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해수 및 시판 수산물에서 분리한 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)의 항균제 내성 및 최소발육억제농도의 규명
Antimicrobial Resistance and Minimum Inhibitory Concentrations of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Commercial Fisheries 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.52 no.6, 2019년, pp.587 - 595  

조의동 (군산대학교 식품생명공학과) ,  김희대 (충북도립대학 바이오생명의약과) ,  박권삼 (군산대학교 식품생명공학과)

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Eighty-three Vibrio parahaemolyticus isolates from surface seawater in Gomso Bay on the west coast of Korea, and commercial fisheries from Gunsan fisheries center were analyzed for the presence of virulence genes and susceptibility to 30 different antimicrobials. All 83 isolates were examined for th...

주제어

표/그림 (6)

AI 본문요약
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제안 방법

  • 0°C에서 18-24시간 배양하였다. TCBS 배지에서 장염비브리오균으로 추정되는 전형적인 2-3 mm 크기의 청록색 집락을 대상으로 toxR (Kim et al., 1999) 및 hns (No et al., 2011) 유전자의 존재 유무를 PCR (polymerase chain reaction) assay로 확인하였으며 두 유전자 존재가 확인된 균주에 한하여 최종적으로 장염비브리오균으로 동정하였다. 동일 균주의 중복 분리를 배제하기 위하여 하나의 시료에서는 단일 균주의 장염비브리오균만을 분리하였다.
  • TDH, TRH, toxR 및 hns 유전자 증폭을 위한 PCR 조건은 95°C에서 3분간 1회 열 변성 후 95°C 30초, 55°C 30초, 72°C 30초를 한 단위로 하여 이를 30회 반복하여 DNA를 증폭하였다.
  • 곰소만해역의 표층 해수 및 시판 수산물에서 분리한 장염비브리오균 83균주를 대상으로 항균제에 대한 감수성 여부를 확인하기 위하여 30종의 항균제를 사용하여 디스크확산법으로 측정하였으며 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 30종의 항균제 중 11종의 항균제는 83균주 전부 또는 일부 균주에서 내성을 나타낸 반면 나머지 19종의 항균제는 모든 균주에서 감수성을 나타내었다.
  • 멸균된 Muller Hinton broth (Merck, Germany)에 2,048 µg/mL에서 1 µg/mL까지 절반씩 농도를 달리한 항균제를 첨가한 후 멸균된 소형시험관에 각 농도의 항균제가 첨가된 배지를 2 mL씩 분주하였다.
  • 식염 3% 첨가된 LB broth에 시험 균주를 접종하여 35±1.0°C에서 하룻밤 진탕 배양 후 멸균 생리식염수로 2회 세정하고 농도를 McFarland No. 0.5로 조정하여 두께 0.4 mm의 Muller Hinton agar (Merck, Germany) 평판에 균을 도말 하였다.
  • 여기에 검사 항균제 디스크를 고착하여 35±1.0°C에서 16시간 배양 후 각 항균제에 의해 형성된 생육저지환의 크기를 측정하고 표준 지표에 따라 감수성 여부를 평가하였다.
  • 여기에 식염이 3% 첨가된 LB broth에서 하룻밤 전 배양한 시험균액 3 µL을 접종하여 35±1.0°C에서 16-18시간 정치 배양한 후 균 증식 여부는 육안으로 확인하여 최소발육억제농도를 측정하였다.
  • 항균제 내성균의 실태 파악 및 수산물의 안전성 확보를 위하여 장염비브리오균의 각종 항균제 내성 및 내성 항균제에 대한 최소발육억제농도에 대한 기초자료의 축척은 절실히 필요하다. 이를 위하여 전북 곰소만해역의 표층 해수 및 군산수산물센터의 시판 수산물에서 분리한 총 83균주의 장염비브리오균을 대상으로 항균제 내성 양상 및 내성 항균제에 대한 최소발육억제농도를 검토하였다.
  • , 2011)는 다른 조건은 동일하나 extension 시간을 72°C에서 1분간 실시한 점이 다르다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 Vilber Lourmat (Bio-Paint ST4, France)사 Gel-Doc system으로 확인하였다.
  • 해수 및 시판 수산물 유래 장염비브리오균의 항균제 내성 양상 및 최소발육억제농도를 검토하기 위하여 2018년 6월부터 10월까지 전북 곰소만해역의 5개 지점(Fig. 1 및 Table 1)에서 매월 1회 총 25개 해수 시료에서 24균주의 장염비브리오균을 분리하였다.

대상 데이터

  • 곰소만 표층 해수는 선박을 이용하여 채수기로 멸균채수병에 채수하였으며, 시판 수산물은 구입 후 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 10°C 이하로 유지하면서 실험실로 옮겨 사용하였다.
  • 동정이 완료된 장염비브리오균은 Luria-Bertani (tryptone 1%, yeast-extract 0.5%, NaCl 3%) broth에 배양 후 최종 농도 15%가 되도록 멸균된 글리세린을 첨가하여 cryovial storage box (Simport, Canada)에 넣어 -80°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
  • 1 및 Table 1)에서 매월 1회 총 25개 해수 시료에서 24균주의 장염비브리오균을 분리하였다. 또한 2018년 8월부터 12월까지 군산수산물센터에서 구입한 각 15시료의 바지락 및 백합에서 12균주 및 13균주, 25시료의 전어에서 19균주, 각 8시료의 굴, 멍게 및 소라에서 각각 5균주 총 79시료에서 59균주의 장염비브리오균을 분리하였다. 장염비브리오균의 분리는 식품공전에서 제시하는 방법에 따라 실시하였으며 동정은 생화학적 시험 및 유전학적 방법 즉, toxR (Kim et al.
  • , 2011) 유전자의 존재 유무로 확인하였으며 두 유전자를 보유하는 균주는 최종적으로 장염비브리오균으로 동정하였다. 생화학적 시험에서는 장염비브리오균으로 확인되었지만 toxR 및 hns 유전자의 증폭이 확인되지 않았거나 애매한 결과를 나타낸 4균주를 제외한 나머지 83균주에서는 toxR 및 hns 유전자의 예상 DNA 증폭 산물과 동일한 크기의 DNA 단편이 확인되어 실험에 사용하였다(결과 미제시). 장염비브리오균의 대표적인 병원성 유전자인 TDH 및 TRH 유전자의 보유성을 PCR assay로 검토한 결과, 표준균주에서는 병원성 유전자의 증폭이 확인된 반면, 분리된 83균주에서는 TDH 또는 TRH 유전자가 증폭되지 않았다(결과 미제시).
  • 시험 항균제는 amikacin (AK; 30 µg), ampicillin (AMP; 10 µg), cefepime (FEP; 30 µg), cefotaxime (CTX; 30 µg), cefotetan (CTT; 30 µg), cefoxitin (FOX; 30 µg), cefuroxime (CXM; 30 µg), ceftriaxone (CRO; 30 µg), cephalothin (KF; 30 µg), cephazolin (KZ; 30 µg), chloramphenicol (C; 30 µg), ciprofloxacin (CIP; 5 µg), clindamycin (CC; 2 µg), erythromycin (E; 15 µg), gentamicin (GN; 10 µg), imipenem (IPM; 10 µg), kanamycin (K; 30 µg), nalidixic acid (NA; 30 µg), nitrofurantoin (F; 100 µg), norfloxacin (NOR; 10 µg), oxacillin (OX; 1 µg), penicillin (P; 10 µg), pipemidic acid (PIP; 20 µg), rifampin (RD; 5 µg), streptomycin (S; 10 µg), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT; 23.75/1.25 µg), tetracycline (TE; 30 µg), ticarcillin (TIC; 75 µg), trimethoprim(W; 5 µg), vancomycin (VA; 30 µg) 등 30종의 항균제 디스크 를 사용하였다.
  • 실험에 사용한 DNA 증폭용 primers의 염기서열 및 증폭 DNA 크기 등은 Table 2에 나타내었으며, primers는 Bioneer (Daejon, Korea)에서 합성하였다. TDH, TRH, toxR 및 hns 유전자 증폭을 위한 PCR 조건은 95°C에서 3분간 1회 열 변성 후 95°C 30초, 55°C 30초, 72°C 30초를 한 단위로 하여 이를 30회 반복하여 DNA를 증폭하였다.
  • 실험에 사용한 장염비브리오균은 2018년 6월부터 2018년 10월까지 전북 곰소만해역의 표층 해수에서 분리한 24균주 및 2018년 8월부터 2018년 12월까지 군산수산물센터에서 시판되고 있는 어패류에서 분리한 59균주 및 병원성 유전자 유무를 확인하기 위하여 장염비브리오균 RIMD2210633 (Makino et al., 2003) 및 TH3996 (Park et al., 2000)를 표준 균주로 사용하였다.
  • 항균제 감수성 정도 관리에는 Escherichia coli ATCC 25922와 Staphylococcus aureus ATCC 25923 균주를 사용하였다. 유전자 증폭을 위한 각종 효소는 Takara (Otsu, Japan)사 의 제품, 항균제 디스크는 Becton Dickinson (BBL Sensi-Disk, Sparks, MD, USA)사의 제품 및 각종 항균제는 Sigma (St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.
  • , 2000)를 표준 균주로 사용하였다. 항균제 감수성 정도 관리에는 Escherichia coli ATCC 25922와 Staphylococcus aureus ATCC 25923 균주를 사용하였다. 유전자 증폭을 위한 각종 효소는 Takara (Otsu, Japan)사 의 제품, 항균제 디스크는 Becton Dickinson (BBL Sensi-Disk, Sparks, MD, USA)사의 제품 및 각종 항균제는 Sigma (St.

이론/모형

  • 각종 항균제에 대한 분리 균주의 감수성은 Acar and Goldstein(1991)의 디스크확산법으로 시험하였다. 식염 3% 첨가된 LB broth에 시험 균주를 접종하여 35±1.
  • 최소발육억제농도는 미국 NCCLS (2002)에 기초하여 변법으로 측정하였다. 멸균된 Muller Hinton broth (Merck, Germany)에 2,048 µg/mL에서 1 µg/mL까지 절반씩 농도를 달리한 항균제를 첨가한 후 멸균된 소형시험관에 각 농도의 항균제가 첨가된 배지를 2 mL씩 분주하였다.
  • 해수 및 시판 수산물 유래 장염비브리오균의 분리는 식품공전에서 제시한 방법에 준하여 분리하였다(MFDS, 2019). 곰소만 표층 해수는 선박을 이용하여 채수기로 멸균채수병에 채수하였으며, 시판 수산물은 구입 후 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 10°C 이하로 유지하면서 실험실로 옮겨 사용하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
인체에 장염비브리오균 감염 시 잠복기는 얼마인가? 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)은 그람 음성, 무포자 간균의 저도 호염성균으로 해수 또는 기수에서 서식하며 이 균에 오염된 어패류를 생식하거나 불충분하게 가열 처리된 수산물의 섭취를 통해 감염되면 일반적으로 4-96시간의 잠복기를 거쳐 발병하는데 주로 복통, 설사, 구토, 오한 및 미열 등을 동반하는 급성위장염 증상을 유발하는 식중독 원인세균이다 (Takeda, 1988; Honda and Iida, 1993; Zhang and Orth, 2013). 식품의약품안전처 식품안전정보포털의 식중독통계에 의하면 2009년부터 2018년까지 최근 10년간 우리나라에서 발생한 장염비브리오균에 의한 식중독 사고는 6월에서 10월 사이의 하절기에 집중적으로 발생하였으며 발생건수 및 환자수는 전체 세균성 식중독 사고의 9.
장염비브리오균이란 무엇인가? 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)은 그람 음성, 무포자 간균의 저도 호염성균으로 해수 또는 기수에서 서식하며 이 균에 오염된 어패류를 생식하거나 불충분하게 가열 처리된 수산물의 섭취를 통해 감염되면 일반적으로 4-96시간의 잠복기를 거쳐 발병하는데 주로 복통, 설사, 구토, 오한 및 미열 등을 동반하는 급성위장염 증상을 유발하는 식중독 원인세균이다 (Takeda, 1988; Honda and Iida, 1993; Zhang and Orth, 2013). 식품의약품안전처 식품안전정보포털의 식중독통계에 의하면 2009년부터 2018년까지 최근 10년간 우리나라에서 발생한 장염비브리오균에 의한 식중독 사고는 6월에서 10월 사이의 하절기에 집중적으로 발생하였으며 발생건수 및 환자수는 전체 세균성 식중독 사고의 9.
장염비브리오균이 생산하는 대표적인 병원성 인자는 무엇인가? 장염비브리오균에 의한 식중독 사고는 과거보다는 다소 감소 추세이나 세균성 식중독 원인세균으로 상위에 자리매김하고 있는 실정이다(MFDS, 2019). 이 균이 생산하는 대표적인 병원성 인자로는 내열성용혈독소(thermostable direct hemolysin, TDH), 내열성용혈독 관련 용혈독소(TDH-related hemolysin, TRH), type III secretion systems (T3SS 1 및 2)를 통해 분비되는 각종 effector 단백질 및 type VI (T6SS) secretion systems 등이 보고되어 있으나 정확한 병원성 메커니즘에 관한 설명은 아직도 부족한 실정이다(Honda and Iida, 1993; Park et al., 2000; Park et al.
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