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문제 정의
- 따라서 암피실린 분해유전자를 동정하기 위하여 다른 세균에서 보고되어 있는 암피실린 분해유전자인 β-lactamase와 상동성이 있는 VPA0477 유전자 결손균주를 작성하여 암피실린에 대한 내성변화를 검토하였다.
- piscicida및 Aliivibrio salmonicida LFI1238의 β-lactamase 유전자와 75%, 67%, 66% 및 64%의 상동성이 있으나 아직 연구결과 보고는 없다. 이 유전자가 ampicillin을 분해하는 유전자의 가능성이 있어 이 유전자의 결손균주는 재료 및 방법에 제시한 방법에 의하여 작성하였다. 유전자 결손여부는 PCR과 Southern hybridization으로 확인하였다.
제안 방법
- 일반적으로 임상분리 장염비브리오의 대부분은 이 균의 대표적인 병원성 인자인 TDH 또는 TRH 유전자를 보유하고 있는데 비해 해수 및 어패류 등의 환경유래 장염비브리오에는 이들 병원성 유전자의 보유율은 매우 낮은 것으로 보고되어있다 (Honda and Iida, 1993). 2008년 6월부터 10월까지 전북 부안군 곰소만의 표층해수에서 분리한 장염비브리오 28개 균주를 대상으로 TDH 및 TRH 유전자 존재유무는 각 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 PCR로 검토하였다. 그 결과 28개 모든 균주에서 이들 병원성 유전자는 증폭되지 않았다(Table 2).
- 0)]를사용하여 전기영동한 후 nylon membrane (GeneScreen Plus,Dupont)에 전이하였다. DNA는 GS Gene Linker UV chamber (Bio-Rad, USA)로 고정하였으며, hybridization은 42℃의 수조에서 하룻밤 실시하여 phosphatase-labeled anti-DIG monoclonal 항체 (Boehringer Mannheim, Germany)로 검출하였다. 필름은 TQX-120 Automatic Film Processor (동양 메디칼시스템(주))로 현상하였다.
- MIC는 미국 NCCLS (National Committee for Laboratory Standard, 2004)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 멸균된 Muller-Hinton broth (Merck, Germany)에 농도가 다르게amplcillin를 첨가하고 멸균된 소형 시험관에 배지를 2 ml씩 분주하였다.
- (2006)이 제시한 그람음성 장내세균의 class 1 integron primers (IntF: 5-GGCATCCAAGCAGCAAG-3와 Int B: 5-AAGCAGACTTGACCTGA-3)를, TDH 및 TRH 유전자 확인용 primers는 다음과 같다; TDH (5`-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3` 및 5`-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3`) 및 TRH (5`-TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT-3` 및 5`-CATAACAAACATATGCCCATTTCCG-3`). PCR 반응에는 Takara (Japan)의 kit를 사용하였으며, 95℃에서 3분간 열변성한 후 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복하여 DNA를 증폭하여 1.5% agarose gel 상에서 증폭여부를 확인하였다.
- 결손균주의 확인을 위한 Southern blot용 probe는 아래의 primers를 사용하였다: S1 (5`-ATGAAAAAGTTATTCCTGTTG-3`) 및 S2 (5`-TTAACTTTCTTTGTAGTGCTC-3`). PCR 반응은 95℃에서 3분간 열변성한 후 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복하여 DNA를 증폭 및 정제한 다음 DIGlabeling kit (Boehringer Mannheim, Germany)를 사용하여 상기의 PCR 조건 중 annealing 온도만 5℃ 낮은 50℃에서 PCR 반응을 실시하여 DIG-labeling probe를 작성하였다.
- 각 균주에 대한 용혈능 검사는 PBS로 3회 세정하여 최종농도가 2%가 되도록 조정한 사람 및 토끼의 적혈구를 첨가한 LB agar (0.5% yeast-extract, 1% tryptone, 1% NaCl, 1.5% agar)에 시험균주를 접종하여 35℃에서 48시간 배양 후 용혈환의생성유무로 용혈능을 판독하였다.
- 유전자 결손에 따른 균 증식 속도를 야생형과 비교한 결과 양 균주에서 차이가 나타나지 않아 VPA0477 유전자는 균 증식에는 직접적으로 관여하지 않음을 시사한다 (결과 미제시). 결손균주의 암피실린에 대한 내성변화는 MIC로 측정하였다. 그 결과 VPA0477 유전자 결손균주의 암피실린에 대한 MIC는 1.
- 결손균주의 스크린은 chloramphenicol 5 μg/ml이 첨가된 TCBS agar (Difco)와 10% sucrose가 포함된 LB (NaCl 3%) broth를 사용하였다. 결손여부는 PCR 반응 및 Southern hybridization으로 확인하였다.
- 실험에 사용한 균주는 2008년 전북 부안군 곰소만의 표층 해수에서 분리하여 장염비브리오로 동정된 28개 균주를 사용하였다. 균주 동정은 API 20E kit (Biomerieux, France)를 사용하였다.
- 항생제 감수성 시험은 Acar and Goldstein (1991)의 disk diffusion법으로 검사하였다. 시험균주는 LB (NaCl 3%) broth에 접종하여 35℃에서 하룻밤 배양한 균을 생리식염수로 2회 세정하고 농도를 McFarland 0.5로 조정하여 Muller-Hinton agar (Merck, Germany)에 도말하였다. 여기에 검사 항생제 disk를 고착하여 35℃에서 16-18시간 배양한 후 증식억제환생성유무 및 크기로 항생제 감수성을 판독하였다.
- 5로 조정하여 Muller-Hinton agar (Merck, Germany)에 도말하였다. 여기에 검사 항생제 disk를 고착하여 35℃에서 16-18시간 배양한 후 증식억제환생성유무 및 크기로 항생제 감수성을 판독하였다. 항생제 disk는 Becton Dickinson (BBL Sensi-Disk) 제품을 사용하였다.
- 여기에 액체배지에서 전배양한 시험균주 5 μL를접종하여 35℃에서 18시간 정치배양한 후 균 증식여부는 육안으로 확인하여 MIC를 측정하였다.
- 이 유전자가 ampicillin을 분해하는 유전자의 가능성이 있어 이 유전자의 결손균주는 재료 및 방법에 제시한 방법에 의하여 작성하였다. 유전자 결손여부는 PCR과 Southern hybridization으로 확인하였다. 결손균주는 VPA0477 유전자 내부가 517 bp 결손된 결과 야생형균주에 비해 PCR 증폭산물의 크기가 작으며, Southern hybridization에서 probe와 반응한 단편의 크기도 작게 나타났다 (Fig.
대상 데이터
- 실험에 사용한 균주는 2008년 전북 부안군 곰소만의 표층 해수에서 분리하여 장염비브리오로 동정된 28개 균주를 사용하였다. 균주 동정은 API 20E kit (Biomerieux, France)를 사용하였다.
- DNA는 GS Gene Linker UV chamber (Bio-Rad, USA)로 고정하였으며, hybridization은 42℃의 수조에서 하룻밤 실시하여 phosphatase-labeled anti-DIG monoclonal 항체 (Boehringer Mannheim, Germany)로 검출하였다. 필름은 TQX-120 Automatic Film Processor (동양 메디칼시스템(주))로 현상하였다.
- 여기에 검사 항생제 disk를 고착하여 35℃에서 16-18시간 배양한 후 증식억제환생성유무 및 크기로 항생제 감수성을 판독하였다. 항생제 disk는 Becton Dickinson (BBL Sensi-Disk) 제품을 사용하였다.
이론/모형
- Plasmid는 정제하여 BamHI 및 PstI의 제한효소로 절단하여 자살벡터 pYAK1 (Park et al., 2005)의 동일 site에 삽입하고 plasmid는 E. coli SM10λpir (Miller and Mekalanos,1988)에 형질 전환하였다.
- VPA0477 유전자 결손균주의 작성은 Park et al. (2005)이사용한 방법에 준하여 실시하였다. 사용한 primers의 서열은 다음과 같다: M1 (5`-GGATCCAACAGTGGTTAGAGT-3`),M2 (5`-ATCTTCCATCAAGGTTGTCCAT GTCGCTTA-3`),M3 (5`-TAAGCGACATGGACAACCTTG ATGGAAGAT-3`)및 M4 (5`-CTGCAGTTCGAGCTTAACTT T-3`).
- 항생제 감수성 시험은 Acar and Goldstein (1991)의 disk diffusion법으로 검사하였다. 시험균주는 LB (NaCl 3%) broth에 접종하여 35℃에서 하룻밤 배양한 균을 생리식염수로 2회 세정하고 농도를 McFarland 0.
성능/효과
- 해수에서 분리한 장염비브리오 28개 균주를 대상으로 13종의 항생제에 대한 감수성을 디스크 확산법으로 측정한 결과는 Table 1과 같다. Ampicillin을 제외한 나머지 12종의 항생제에 대해서는 실험에 사용한 28개 균주 모두 감수성을 나타낸 반면 ampicillin에 대해서는 모든 균주에서 내성을 나타내었다. 이는 ampicillin 이외의 항생제에 대한 분해 유전자 또는 배출 기구는 없는 결과라 사료된다.
- VPA0477 유전자가 암피실린 내성에 직접적으로 관여하고 있지만 본 실험에서 작성한 결손균주는 8번 균주에 국한된 결과이기 때문에 8번 이외의 다른 균주에서는 VPA0477 유전자 이외에도 암피실린 내성에 관여하는 다른 유전자가 존재할 가능성은 있다고 사료된다. 하지만 8번 균주의 암피실린에 대한 MIC는 2,048 μg/mL로 실험에 사용한 다른 균주의 암피실린에 대한 MIC와 비교했을 때 동일하거나 약간 높기 때문에 8번 이외의 다른 균주에 VPA0477 이외의 암피실린 내성 유전자가 존재 할 가능성은 낮다고 판단된다.
- 유전자 결손여부는 PCR과 Southern hybridization으로 확인하였다. 결손균주는 VPA0477 유전자 내부가 517 bp 결손된 결과 야생형균주에 비해 PCR 증폭산물의 크기가 작으며, Southern hybridization에서 probe와 반응한 단편의 크기도 작게 나타났다 (Fig. 1A와 B). 이 결과는 VPA0477 유전자 결손이 성공적으로 이루어진 결과로 판단된다.
- 2008년 6월부터 10월까지 전북 부안군 곰소만의 표층해수에서 분리한 장염비브리오 28개 균주를 대상으로 TDH 및 TRH 유전자 존재유무는 각 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 PCR로 검토하였다. 그 결과 28개 모든 균주에서 이들 병원성 유전자는 증폭되지 않았다(Table 2). 또한 사람과 토끼의 적혈구를 2% 첨가한 배지를 사용하여 용혈능을 검토하였는데 모든 균주에서 용혈능은관찰되지 않았다 (결과 미제시).
- 그 결과 VPA0477 유전자 결손균주의 암피실린에 대한 MIC는 1.0 μg/mL 이하로 암피실린 감수성으로 나타났다 (Table 3).
- 그 결과 28개 모든 균주에서 이들 병원성 유전자는 증폭되지 않았다(Table 2). 또한 사람과 토끼의 적혈구를 2% 첨가한 배지를 사용하여 용혈능을 검토하였는데 모든 균주에서 용혈능은관찰되지 않았다 (결과 미제시). 이 결과는 실험에 사용된 해수유래 장염비브리오 28개 균주는 TDH 및 TRH 유전자를 보유하지 않은 해수에서 흔하게 분리되는 비병원성 장염비브리오로 확인되었다.
- 본 연구에서는 해수 분리 장염비브리오 28개 균주를 대상으로 각종 항생제 내성 양상을 파악한 결과 암피실린에는 모든 균주가 내성을 나타내는 반면 그 이외의 12종의 항생제에는 감수성을 나타내었다. 따라서 암피실린 분해유전자를 동정하기 위하여 다른 세균에서 보고되어 있는 암피실린 분해유전자인 β-lactamase와 상동성이 있는 VPA0477 유전자 결손균주를 작성하여 암피실린에 대한 내성변화를 검토하였다.
- 이 결과는 VPA0477 유전자 결손이 성공적으로 이루어진 결과로 판단된다. 유전자 결손에 따른 균 증식 속도를 야생형과 비교한 결과 양 균주에서 차이가 나타나지 않아 VPA0477 유전자는 균 증식에는 직접적으로 관여하지 않음을 시사한다 (결과 미제시). 결손균주의 암피실린에 대한 내성변화는 MIC로 측정하였다.
- 또한 사람과 토끼의 적혈구를 2% 첨가한 배지를 사용하여 용혈능을 검토하였는데 모든 균주에서 용혈능은관찰되지 않았다 (결과 미제시). 이 결과는 실험에 사용된 해수유래 장염비브리오 28개 균주는 TDH 및 TRH 유전자를 보유하지 않은 해수에서 흔하게 분리되는 비병원성 장염비브리오로 확인되었다.
후속연구
- 하지만 8번 균주의 암피실린에 대한 MIC는 2,048 μg/mL로 실험에 사용한 다른 균주의 암피실린에 대한 MIC와 비교했을 때 동일하거나 약간 높기 때문에 8번 이외의 다른 균주에 VPA0477 이외의 암피실린 내성 유전자가 존재 할 가능성은 낮다고 판단된다. 장염비브리오에 암피실린 내성관련 유전자로 VPA0477 유전자만 존재한다면 균주에 따라 MIC가 다른 이유는 VPA0477 유전자의 일부 염기 변이에 의한 아미노산 치환에 따른 활성저하 또는 전사 및 번역과정중의 문제 때문인 것으로 사료되기에 차후 검토가 필요하다고 판단된다
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