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문제 정의
- 본 논문에서는 세포 호흡량 측정용 다채널 측정 시스템 개발 및 그 특성을 평가하였다. 개발한 측정 시스템은 정확한 세포의 산소 호흡량 측정을 위해 항온을 유지하며 Clark-type 센서에 −0.
가설 설정
- 1 M까지의 다양한 측정 용액을 사용하여 몰농도와 측정전류 간의 상관계수를 측정하였다[14]. 응답속도의 측정 결과에 따라 전류 150 nA를 산소농도 100 %, 20 nA를 산소농도 0%라고 가정하였다. 측정한 결과는 Fig.
제안 방법
- Clark-type 센서의 구동전압은 proportional 제어 방법을 이용하여 오차범위 ±0.01 V 이내로 인가될 수 있도록 프로그래밍하였고, 온도는 설정 온도와 비교하여ㅡ±0.1℃ 이내로 온도가 유지될 수 있도록 프로그래밍하였다.
- 온도측정 프로그램은 측정시스템의 전 과정에서 전류 측정과 무관하게 실시간으로 측정이 가능해야 하기 때문에, 독립루프문으로 프로그램을 구성하였다. Clark-type 센서의 온도를 측정한 후 측정 온도의 결과를 설정온도와 비교하여 그 결과에 따라 쿨러와 히터를 상호 배제적으로 구동시킨다. 측정온도와 설정온도를 일치시키기 위해 쿨러와 히터가 1회 작동한 후에 다시 Clark-type 센서의 온도측정 과정을 반복한다[10,11].
- Na2SO3는 물에 들어있는 용존 산소를 제거하기 때문에 산소센서 내 용존 산소의 환원반응이 줄어들어, 작업 전극과 상대 전극을 통해 흐르는 전류가 감소한다[12]. Na2SO3를 투여하여 전류가 최소로 줄어드는 양의 90 %까지 걸리는 시간을 응답시간으로 정의하였고 4회 반복하여 응답시간을 측정하였다[13]. Fig.
- Uncoupled OCR (oxygen consumption rate)에 대한 coupled OCR의 비로 세포의 호흡량을 판단하기 때문에 전자전달계와 산화적 인산화 과정을 거쳐 ATP(adenosine-5'-triphosphate)를 형성하는 세포호흡 상태인 coupling 상태에서 FCCP(carbonylcyanide p-trifluoroume thoxyphenyl hydrazone, uncoupler)를 투여하여 전자전달계와 산화적 인산화 과정을 방해 받는 uncoupling 상태로 만들어 세포 호흡량 변화를 측정하였다[17].
- 또한 용존 산소량을 측정할 수 있는 전기화학적 측정법인 amperometry와 세포의 활성을 유지시키기 위해 히터와 온도 컨트롤러를 사용하였다. 개발된 시스템을 이용하여 전압 인가 및 전압의 변화 측정, 용존 산소 농도에 따른 전류 측정 및 이에 대한 평가와 분석을 수행하였다. 또한 개발된 측정 시스템과 상용화 제품인 Oxygraph-2k를 이용하여 동일한 조건에서의 세포 호흡량을 측정한 뒤 비교 분석하여 개발된 시스템의 성능을 검증하였다.
- 개발한 용존 산소센서 측정 시스템을 이용한 세포 호흡량 측정 실험을 통해 상용화 제품(Oxygraph-2k)과 동일한 측정 능력을 가지는지 실험하였다. 개발한 측정 시스템에 Clark-type 센서 여섯 개를 장착하고[1] 온도 컨트롤 모듈을 이용하여 온도를 37℃로 유지시킨 후, 세포(L6 rat skeletal muscle, 1.
- 개발한 측정 시스템에 Clark-type 센서 여섯 개를 장착하고[1] 온도 컨트롤 모듈을 이용하여 온도를 37℃로 유지시킨 후, 세포(L6 rat skeletal muscle, 1.5×106 cells/200 µl)를 상용화 제품과 개발한 측정 시스템에 각각 동시에 주입하여 세포의 호흡량을 측정하였고 이에 대한 결과를 비교 분석하였다.
- 개발한 측정 시스템은 정확한 세포의 산소 호흡량 측정을 위해 항온을 유지하며 Clark-type 센서에 −0.8 V 전압을 일정하게 인가하고 용존 산소의 환원 전류를 측정할 수 있도록 구성하였다.
- 측정온도와 설정온도를 일치시키기 위해 쿨러와 히터가 1회 작동한 후에 다시 Clark-type 센서의 온도측정 과정을 반복한다[10,11]. 구성한 온도제어 프로그램을 이용하여 인간의 몸의 정상 온도인 약 37 ℃를 유지하도록 설정하고 온도를 측정하였다. 온도제어시작 후, 약 500초 후부터 ±0.
- 개발된 시스템을 이용하여 전압 인가 및 전압의 변화 측정, 용존 산소 농도에 따른 전류 측정 및 이에 대한 평가와 분석을 수행하였다. 또한 개발된 측정 시스템과 상용화 제품인 Oxygraph-2k를 이용하여 동일한 조건에서의 세포 호흡량을 측정한 뒤 비교 분석하여 개발된 시스템의 성능을 검증하였다.
- 으로 구성하였다. 또한 용존 산소량을 측정할 수 있는 전기화학적 측정법인 amperometry와 세포의 활성을 유지시키기 위해 히터와 온도 컨트롤러를 사용하였다. 개발된 시스템을 이용하여 전압 인가 및 전압의 변화 측정, 용존 산소 농도에 따른 전류 측정 및 이에 대한 평가와 분석을 수행하였다.
- 산소센서의 산소농도가 포화상태(267 µmol/l)일 때 산소농도를 측정한후, 산소센서 내부의 산소를 제거할 수 있는 Na2SO3를 0.001 M에서 0.1 M까지의 다양한 측정 용액을 사용하여 몰농도와 측정전류 간의 상관계수를 측정하였다[14].
- 세포의 호흡량 측정을 위한 다채널 측정 시스템은 NI(national instrument, USA)측정 장비들과 호환성 및 확장성이 용이하여 여러 분야에 사용되고 있는 LabVIEW 프로그램[5]으로 구성하였다. 또한 용존 산소량을 측정할 수 있는 전기화학적 측정법인 amperometry와 세포의 활성을 유지시키기 위해 히터와 온도 컨트롤러를 사용하였다.
- 센서의 응답시간은 산소 포화상태(267 µmol/l)인 물을 Clark-type 센서 측정 영역에 넣고, 물속의 용존 산소를 제거하는 Na2SO3를 투여한 뒤 측정전류의 변화로 측정 하였다.
- . 온도측정 프로그램은 측정시스템의 전 과정에서 전류 측정과 무관하게 실시간으로 측정이 가능해야 하기 때문에, 독립루프문으로 프로그램을 구성하였다. Clark-type 센서의 온도를 측정한 후 측정 온도의 결과를 설정온도와 비교하여 그 결과에 따라 쿨러와 히터를 상호 배제적으로 구동시킨다.
- 전기화학적 측정 장치 또한 상용화된 제품들이 많지만 고가이고 여러 샘플을 동시에 측정할 수 없는 단일 채널 형태가 대부분이고 다중 채널 측정이 가능하다고 하더라도 기준전극과 상대전극을 공통으로 사용하기 때문에 각 센서들의 측정 결과에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 단점들을 보완하여 기존의 상용화 제품들과 비교하여 저렴한 비용으로 유사한 측정 능력을 가지면서 최대 6개까지 샘플을 동시에 측정할 수 있는 다중 채널 형태이면서 세포의 활성을 유지할 수 있는 온도 제어 능력과 세포의 호흡량을 측정할 수 있는 시스템을 구성하였다.
- 제작한 산소센서 측정 시스템을 이용하여 Na2SO3의 몰농도와 측정전류 간의 상관계수를 측정함으로써, 센서의 선형도(linearity)를 평가하였다. 산소센서의 산소농도가 포화상태(267 µmol/l)일 때 산소농도를 측정한후, 산소센서 내부의 산소를 제거할 수 있는 Na2SO3를 0.
- 컨트롤부는 PC와 LabVIEW 구동 프로그램으로 구성되어 있으며, amperometry 측정부와 온도 제어부를 제어하고 측정 데이터를 모니터에 보여주는 동시에 데이터를 파일로 저장하고 분석하는 툴을 제공한다. 컨트롤부의 LabVIEW 구동 프로그램은 각각의 센서에 구동전압을 일정하게 유지하고 인가된 전압을 측정하며, 8개 센서의 전류 측정과 온도 측정 및 제어를 한다. 구동 프로그램의 알고리즘은 Fig.
대상 데이터
- 센서의 전류 측정 동안의 온도 변화를 측정하기 위해 상용 온도센서인 PT100을 사용하였다[9]. 온도측정 프로그램은 측정시스템의 전 과정에서 전류 측정과 무관하게 실시간으로 측정이 가능해야 하기 때문에, 독립루프문으로 프로그램을 구성하였다.
데이터처리
- 반대로 P-gain 값이 작으면 안정된 상태에 이르는 시간은 느리지만, 안정된 상태에서의 전압 진폭이 작아 비교적 안정적이다. P-gain 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9 값에 따라 구동전압이 안정된 상태에 이르는 시간과 안정된 상태에 이른 후의 구동전압 변화를 측정하였고 안정된 상태에 이른 후의 구동전압의 표준편차를 구하였다. Pgain의 크기에 따라 전압이 안정된 상태까지 걸리는 시간을 Fig.
- 제작된 측정 시스템의 성능을 평가하기 위해 동일한 Clark-type 센서를 이용하여 상용 potentiostat 장비인 EIS300(potentiostat, gamry instrument, USA)와 제작한 측정 시스템 장비의 응답시간 및 선형도를 비교하였다. 센서의 응답시간은 산소 포화상태(267 µmol/l)인 물을 Clark-type 센서 측정 영역에 넣고, 물속의 용존 산소를 제거하는 Na2SO3를 투여한 뒤 측정전류의 변화로 측정 하였다.
이론/모형
- Amperometry에서 작업 전극과 상대 전극 사이에 일정한 구동전압을 인가하기 위해 proportional 제어 방법을 사용하였다. Proportional 제어는 기준 전압값에 대한 현재 전압값의 차이에 적당한 P-gain(proportional gain)을 곱하여 원하는 전압값을 만드는 방법이다[7].
성능/효과
- 7은 Na2SO3를 4회 반복 투여하여 측정한 결과이다. Na2SO3투입 전(산소 포화상태) 측정된 약 150 nA의 전류가 투입 후(산소 제거상태)에는 20 nA로 감소하였고, 4회 측정한 결과, 23초에서 29초사이의 응답시간을 얻었다. Table 2는 potentiostat과 산소측정 시스템 간의 응답시간을 보이며, 두 시스템 모두 평균 응답시간이 약 25.
- 10은 상용화 제품인 Oxygraph2k에서 측정한 세포의 호흡량 결과 그래프이다. Table 3에 나타나 있는 것과 같이 개발한 측정 시스템을 이용하여 얻은 여섯 개의 Clark-type 센서의 uncoupled OCR/coupled OCR의 평균은 약 1.35이고 상용화 제품인 Oxygrph-2k를 이용하여 얻은 uncoupled OCR/coupled OCR의 평균은 약 1.45이다. 두 시스템의uncoupled OCR/coupled OCR의 차이 값은 약 0.
- 45이다. 두 시스템의uncoupled OCR/coupled OCR의 차이 값은 약 0.1로 차이는 약 0.1로 제작한 세포 호흡량 측정용 다채널 측정 시스템은 상용화 제품과 유사한 감도를 가지고 있는 것을 이 실험 결과를 통해 확인할 수 있었다.
- 92를 얻었고, 상용 potentiostat으로 측정한 결과와 유사함을 확인하였다. 또한, 개발한 측정 시스템과 상용화 제품에서 얻은 세포의 산소 호흡량의 uncoupled OCR에서 coupled OCR을 나눈 값의 차이가 약 0.1일 정도로 상용화 제품만큼의 뛰어난 측정능력을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 현재 나와있는 상용화 제품들이 최대 2개의 센서에서 세포의 호흡량을 측정할 수있지만 개발한 측정 시스템은 최대 여섯 개의 채널에서 세포의 호흡량을 동시에 정확하게 측정 할 수 있기 때문에 측정의 효율성 또한 높일 수 있다.
- 1℃ 이내로 온도가 유지될 수 있도록 프로그래밍하였다. 또한, 개발한 측정 시스템을 이용하여 응답속도와 선형 상관계수를 측정한 결과, 응답시간은 25.5초, 선형상관계수는 0.92를 얻었고, 상용 potentiostat으로 측정한 결과와 유사함을 확인하였다. 또한, 개발한 측정 시스템과 상용화 제품에서 얻은 세포의 산소 호흡량의 uncoupled OCR에서 coupled OCR을 나눈 값의 차이가 약 0.
- 는 각각 X(몰농도)와 Y(측정전류)의 평균값이고 s와 s'는 각각의 표준편차이다. 제작한 시스템과 potentiostat 장비로 측정한 결과값을 이용한 선형상관계수는 각각 0.92와 0.96이고, 약 0.04만큼 낮은 값을 보였다.
후속연구
- 현재 나와있는 상용화 제품들이 최대 2개의 센서에서 세포의 호흡량을 측정할 수있지만 개발한 측정 시스템은 최대 여섯 개의 채널에서 세포의 호흡량을 동시에 정확하게 측정 할 수 있기 때문에 측정의 효율성 또한 높일 수 있다. 향후에 콜레스테롤 센서, 글루코스 센서 등 다양한 전기화학 센서 측정 시스템에 응용 가능할 것으로 예상된다.
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