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문제 정의
- 다양한 연구를 통해 대나무종의 항균 활성은 입증이 되었으나, 조릿대의 항균작용에 대한 구체적인 연구가 부족한 실정이다. 본 연구에서는 더 나아가 용매별 분획을 하여 병원성 미생물에 대한 좀 더 심층적인 조릿대의 항균력을 검증하고자 하며, 본 연구결과를 토대로 조릿대의 천연식품보존료로서의 이용 가능성을 검토하고자 한다.
제안 방법
- 각각의 균주는 농도를 O.D.600= 0.2~0.3로 조절한 후 본 실험에 사용하였으며, 96-well plate(Falcon, USA)에 nutrient broth 100 µL, 조릿대 추출물과 분획물 및 항생제와 식품보존료를 첨가하여 제조한 조제액 50 µL, 균 희석액 50 µL를 순차적으로 첨가한 뒤 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 37℃에서 배양한 후 균의 생육 곡선을 나타내었다.
- 3로 조절한 후 본 실험에 사용하였으며, 96-well plate(Falcon, USA)에 nutrient broth 100 µL, 조릿대 추출물과 분획물 및 항생제와 식품보존료를 첨가하여 제조한 조제액 50 µL, 균 희석액 50 µL를 순차적으로 첨가한 뒤 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 37℃에서 배양한 후 균의 생육 곡선을 나타내었다. 균의 생육 곡선을 통해 조릿대의 추출물과 분획물이 균의 생장을 저해하는 정도를 확인하였으며, 생육 곡선 상에서 균의 생장(turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC로 설정하였다.
- 3(대략 1×107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞게 제조하여 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 멸균하였고, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
- 뿌리, 줄기, 잎을 1:1:1(w/w/w)의 비율로 섞은 조릿대 50g에 70% 에탄올 1 L을 가하여 상온에서 48시간 동안 침지추출 하였다. 불순물을 제거하기 위해 Whatman 여과지 (No.
- 1)로 여과한 다음 회전농축기에서 감압 농축하여 건조시킨 후 시료로 사용하였다. 앞의 추출공정에 의해 얻어진 조릿대 추출물로부터 분획물을 얻기 위하여 서로 다른 극성의 용매(water, butanol, ethyl acetate, chloroform, n-hexane)를 첨가하여 단계적으로 분획하였다(Fig. 1). 조릿대 추출물을 증류수에 완전히 용해시킨 후 분획여두에 넣고 n-hexane 500 mL을 첨가하여 water층과 n-hexane층을 분리하였고, 동일한 과정을 통해 chloroform, ethyl acetate 및 butanol을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었고 최종 남은 용액은 water 분획물로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Gram 양성균 4종, Gram 음성균 4종과 각각의 배양 조건을 Table 1에 나타내었다. 각 균주는 35% glycerol medium을 사용하여 -70℃에서 저장, 보관하였다.
- 본 실험에서는 2010년 1월에 전라남도 화순에서 자생 하고 있는 조릿대(Sasa borealis)를 채집하여 부위별(뿌리, 줄기, 잎)로 나누어 세척한 후 음건하여 실험 재료로 사용하였다. 실험에 사용된 모든 용매들은 특급으로 SigmaAldrich Inc.
- 뿌리, 줄기, 잎을 1:1:1(w/w/w)의 비율로 섞은 조릿대 50g에 70% 에탄올 1 L을 가하여 상온에서 48시간 동안 침지추출 하였다. 불순물을 제거하기 위해 Whatman 여과지 (No.1)로 여과한 다음 회전농축기에서 감압 농축하여 건조시킨 후 시료로 사용하였다. 앞의 추출공정에 의해 얻어진 조릿대 추출물로부터 분획물을 얻기 위하여 서로 다른 극성의 용매(water, butanol, ethyl acetate, chloroform, n-hexane)를 첨가하여 단계적으로 분획하였다(Fig.
- 실험 균액은 UV-spectrophotometer(SpectraMax M2, Molecular Decives, USA)를 이용하여 O.D.600 =0.2~0.3(대략 1×107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 사용하였다.
이론/모형
- 조릿대 추출물 및 분획물의 각 병원성 균주에 대한 생육 저해 효과 및 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 조사하기 위하여 Jang M(2010) 등의 방법을 토대로 broth-dilution method를 사용하여 수행되었다. 조릿대 추출물과 분획물, 대조군인 항생제 tetracycline 및 식품보존료인 sorbic acid는 0.
성능/효과
- 06 mg/mL으로 관찰되었다. Butanol의 최소저해농도는 B. subtilis와 L. monocytogenes에 대하여 0.03 mg/mL과 0.06 mg/mL으로 강력한 항균력이 관찰되었다. Water 분획물은 S.
- Chung DK와 Yu R(1995)의 연구에서는 ethyl acetate 추출물의 항균력이 강력하게 나타났으나, 이는 추출 방법과 접종 균주가 다르기 때문이라고 판단된다. Chloroform 분획물은 B. cereus와 V. vulnificus에 대하여 강한 항균력을 나타내었으며 MIC는 각각 0.03mg/mL과 0.06 mg/mL으로 관찰되었다. Butanol의 최소저해농도는 B.
- subtilis에 대하여 민감하게 작용한다고 보고하였으며, 이는 본 연구 결과와 유사하다. L. monocytogenes는 추출물과 모든 분획물이 균의 생장을 저해하였으나, 추출물과 ethyl acetate 분획물은 다른 분획물에 비해 미약한 항균력이 나타났다. 반면, S.
- 모든 균주는 16시간 이후에 생장률이 감소하였으며 특히 조릿대 분획물의 강력한 항균력은 24시간까지 지속되었다. MIC는 70% ethanol 추출물에서는 S. choleaesuis에 대해서만 5 mg/mL으로 관찰되었으며, 다른 균주에 대해서는 관찰되지 않았다. 모든 분획물의 MIC는 0.
- Baek J 등(2002)의 연구 결과에서도 이와 비슷한 경향을 보였다. P. aerginosa에 대하여는 무첨가군과 추출물 첨가군과의 생육 정도의 차이가 거의 없으나 모든 분획물은 균의 생장을 강력하게 저해하는 것으로 나타났다. S.
- aerginosa에 대하여는 무첨가군과 추출물 첨가군과의 생육 정도의 차이가 거의 없으나 모든 분획물은 균의 생장을 강력하게 저해하는 것으로 나타났다. S. choleraesuis에 대해서는 추출물의 미약한 항균 활성이 관찰되었으며 모든 분획물은 강한 항균력이 나타났다. 또한, S.
- marcescens에 대하여 추출물의 항균력은 미약하게 관찰되었으나 모든 분획물에서 강력한 항균력이 나타났다. V. vulnificus에 대한 추출물의 항균력 또한 미약하게 관찰되었으며 분획물들은 탁월한 항균력이 검증되었다.
- 06 mg/mL으로 강력한 항균력이 관찰되었다. Water 분획물은 S. marcescens, V. vulnificus 및 B. subtilis에 대하여 0.03 mg/mL에서 최소저해농도가 관찰되어 다른 추출물 및 분획물에 비하여 비교적 강력하게 항균 작용을 하는 것으로 나타났다. Water층의 수율은 다른 분획층보다 많았으며, 일부 유기용매가 갖고있는 잠재적 위험 요소가 없어 안전할 뿐만 아니라 본 연구에서 강력한 항균력이 검증되어 식품산업에 적용 시 경제적 또는 기능적 측면에서 가장 효과적일 것이라 판단된다.
- 03 mg/mL에서 최소저해농도가 관찰되어 다른 추출물 및 분획물에 비하여 비교적 강력하게 항균 작용을 하는 것으로 나타났다. Water층의 수율은 다른 분획층보다 많았으며, 일부 유기용매가 갖고있는 잠재적 위험 요소가 없어 안전할 뿐만 아니라 본 연구에서 강력한 항균력이 검증되어 식품산업에 적용 시 경제적 또는 기능적 측면에서 가장 효과적일 것이라 판단된다.
- gram positive 균주들을 살펴보면, B. cereus와 B. subtilis는 추출물과 분획물 모두 균주의 성장을 저해하는 효과를 나타내었으며, 특히 모든 분획물이 두 균주의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다. Baek J 등(2002)의 연구에서 대나무 추출물이 B.
- 5 mg/mL으로 저농도에서 관찰되었으며 균주의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다. 따라서 조릿대 추출물 및 분획물은 실험에 사용된 8종의 병원성 유해 균주에 대하여 항균력이 입증되어, 천연 항균제제로서 식품보존제로서의 이용이 가능할 것으로 판단된다.
- choleraesuis에 대해서는 추출물의 미약한 항균 활성이 관찰되었으며 모든 분획물은 강한 항균력이 나타났다. 또한, S. marcescens에 대하여 추출물의 항균력은 미약하게 관찰되었으나 모든 분획물에서 강력한 항균력이 나타났다. V.
- 반면, 70% ethanol 추출물은 분획물에 비하여 균의 생장의 저해가 비교적 미약하였다. 모든 균주는 16시간 이후에 생장률이 감소하였으며 특히 조릿대 분획물의 강력한 항균력은 24시간까지 지속되었다. MIC는 70% ethanol 추출물에서는 S.
- 2). 모든 균주는 16시간 이후에 생장률이 감소하였으며, 특히 모든 분획물은 저농도에서도 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다. 반면, 70% ethanol 추출물은 분획물에 비하여 균의 생장의 저해가 비교적 미약하였다.
- choleaesuis에 대해서만 5 mg/mL으로 관찰되었으며, 다른 균주에 대해서는 관찰되지 않았다. 모든 분획물의 MIC는 0.03~2.5 mg/mL으로 저농도에서 관찰되었으며 균주의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다. 따라서 조릿대 추출물 및 분획물은 실험에 사용된 8종의 병원성 유해 균주에 대하여 항균력이 입증되어, 천연 항균제제로서 식품보존제로서의 이용이 가능할 것으로 판단된다.
- monocytogenes는 추출물과 모든 분획물이 균의 생장을 저해하였으나, 추출물과 ethyl acetate 분획물은 다른 분획물에 비해 미약한 항균력이 나타났다. 반면, S. aureus에 대해서는 추출물과 분획물의 항균력이 다른 gram positive 균주들에 비해 다소 미미하였으나, ethyl acetate 분획물을 제외한 분획물에서 강력한 항균력이 검증되었다. 동종의 조릿대로 항균실험을 검증한 Ko M(2008)의 연구에서 paper disc 방법을 통해 조사한 조릿대의 항균 활성은 B.
- choleraesuis에 대해서만 5 mg/mL로 나타났으며, 다른 균주에 대해서는 시험 농도 내에서 최소저해농도가 나타나지 않았다. 반면, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 분획물은 0.03~2.5 mg/mL로 최소저해농도가 관찰되었으며 본 연구에서 각각의 분획물은 항균력은 서로 다른 균주에 대하여 모두 다르게 나타났다. 특히 chloroform, butanol 및 water 분획물의 저농도에서 강력한 항균력이 관찰되었다.
- 시험 용액 중 1.25 mg/mL 농도의 조제액을 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 조릿대 추출물과 분획물이 식중독 균의 생장에 미치는 영향을 검토한 결과 모든 균주에 대해서 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다(Fig. 2). 모든 균주는 16시간 이후에 생장률이 감소하였으며, 특히 모든 분획물은 저농도에서도 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다.
- 실험에 사용된 모든 gram positive와 gram negative 균주에 대하여 추출물에 비해 분획물들이 강력한 항균력이 관찰되었는데, gram positive 균주에 대하여는 n-hexane, chloroform, butanol 및 water의 분획물이 ethyl acetate 분획물보다 민감하게 작용하는 것으로 나타났으며, gram negative 균주에 대하여는 n-hexane, ethyl acetate, butanol 및 water의 분획물이 chloroform 분획물보다 민감하게 작용하는 것으로 나타났다.
- 5%으로 나타났다. 적절한 액체배지에 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 조릿대 추출물과 분획물의 항균활성을 검토한 결과 모든 균주의 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다. 특히 모든 분획물은 저농도에서도 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다.
- 조릿대를 70% ethanol에 추출하여 12 g를 얻었으며, 70% ethanol 추출물로부터 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 분획물의 수율은 각각 12.58%, 17.75%, 6.33%, 18.41%, 44.5%으로 나타났다. 적절한 액체배지에 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 조릿대 추출물과 분획물의 항균활성을 검토한 결과 모든 균주의 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다.
- 각 병원성 유해 균주에 대한 조릿대 추출물 및 분획물의 최소저해농도를 Table 2에 나타내었다. 추출물은 분획물에 비해 미약한 항균력을 나타내었으며, 최소저해농도는 S. choleraesuis에 대해서만 5 mg/mL로 나타났으며, 다른 균주에 대해서는 시험 농도 내에서 최소저해농도가 나타나지 않았다. 반면, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 분획물은 0.
- 5 mg/mL로 최소저해농도가 관찰되었으며 본 연구에서 각각의 분획물은 항균력은 서로 다른 균주에 대하여 모두 다르게 나타났다. 특히 chloroform, butanol 및 water 분획물의 저농도에서 강력한 항균력이 관찰되었다. Chung DK와 Yu R(1995)의 연구에서는 ethyl acetate 추출물의 항균력이 강력하게 나타났으나, 이는 추출 방법과 접종 균주가 다르기 때문이라고 판단된다.
- 2). 모든 균주는 16시간 이후에 생장률이 감소하였으며, 특히 모든 분획물은 저농도에서도 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다. 반면, 70% ethanol 추출물은 분획물에 비하여 균의 생장의 저해가 비교적 미약하였다.
후속연구
- 본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 병원성 균주에 대한 검증이 필요하며, 식품 내에 첨가되었을 때의 식품과 조릿대 사이에서 일어나는 물리·화학적 반응에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 또한 식품 가공 과정에 조릿대를 경제적, 관능적, 실용적인 측면에서 효과적으로 적용할 수 있는 방안에 대하여 연구해야 할 것이다.
- 본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 병원성 균주에 대한 검증이 필요하며, 식품 내에 첨가되었을 때의 식품과 조릿대 사이에서 일어나는 물리·화학적 반응에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
- 조릿대 추출물과 분획물의 생육저해효과와 최소저해농도 분석을 통해 항균력을 조사한 결과 8종의 병원성 세균에 대한 항균활성이 입증되어, 천연 항균제재 및 식품보존제로의 이용이 가능하리라 생각된다. 본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 병원성 균주에 대한 검증이 필요하며, 식품 내에 첨가되었을 때의 식품과 조릿대 사이에서 일어나는 물리·화학적 반응에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
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