In order to improve bio-ethanol productivity by various cultivation methods in this paper, the culture modes using food wastes, such as batch culture, high-cell-density fermentation, SSF (simultaneous saccharification and fermentation) by fill & draw, continuous culture by fill & draw were performed...
In order to improve bio-ethanol productivity by various cultivation methods in this paper, the culture modes using food wastes, such as batch culture, high-cell-density fermentation, SSF (simultaneous saccharification and fermentation) by fill & draw, continuous culture by fill & draw were performed and their productivities were compared. SSFs by fill & draw were performed by continuous decompression using 1 L evaporator system, and by 10 L bioreactor without decompression. In addition, the continuous cultures by fill & draw mode using SFW (saccharafied food wastes) medium were performed by changes of 40% culture broth with intervals of 12 h (0.03 $h^{-1}$), 6 h (0.07 $h^{-1}$), 3 h (0.13 $h^{-1}$). Consequently, productivities of bio-ethanol were 2.52 g/L-h and 1.30 g/L-h in batch culture and high- cell-density fermentation, respectively. The productivities of SSF by fill & draw showed 2.24 g/L-h and 2.03 g/L-h in continuous decompression with 1 L evaporator and 10 L bioreactor without decompression, respectively. Also, the productivities in continuous culture by fill & draw modes showed 2.02 g/L-h, 4.07 g/L-h and 6.25 g/L-h by medium change with intervals of 12 h, 6 h, and 3 h, respectively. In conclusion, the highest ethanol productivity was obtained in the continuous culture mode by fill & draw with dilution rate of 0.13 $h^{-1}$.
In order to improve bio-ethanol productivity by various cultivation methods in this paper, the culture modes using food wastes, such as batch culture, high-cell-density fermentation, SSF (simultaneous saccharification and fermentation) by fill & draw, continuous culture by fill & draw were performed and their productivities were compared. SSFs by fill & draw were performed by continuous decompression using 1 L evaporator system, and by 10 L bioreactor without decompression. In addition, the continuous cultures by fill & draw mode using SFW (saccharafied food wastes) medium were performed by changes of 40% culture broth with intervals of 12 h (0.03 $h^{-1}$), 6 h (0.07 $h^{-1}$), 3 h (0.13 $h^{-1}$). Consequently, productivities of bio-ethanol were 2.52 g/L-h and 1.30 g/L-h in batch culture and high- cell-density fermentation, respectively. The productivities of SSF by fill & draw showed 2.24 g/L-h and 2.03 g/L-h in continuous decompression with 1 L evaporator and 10 L bioreactor without decompression, respectively. Also, the productivities in continuous culture by fill & draw modes showed 2.02 g/L-h, 4.07 g/L-h and 6.25 g/L-h by medium change with intervals of 12 h, 6 h, and 3 h, respectively. In conclusion, the highest ethanol productivity was obtained in the continuous culture mode by fill & draw with dilution rate of 0.13 $h^{-1}$.
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문제 정의
따라서 당 연구팀에서는 음식폐기물을 이용하여 바이오에탄올로 전환하는 기술을 개발하기 위해 그의 적합성을 조사한 결과 충분히 타당성이 있음을 이전 연구에서 확인하였다 [8]. 본 연구에서는 음식폐기물에 최적인 발효방식을 찾기 위해, 회분식, 연속배양식, 동시당화발효 등의 배양방법을 검토하여 생산성이 최대로 얻어지는 배양법을 결정하고자 한다.
이러한 배양법들을 토대로 하여, 본 연구에서는 음식폐기물을 분쇄하여 효소로 가수분해한 당화액을 이용하는 회분식 에탄올발효, 효모 고밀도 연속식 배양 및 fill & draw식 연속 배양방법을 검토하고, 연속적 감압을 통한 동시당화발효와 비감압식 동시당화발효법의 에탄올 생산성을 비교하고, 바이오에탄올 발효에 적합한 배양방법을 제안하고자 한다.
제안 방법
C 대학교 구내식당의 음식물류폐기물 20 kg를 분쇄기(WP650A, 원뿔, Korea)로 분쇄하여 당화효소 Termamyl 120L, Spirizyme Plus FG, Viscozyme L을 각각 10 mL를 첨가한 후 50℃, 150 rpm에서 10시간 반응시켜 효소학적 가수분해가 수행되도록 하였다. Termamyl 120L, Spirizyme Plus FG, Viscozyme L 등 효소의 pH 조건을 맞추기 위해 0.
샘플링을 하여 얻은 배양액을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)하여 그 상등액을 사용하였으며, 글루코오스 농도, 환원당 농도, 에탄올 농도를 측정하였다. 균체농도는 12시간마다 측정하였으며, 샘플링한 배양액은 적당히 희석하여 균체농도를 흡광도 660 nm에서 측정하였다. 이때 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 5 min)하여 얻은 상등액을 균체농도의 blank로 사용하였다.
italicus KJ 5%를 접종하여 20시간동안 전정상상태의 동시당화발효를 수행하였다. 동시당화 발효를 계속 유지하기 위하여 12시간 단위로 80 g의 음식물류폐기물과 24시간 단위로 효소 Viscozyme와 Spirizyme Plus를 공급하고, 24시간 후부터 발효 중 생산되는 에탄올을 -600 mm Hg에서 에탄올 증류를 시작 (냉각용매 0℃의 15% 에탄올 수용액)하여 감압식 동시당화 연속발효실험을 352시간 수행하였다.
italicus KJ 5%를 접종하여 20시간동안 전정상상태의 동시 당화발효를 수행하였다. 동시당화발효를 계속 유지하기 위하여 12시간 단위로 음식물류폐기물과 24시간 단위로 0.05 M acetic acid buffer (pH 5.0)로 희석한 효소 Viscozyme L과 Spirizyme Plus FG를 접종구를 통해 공급해주었다. 주입 및 배출양은 2 L로 조절하여 본 실험을 수행하였다 (Fig.
회분식 에탄올배양은 500 mL Erlenmeyer flasks를 사용하여 working volume 200 mL, 초기 환원당 농도는 100 g/L, 건식 배양기 (30℃, 100 rpm)에서 2일간 혐기적으로 배양하였다. 배양액을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)하여 그 상등액을 분취하여 Gas Chromatography를 이용하여 생산된 에탄올의 농도를 측정하였다.
배양액을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)한 상등액을 50 mM citric acid buffer (pH 4.8)로 희석하여 희석효소액 0.2 mL에 기질 (1% soluble starch) 0.8 mL를 넣어 시료로 하였고, 대조군으로 50 mM citric acid buffer (pH 4.8) 0.2 mL와 기질 (1% soluble starch) 0.8 mL를 넣어 blank로 사용하였으며, 50℃에서 약 30분간 반응시킨 후 DNS법에 의하여 얻어진 환원당으로부터 아밀라아제 활성을 측정하였다.
전배양액 5%를 음식물류폐기물의 효소학적 가수분해를 통하여 얻어진 당화액인 SFW에 접종하여 본배양 하였다. 본 연구는 연속배양식의 방법으로, 1 L Erlenmeyer flasks를 사용하여 working volume 500 mL로 하였고, 초기 환원당농도는 100 g/L, 건식생물배양기 (30℃, 100 rpm)에서 처음 20시간 에탄올 발효 [20] 후 12 h, 6 h, 3 h 단위로 발효액 200 mL를 샘플링한 후 새로운 SFW배지 200 mL를 다시 채워주는 방법으로, 연속배양을 위하여 총 221 h 동안 실험을 수행하였으며, 이때 40% 교체의 SFW배지의 희석율은 각각 0.03 h-1, 0.07 h-1, 0.13 h-1이었다. 실험 과정동안 샘플링한 배양액을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)하여 얻어진 상등액으로 DNS 법에 의한 환원당농도와 Gas Chromatography를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정하였다.
본 연구에서는 C 대학교 구내식당으로부터 수거한 음식물류폐기물을 습윤상태 그대로 사용하였으며, 음식폐기물의 원소분석은 Elemental Analyzer를 이용하여 C, N, S, H를 분석하였고, 탄소 C는 (45∼48%), 질소 N은 (2.5∼4.0%), 황 S는 (0∼0.48%), 수소 H는 (5∼8%)으로 나타났다.
비감압식 동시당화 연속배양은, 10 L 생물배양기 (BioG, Hanil R&G Co., Korea)에서 working volume을 5 L로 하고, 분쇄한 음식물류폐기물 4 kg (함수율 80.2%)과 효소 Spirizyme Plus FG, Viscozyme L을 0.05 M acetic acid buffer (pH 5.0)에 희석하여 250 rpm, 35℃에서 4시간 당화반응 시킨 후 S. italicus KJ 5%를 접종하여 20시간동안 전정상상태의 동시 당화발효를 수행하였다.
13 h-1이었다. 실험 과정동안 샘플링한 배양액을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)하여 얻어진 상등액으로 DNS 법에 의한 환원당농도와 Gas Chromatography를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정하였다.
에탄올 생산 농도를 향상시키기 위해 효모 고밀도 배양을 이용한 에탄올발효를 실시하였다. 그 배양시스템을 Fig.
음식물류폐기물을 이용하는 최적 에탄올 생산방식을 결정하기 위해, 본 연구에서 수행한 에탄올 배양 방법인 회분식 배양발효, 효모고밀도 연속식 배양 발효, fill & draw 동시 당화 발효, SFW 배지를 이용한 fill & draw식 연속 배양 발효의 에탄올 생산성을 Table 1에 정리하였다.
희석액 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 첨가하여 100℃에서 5분간 반응시킨 다음 증류수 20 mL를 넣어 희석하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 이는 Glucose를 (0.5-2.0 g/L) 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교하여 유리된 환원당의 양을 측정하였다.
다음, 주반응 조에 새로운 SFW배지 1 L를 다시 채워주었다. 주반응조, 새로운 당화액배지 저장탱크, 침강컬럼에는 모두 hepa filter를 장착하여 발효기안의 바이오가스가 외부로 빠져나가도록 하였다.
환원당 측정법은 DNS법으로 측정하였으며 DNS법 [21]은 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)와 Rochelle 염으로 발색하여 흡광도를 측정하는 정량분석법이다. 측정방법은 시료를 원심분리한 후 증류수를 가하여 희석하였다. 희석액 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 첨가하여 100℃에서 5분간 반응시킨 다음 증류수 20 mL를 넣어 희석하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다.
플라스크 레벨에서 SFW 배지를 이용하여 fill & draw식 연속 배양 발효를 총 221 h 동안 수행하였다.
대상 데이터
분쇄한 음식물류폐기물을 상업용 당화효소 Termamyl 120L, Spirizyme Plus FG, Viscozyme L 등 세 가지 또는 두 가지 효소를 혼합하여 가수분해공정에 사용하였다. 이들 효소는 한국 Novozyme사로부터 구입하여 사용하였으며, Termamyl 120L는 전분 액화에 사용되는 효소로써, Bacillus licheniformis에서 유래 α-amylase이며, 1,4-α-glucosidic linkage를 가수분해 시키는 효소이다.
에탄올 생산균주는 본 연구실에서 한 등이 분리한 Saccharomyces italicus KJ를 사용하였다 [18]. YM (yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L, bacto peptone 5 g/L, glucose 10 g/L, agar 15 g/L)고체배지에 배양한 S.
이들 효소는 한국 Novozyme사로부터 구입하여 사용하였으며, Termamyl 120L는 전분 액화에 사용되는 효소로써, Bacillus licheniformis에서 유래 α-amylase이며, 1,4-α-glucosidic linkage를 가수분해 시키는 효소이다.
성능/효과
12시간 단위의 배지교체로 140 h 동안 수행한 결과 에탄올농도는 61.3 ±8.1 g/L, 잔류환원당농도는 4.9 ± 0.2 g/L 이었고, 6시간 단위의 배지교체로 140 h부터 188 h까지 발효된 에탄올농도와 잔류환원당농도는 60.7 ± 8.9 g/L와 4.9 ± 0.1 g/L로 계산되었으며, 3시간 단위로 교체된 경우 188 h부터 221 h까지 수행한 결과 에탄올농도는 47.0 ± 4.8 g/L, 잔류환원당농도는 26.2 ± 4.3 g/L로 유지되었다 (Fig. 6).
500 mL 플라스크 레벨에서 회분식으로 에탄올발효를 수행한 결과, 1일 후 생산된 에탄올 농도는 60.5 g/L로써 에탄올 생산성은 2.52 g/L-h 이었으며, 2일 후 생산된 에탄올은 65.1 g/L로써 에탄올 생산성은 1.36 g/L-h로 계산되었다 (data not shown).
당화액 배지를 이용하여 24 h 동안의 회분식 배양으로 에탄올발효를 한 결과, 에탄올 생산성은 2.52 g/L-h 이었고, 효모 고밀도 연속배양에서 에탄올 생산성은 1.30 g/L-h로 계산되었으며, -600 mm Hg로 감압을 수행한 fill & draw 동시당화 배양발효의 에탄올 생산성은 2.24 g/L-h 이었고, 10 L 생물배양기에서 비감압식 fill & draw 동시당화 배양 발효의 에탄올 생산성은 2.03 g/L-h로 계산되었다.
30 g/L-h 이었다. 본 연구에서는 효모 고밀도 배양을 시도하였으나, 에탄올 생산균주인 Saccharomyces italicus KJ는 침강칼럼에 의한 고밀도화가 원활히 이루어지지 않은 것으로 미루어, 6시간의 침강시간이 부족했거나 침강성 그다지 높지 않는 운동성의 효모로 판단되며, 본 배양방법에 의한 효모 고밀도 배양은 연속적 고밀도 배양방법으로 적절치 않은 것으로 사료되었다.
5). 연속적 감압 조건에서 동시당화 에탄올 발효가 10 L 생물반응기에서의 비감압식 동시당화 에탄올 발효보다 생산성이 9.4% 더 높은 것으로 나타났다.
이로써, 음식물류폐기물을 이용한 에탄올 생산을 위한 최적의 배양방법은 현재까지의 검토에 의거, SFW 배지 40%를 3 h (0.13 h-1) 단위로 교체한, fill & draw식 연속 배양방법이 가장 높은 것으로 나타났다.
이전 연구를 바탕으로 10 L 생물배양기에서 비감압식으로, 35℃에서 180 h 동안 실험을 수행한 결과 24시간째부터 환원당 농도는 5.8 ± 1.2 g/L, 에탄올 농도는 60.0 ± 9.4 g/L, 36시간째부터 효소 활성은 amylase 기준으로 5.7 ± 0.9 U/mL로 유지되었으며, 실험 24시간째부터 180시간까지 에탄올 생산성은 2.03 g/L-h로 계산되었다 (Fig. 5).
효모 고밀도 배양에 의한 연속식 에탄올발효에서 당화액 배지의 초기 환원당 농도가 100 g/L일 때 배양 168 h 동안 생산된 에탄올의 평균농도는 60.8 ± 5.3 g/L, 잔류 환원당 농도는 11.6 ± 0.9 g/L, 균농도는 OD 660 nm의 값으로써 점차 감속하는 경향을 보였으며 23.5 ± 3.0으로 유지되었다 (Fig. 4).
후속연구
연속배양에서는 기질농도, 용존 산소의 농도, 대사생성물의 농도, pH 등의 환경조건이 항상 일정하게 유지되기 때문에 증식속도를 임의로 조절할 수 있는 것이 특징이다. 또한, 생산성이 높고 다른 공정에 비해 노동력이 적게 들고, 자동제어를 통한 제품의 균질성을 높이고, 정상상태 (steady state)를 유지하기가 쉬워 미생물의 생리대사 및 유전에 관한 연구에 도움을 줄 수 있다. 그러나 배양 중에 균주의 변이발생 가능성이 있고, 장기간 배양중에 무균 상태를 유지하는 것이 어려워 오염에 대한 위험성이 높으며, 배양액 중의 생성물 농도가 낮아 상대적으로 분리 회수 비용이 많이 드는 단점이 있다 [15].
25 g/L-h로 계산되었다. 보다 높은 에탄올 생산성을 위해 다양한 희석율과 당농도 및 배지성분의 변화 등을 추가로 검토해 볼 필요가 있다.
6 g/L-h, 13 g/L-h로 나타났다. 본 연구도 membrane filter를 이용하는 고밀도 배양법을 향후 검토해 볼 필요가 있다고 생각한다.
13 h-1에서 얻어졌다. 향후, 다양한 희석률과 초기 당농도 등의 배지성분의 최적화를 통해 생산성을 더욱 향상 시킬 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
바이오 에탄올 생산기술의 세대별 원료는 무엇이며 그 특징은?
바이오 에탄올 생산기술로는 1세대 원료인 곡물로 미국과 브라질을 중심으로 옥수수, 사탕수수, 폐당을 이용하여 당질 및 전분질계로부터 발효 가능한 당을 생산하고, 생성당을 효모 등의 미생물을 이용하여 에탄올을 발효 생산하고 있다 [1]. 2세대 원료는 목질계로 대나무, 왕겨, 갈대, 볏짚 등을 이용하여 물리화학적 당화나 셀룰로오스를 분해하는 효소를 첨가하여 셀룰로오스를 당으로 전환시켜 에탄올을 발효 생산하고 있다 [2]. 제 3세대 원료는 해조류로 우뭇가사리, 김, 꼬시래기 같은 홍조류는 탄수화물을 많이 포함하고 있어 바이오 에탄올 원료로 사용되고 있으며, 다시마, 모자반, 톳 같은 갈조류는 성장이 빠르고 단위 면적당 생산성이 높다 [3]. 최근에는 이러한 갈조류인 다시마로부터 바이오 에탄올을 생산하고 있다 [4].
에탄올 발효 방법 중, 가장 상용화된 회분식 공정의 장단점은?
지금까지 알려진 에탄올 발효 방법에는 회분식 [9-10], Fed-batch식 [11-12], Mell-Boint 반연속식, 연속발효 [13] 등이 있다. 회분식 공정은 오랫동안 주류 생산에 사용한 경험이 있으며 반응조 구조가 간단하고 오염가능성이 낮다는 장점으로 인해 현존하는 대부분의 상용프로세스로 채택하고 있다. 그러나 생산성이 낮고 반응전의 준비단계 및 반응 후의 세척 등에 소모되는 시간과 노동력이 크며 기질 저해 등에 취약한 단점이 있다 [14]. 연속배양은 신선한 배지를 일정한 속도로 발효조로 공급하면서 동시에 같은 양의 발효배양액을 배출시켜 발효조 내의 배양액을 항상 일정하게 유지하면서 발효하는 방법이다.
음식물쓰레기의 어떤 점에서 발효산업의 배양기질로 사용할 수 있는가?
각 기술들은 나름대로의 장단점을 지니고 있으나, 이용되고 있는 자원화기술들이 대부분 종래의 저급 자원화기술 단계에서 벗어나지 못하고 있다. 그러나 음식물쓰레기는 미생물의 기질로 이용될 수 있는 다양한 영양물질들이 함유되어 있다는 것에 초점을 맞추어 발효산업의 배양기질로 이용할 수 있다는 인식전환이 필요하다.
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