NSI는 gelatin 99.8%, casein 52.67%로 매우 높았으며, gelatin의 경우 콜라겐의 전처리 단계에서 이미 수용화 과정을 거쳤으며, casein의 경우도 알칼리 용액을 가하여 가용화 과정이 포함되었다. ISP와 gluten은 각각 22.
- DH 10%에서 casein은 trypsin 가수분해물이, ISP와 gluten은 brolmelain과 neutrase 가수분해물이, gelatin의 경우 사용된 모든 효소 가수분해물이 쓴맛이 약하고 용해도가 높아 좋은 기질-효소 조합으로 선택될 수 있었다. 따라서 쓴맛이 적고 용해도가 높은 단백질 가수분해물은 가수분해도의 조절과 단백질과 효소 조합의 선택, 단백질 가수분해물의 농도 조절 등으로 얻을 수 있었다.
- 시간에 따른 가수분해도는 단백질에 따라 다양하게 나타났으며, Casein, ISP, wheat gluten, gelatin의 순으로 높게 나타났다. 모든 단백질에서 alcalase의 가수분해도가 가장 높았으며, neutrase, bromelain, papain의 가수분해도는 비슷한 정도를 보였다. 그러나 trypsin의 경우는 casein에서는 매우 높았지만, ISP에서는 가장 낮았다.
- 모든 단백질에서 alcalase의 가수분해도는 가장 높았으며, neutrase, bromelain, papain의 가수분해도는 비슷한 정도를 보였다. 그러나 trypsin의 경우는, casein에서의 가수분해도는 31.
- 5에서 각각의 용해성과 쓴맛을 NSI(nitrogen soluble index) 측정과 관능검사로 비교하였다. 시간에 따른 가수분해도는 단백질에 따라 다양하게 나타났으며, Casein, ISP, wheat gluten, gelatin의 순으로 높게 나타났다. 모든 단백질에서 alcalase의 가수분해도가 가장 높았으며, neutrase, bromelain, papain의 가수분해도는 비슷한 정도를 보였다.
- ). 용해도 결과와 비교 시 trypsin 가수분해물은 casein에 있어 쓴맛이 약하고 용해도가 높아 가장 적당한 가수분해물로 판단되었다.
- 이 결과에서 같은 효소를 사용하였지만 단백질 종류에 따라 가수분해의 정도는 최고 10배까지 차이가 나타남을 알 수 있었다. 특히 casein의 가수분해도는 매우 높았으며, 이 결과 casein이 다른 단백질들에 비해 효소에 대한 반응성이 매우 크다는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 결과에서 casein은 alcalase와 neutrase에 의해, ISP는 alcalase, trypsin에 의해, 농도에 관계없이 강한 쓴맛을 나타내어 가수분해 반응 후 생성된 펩타이드의 조성에서 그 쓴맛이 지배되는 것으로 예측되었다. 반면, gluten의 경우는 alcalase와 neutrase에 의한 펩타이의 생성이 쓴맛에서 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과에서, 단백질 가수분해물은 단백질 1차 구조(아미노산 서열)의 특성과 혹은 동일 농도, 동일 기질에서 효소의 기질 특이성에 의해 다른 특성을 나타냄을 알 수 있었다. 즉, 소수성 부위가 큰 단백질에서 소수성 펩타이드를 주로 가수분해하는 효소에 의해 생성된 가수분해물은 같은 농도에서 강한 쓴맛을 나타내었고, 소수성 부위가 작은 단백질에서 주로 친수성 결합부위를 가수분해하는 가수분해물들의 쓴맛은 비교적 약하였다.
- 이와 같은 결과에서 효소의 가수분해도는 단백질 기질에 따라 크게 달라짐을 알 수 있었으며, 같은 기질에서도 효소 종류에 따라 가수분해도에서 많은 차이가 있음을 볼 수 있었다. 이는 단백질의 구조적인 민감성(susceptibility)과 효소의 특이 기질에 대한 반응성의 차이로 생긴다고 볼 수 있다.
- ) 이상의 쓴맛을 나타내었다. 전체적으로 casein 가수분해물의 쓴맛 정도는 매우 강하였으며, gluten 가수분해물은 쓴맛 정도가 약하였다.
- 이러한 결과에서, 단백질 가수분해물은 단백질 1차 구조(아미노산 서열)의 특성과 혹은 동일 농도, 동일 기질에서 효소의 기질 특이성에 의해 다른 특성을 나타냄을 알 수 있었다. 즉, 소수성 부위가 큰 단백질에서 소수성 펩타이드를 주로 가수분해하는 효소에 의해 생성된 가수분해물은 같은 농도에서 강한 쓴맛을 나타내었고, 소수성 부위가 작은 단백질에서 주로 친수성 결합부위를 가수분해하는 가수분해물들의 쓴맛은 비교적 약하였다. 따라서 가수분해도를 조절하여 일정한 크기의 펩타이드를 생성하되, 용해성이 높으면서, 소수성 부위의 노출 정도가 심하지 않도록 단백질 기질과 효소를 조합한다면 쓴맛이 약한 단백질 가수분해물을 생산할 수 있을 것이다.
- ) 순이었다. 특히 bromelain과 neutrase의 경우는 쓴맛이 그리 강하지 않는 반면, 용해성은 높아서 쓴맛이 적고 용해성은 높은 우수한 효소 반응을 나타내었다.
- 이 결과에서 같은 효소를 사용하였지만 단백질 종류에 따라 가수분해의 정도는 최고 10배까지 차이가 나타남을 알 수 있었다. 특히 casein의 가수분해도는 매우 높았으며, 이 결과 casein이 다른 단백질들에 비해 효소에 대한 반응성이 매우 크다는 것을 알 수 있었다. Casein은 peptide 내에 많은 수의 proline을 가지고 있으며 분자 내부에 disulfide bridge를 가지지 않아서 대부분 단백질 3차 구조를 이루고 있는 것으로 알려져 있다(34).
- 효소 가수분해 후의 용해도는 각 단백질 종류의 특성에 따라 차이가 나타났으며, DH 6%까지의 gelatin NSI는 99.8% 정도로 단백질 분해 효소에 관계없이 거의가 가용성이었다(data not shown). Casein의 경우 원래 52.
- 5를 선택하였다. 효소 종류에 따른 casein의 가수분해도는 alcalase에서 35.64%, trypsin 31.47%, neutease 27.36%, papain 24.74%, bromelain 19.01%의 순서로 나타났다. Casein에 대해 특히 alcalase와 trypsin의 가수분해도가 높은 결과를 보였다.
후속연구
- 즉, 소수성 부위가 큰 단백질에서 소수성 펩타이드를 주로 가수분해하는 효소에 의해 생성된 가수분해물은 같은 농도에서 강한 쓴맛을 나타내었고, 소수성 부위가 작은 단백질에서 주로 친수성 결합부위를 가수분해하는 가수분해물들의 쓴맛은 비교적 약하였다. 따라서 가수분해도를 조절하여 일정한 크기의 펩타이드를 생성하되, 용해성이 높으면서, 소수성 부위의 노출 정도가 심하지 않도록 단백질 기질과 효소를 조합한다면 쓴맛이 약한 단백질 가수분해물을 생산할 수 있을 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.