CATTS를 이용한 저곡해충 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)의 소독 효과 Control Effect of a Stored Grain Insect Pest, Tribolium castaneum, by 'CATTS' Postharvest Treatment원문보기
친환경 소독 기술인 환경조절열처리(CATTS: controlled atmosphere and temperature treatment system)는 메틸브로마이드 훈증제 처리의 대체 기술로 사용되어 왔다. 본 연구는 저장 곡물 해충인 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)를 CATTS를 통해 저장 기간 중 방제가 가능한 지를 알아보기 위해 시도되었다. 거짓쌀도둑거저리의 성충은 $46^{\circ}C$에서 열충격 감수성을 보였으며 여기에 CA 조건(15% 이산화탄소, 1% 산소)은 감수성을 현격하게 증가시켰다. CATTS 조건($46^{\circ}C$, 15% 이산화탄소 1% 산소)에서 120 분간 노출시켰을 때 유충(초기, 중기, 말기)과 성충 모두 100% 살충율을 나타냈다. CATTS 처리에 대한 감수성이 거짓쌀도둑거저리 발육 시기에 띠라 상이했고 말기 유충에서 높은 내성을 보였다. 거젓쌀도둑거저리 열충격단백질의 발현이 CATTS에 대한 내생과 관련이 있는 것으로 나타났다.
친환경 소독 기술인 환경조절열처리(CATTS: controlled atmosphere and temperature treatment system)는 메틸브로마이드 훈증제 처리의 대체 기술로 사용되어 왔다. 본 연구는 저장 곡물 해충인 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)를 CATTS를 통해 저장 기간 중 방제가 가능한 지를 알아보기 위해 시도되었다. 거짓쌀도둑거저리의 성충은 $46^{\circ}C$에서 열충격 감수성을 보였으며 여기에 CA 조건(15% 이산화탄소, 1% 산소)은 감수성을 현격하게 증가시켰다. CATTS 조건($46^{\circ}C$, 15% 이산화탄소 1% 산소)에서 120 분간 노출시켰을 때 유충(초기, 중기, 말기)과 성충 모두 100% 살충율을 나타냈다. CATTS 처리에 대한 감수성이 거짓쌀도둑거저리 발육 시기에 띠라 상이했고 말기 유충에서 높은 내성을 보였다. 거젓쌀도둑거저리 열충격단백질의 발현이 CATTS에 대한 내생과 관련이 있는 것으로 나타났다.
A postharvest treatment called CATTS (controlled atmosphere and temperature treatment system) has been used as an alternative nonchemical measure for methyl bromide fumigant treatment. This study applied CATTS to control the red flour beetle, Tribolium castaneum, infesting stored grains. Adults of T...
A postharvest treatment called CATTS (controlled atmosphere and temperature treatment system) has been used as an alternative nonchemical measure for methyl bromide fumigant treatment. This study applied CATTS to control the red flour beetle, Tribolium castaneum, infesting stored grains. Adults of T. castaneum were susceptible to $46^{\circ}C$ heat treatment. The susceptibility was further enhanced by addition of CA conditions (15% $CO_2$ and 1% $O_2$). When CATTS ($46^{\circ}C$, 15% $CO_2$, $16^{\circ}C/h$ treating rate) was applied to different developmental stages of T. castaneum, it showed 100% control efficacy by 120 min exposure. There was a variation in CATTS susceptibility among developmental stages, in which late instar larvae were most tolerant. Heat shock proteins of T. castaneum appeared to be implicated in the tolerance of CATTS.
A postharvest treatment called CATTS (controlled atmosphere and temperature treatment system) has been used as an alternative nonchemical measure for methyl bromide fumigant treatment. This study applied CATTS to control the red flour beetle, Tribolium castaneum, infesting stored grains. Adults of T. castaneum were susceptible to $46^{\circ}C$ heat treatment. The susceptibility was further enhanced by addition of CA conditions (15% $CO_2$ and 1% $O_2$). When CATTS ($46^{\circ}C$, 15% $CO_2$, $16^{\circ}C/h$ treating rate) was applied to different developmental stages of T. castaneum, it showed 100% control efficacy by 120 min exposure. There was a variation in CATTS susceptibility among developmental stages, in which late instar larvae were most tolerant. Heat shock proteins of T. castaneum appeared to be implicated in the tolerance of CATTS.
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문제 정의
본 연구는 CATTS 소독 처리 기술이 저장곡물에 가해를 주는 거짓쌀도둑거저리를 방제 가능 여부를 결정하기 위해 수행되었다 CATTS 처리에서 사용되는 46℃ 조건은 거짓쌀도둑거저리에 대해 노출시간에 비례하여 살충력을 증가시켰으며, 발육시기에 따라 차이를 보였다. 반면에 CO2 농도 15%, 02 농도 1%를 결부한 CA 조건에서 열처리효과는 극대화되었다.
, 2006). 본 연구는 COi 농도를 15%로 유지하고 저산소(1%) 상태를 보강한 CA 조건에서 열처리가 거짓쌀도둑거저리 방제에 가능한 지에 대한 CATTS 기술을 검정하기 위해 거짓쌀도둑거저리의 다양한 발육시기에 대해 가장 감수성이 낮은 시기를 분석하고 CATTS 처리를 적용하여 유효 노출 시간을 결정했다. 또한 CATTS 처리에 의한 거짓쌀도둑거저리의 내성을 생리적으로 설명하기 위해 스트레스 노출에 대한 생리적 회복과 관련이 있는 열충격단백질의 발현을 분석흐卜 였다
제안 방법
CATTS 처리 후 25℃에서 24시간 경과 후 죽은 유충과 살아있는 유충을 각각 한 마리씩 선별하여 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 추출은 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 사용 설명서에 따랐다.
GenBank에 등록된 거짓쌀도둑거저리 hsp90 (EF633444)과 hsp70 (AY769606)의 염기서열을 이용하여 각각의 특정 프라이머를 제작하였다. 합성된 단일 가닥 cDNA을 사용화여 hsp90 (5'-TCGCAGTTCATTGGCTATCC-3', 5顷CTT CCGAATCGACGACACC3)과 hsp70 (5'-TGCAGCAG CCATTGCITACG-3', 5, -AGTOjAACCAOCA4CGAGCAC-3') 의 유전자 특이적 프라이머로 PCR 증폭을 실시하였다.
합성된 단일 가닥 cDNA을 사용화여 hsp90 (5'-TCGCAGTTCATTGGCTATCC-3', 5顷CTT CCGAATCGACGACACC3)과 hsp70 (5'-TGCAGCAG CCATTGCITACG-3', 5, -AGTOjAACCAOCA4CGAGCAC-3') 의 유전자 특이적 프라이머로 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응은 94℃ 에서 1분간 변성, 52℃ 에서 45 초간합성, 72℃ 에서 1 분 30 초 연장 조건에서 30 회 반복 수행하였다.
각 1.5 ml 튜브에 거짓쌀도둑거저리 성충을 한 마리씩 넣었고 반복당 30 마리씩 3 반복으로 실험을 수행하였다. 각 곤충을 46℃ 항온수조에서 처리 시간대 별로 나눠서 처리하였고, 처리 후 곤충사육 페트리디쉬(직경 50 mm X 두께 15 mm)에 먹이와 함께 넣어 24시간 후에 생존여부를 확인하였다 치사된 곤충은 핀셋으로 건드려 움직임이 없는 개체로 판단하였다.
5 ml 튜브에 거짓쌀도둑거저리 성충을 한 마리씩 넣었고 반복당 30 마리씩 3 반복으로 실험을 수행하였다. 각 곤충을 46℃ 항온수조에서 처리 시간대 별로 나눠서 처리하였고, 처리 후 곤충사육 페트리디쉬(직경 50 mm X 두께 15 mm)에 먹이와 함께 넣어 24시간 후에 생존여부를 확인하였다 치사된 곤충은 핀셋으로 건드려 움직임이 없는 개체로 판단하였다.
거 짓쌀도둑거 저 리는 밀가루, yeast extract (Scharlau, Barcelona, Spain), trypton (BD, NJ, USA) (100:50:50, g/g)을 먹이로 27±1℃ 에서 16:8 h (L:D)의 광조건으로 사육하였으며, 유충과 성충을 대상으로 생물검정을 하였으며 유충은 3단계로 나누어 초기 발육단계(체장 2-3 mm), 중기 발육단계(4-5 mm), 후기 발육 단계(6-7 mm)로.구분하였다.
거짓쌀도둑거저리의 성충으로 CATTS에서 권장하는 4 6℃ 의 열처리 조건에서 노출 시간별 사망률을 조사하였다 (Fig. 1). 이때 반수치사노출시간(LT50)이 62.
본 연구는 COi 농도를 15%로 유지하고 저산소(1%) 상태를 보강한 CA 조건에서 열처리가 거짓쌀도둑거저리 방제에 가능한 지에 대한 CATTS 기술을 검정하기 위해 거짓쌀도둑거저리의 다양한 발육시기에 대해 가장 감수성이 낮은 시기를 분석하고 CATTS 처리를 적용하여 유효 노출 시간을 결정했다. 또한 CATTS 처리에 의한 거짓쌀도둑거저리의 내성을 생리적으로 설명하기 위해 스트레스 노출에 대한 생리적 회복과 관련이 있는 열충격단백질의 발현을 분석흐卜 였다
매 처리 전 질소를 20 분 동안 투입하여 CATTS 기기 내 Ch 농도를 1%로 낮추었다 이후 COj 밸브를 열고 자동으로 농도가 15%에 이르도록 설정하였다 설정 온도(30℃)에서 인큐베이터 목표 온도(46笆)까지 60 분 동안 온도를 증가시켰고 이때 인공사료 내부 온도는 처리 온도는 44℃ 이었다. 이후 이산화탄소 15%, 산소 1%와 밀가루 내부온도가 44℃ 에 맞춰질 때를 기점으로 30, 60, 90 및 120 분간 거짓쌀도둑거저리를 처리하였다 처리 시간별 사용된 인공사료의 먹이는 5 g이며, 거짓쌀도둑거저리의 수는 발육단계별 초기 유충, 중기 유충, 말기 유충과 성충으로 각처리 시간별로 30 마리씩 3 반복으로 실시하였다.
열처리와 CATTS 처리에 따른 hsp90 과 hsp70의 발현양상을 조사하였다(Fig. 4). 열충격단백질인 hsp90은 항시 발현하는 유전자로서 무처리, 열충격과 CATTS 처리 모두에서 발현하였다 또한 CATTS 처리 후 생존한 개체와 죽은 개체 또한 모두 발현하였다 이에 반해 유도 발현하는 열충격단백질인 hsp70은 무처리와 CATTS 처리 후 죽은 개체에서는 발현되지 않았지만, CAITS 처리 후 생존한 개체에서는 높게 발현되었다.
처리에 의해 억제시키는 데 있다. 이를 증명하기 위해 46℃ 에서 짧은 기간 동안 노출시키고, 15% CO2 및 1% 02 조건에 해충을 노출시켰다(Fig. 2). 처리 후 24 시간이 경과 후에 열처리 단독은 38%의 사망률을 기록한 반면, 열처리와 이산화탄소를 동시에 처리하면 100%의 살충율을보였다.
온도의 순환을 돕기 위해 기기 상부와 하부에 팬(L07 m3/min, Hakko 493, Hakko, Osaka, Japan)을 부착하였다. 이산화탄소 15%와 산소 1%의 농도를 유지하도록 CO 센서(KCD-HP300X, Korea Digital, Seoul, Korea), O2 센서(Model #SS1118, Senko, Seoul, Korea)를 자동 제어장치에 연결하였다.
이후 이산화탄소 15%, 산소 1%와 밀가루 내부온도가 44℃ 에 맞춰질 때를 기점으로 30, 60, 90 및 120 분간 거짓쌀도둑거저리를 처리하였다 처리 시간별 사용된 인공사료의 먹이는 5 g이며, 거짓쌀도둑거저리의 수는 발육단계별 초기 유충, 중기 유충, 말기 유충과 성충으로 각처리 시간별로 30 마리씩 3 반복으로 실시하였다. 처리 후 상온(25℃)에서 24시간 보관 후 생사충수를 조사하였다.
제작된 연구용 CATTS를 바탕으로 밀가루 먹이 내부온도가 44℃ 에 이른 후 노출 시간에 따른 거짓쌀도둑거저리의 방제 효과를 분석하였다(Fig. 3). 거짓쌀도둑거저리의 소독효과는 처리 시간의 증가에 따라 높아지는 경향을 나타냈다.
5 ml 튜브에 한 마리 개체를 넣고 15% g 및 1% 以 조건에서 46℃ 열처리를 60 분간 수행하였다. 처리 후 살충력을 확인하기 위해 곤충 사육 페트리디쉬(직경 50 mm X 두께 15 mm)에 10 마리 씩 옮기고 먹이를 제공하였으며 이후 24 시간이 경과한 후 생사충수를 조사하였다.
이후 이산화탄소 15%, 산소 1%와 밀가루 내부온도가 44℃ 에 맞춰질 때를 기점으로 30, 60, 90 및 120 분간 거짓쌀도둑거저리를 처리하였다 처리 시간별 사용된 인공사료의 먹이는 5 g이며, 거짓쌀도둑거저리의 수는 발육단계별 초기 유충, 중기 유충, 말기 유충과 성충으로 각처리 시간별로 30 마리씩 3 반복으로 실시하였다. 처리 후 상온(25℃)에서 24시간 보관 후 생사충수를 조사하였다.
제작하였다. 합성된 단일 가닥 cDNA을 사용화여 hsp90 (5'-TCGCAGTTCATTGGCTATCC-3', 5顷CTT CCGAATCGACGACACC3)과 hsp70 (5'-TGCAGCAG CCATTGCITACG-3', 5, -AGTOjAACCAOCA4CGAGCAC-3') 의 유전자 특이적 프라이머로 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응은 94℃ 에서 1분간 변성, 52℃ 에서 45 초간합성, 72℃ 에서 1 분 30 초 연장 조건에서 30 회 반복 수행하였다.
데이터처리
모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arcsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다. 반수치사시간(median lethal time: LT50)은 probit 분석법(Raymond, 1985)을 이용하여 산출하였다.
이론/모형
분석을 실시하였다. 반수치사시간(median lethal time: LT50)은 probit 분석법(Raymond, 1985)을 이용하여 산출하였다.
전체 RNA 추출은 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 사용 설명서에 따랐다. 첫 가닥 cDNA는 올리고(dT)i5 프라이머가 포함된 RTpreinix (Intron Bioteclinology, Seoul, Korea)에 의해 20 μ1를 합성하였다.
성능/효과
거짓쌀도둑거저리의 열 충격단백질 발현과 CATTS 처리내성과 연계성을 분석하여 보 본 연구에서는 hsp90은 항시 발현되고 hsp70은 열처리에 대해 조건 발현을 보이는 것으로 나타났다. 이러한 거짓쌀도둑거저리의 hsp70에 대한 결과는 Mahroof et al.
이는 CATTS 처 리후 생존 개체와 치사된 개체를 비교하여 晾70이 생존 개체에서만 발현한다는 결과에서 확인시켜 주었다 일반적으로 열충격단백질은 hsp20, hsp40, hsp60, hsp70, hsp90, hsplOO 및 hspllO으로 구분되며(Gething, 1998; Nover and Scharf, 1997), 이들의 기능은 단백질 수송 신호전달, DNA 복제 및 단백질 구조 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Hartl, 1996). 따라서 본 연구에서 거짓쌀도둑거저리의 hsp70은 열충격에 대해서 이 곤충의 생존에 중요한 여러 단백질의 올바른 구조 형성에 관여하여 CATTS 처리에 대한 회복능력을 부여하는 것으로 추정된다.
43 분)으로 나타났다. 또한 95%를 치사시키는 노출시간(LT95)과 99%를 치사시키는 노출시간(LT99) 은 각각 probit 검정 결과 94.47 분(84.69~ 106.35 분)과 115.42 분(102.87~137.20 분)으로 산출되었다.
4). 열충격단백질인 hsp90은 항시 발현하는 유전자로서 무처리, 열충격과 CATTS 처리 모두에서 발현하였다 또한 CATTS 처리 후 생존한 개체와 죽은 개체 또한 모두 발현하였다 이에 반해 유도 발현하는 열충격단백질인 hsp70은 무처리와 CATTS 처리 후 죽은 개체에서는 발현되지 않았지만, CAITS 처리 후 생존한 개체에서는 높게 발현되었다.
이러한 CA 조건의 상승효과를 바탕으로 상이한 노출시간에 따른 CATTS 처리 효과를 검정하였는 데, 노출시간에 비례하여 치사 효과가 증가했으며, 서로 다른 발육시기에 따라서도 이러한 소독 효과는 차이를 보였다 거짓쌀도둑거저리의 모든 발육시기에 대해서 CATTS 처리 노출시간은 최소 120 분이 소요되어야 하는데 이러한 처리 노출시간은 다른 곤충에 비해 비교적 장시간으로 판단된다. 예를 들어, 코드린나방(C.
2). 처리 후 24 시간이 경과 후에 열처리 단독은 38%의 사망률을 기록한 반면, 열처리와 이산화탄소를 동시에 처리하면 100%의 살충율을보였다.
후속연구
, 2006; Neven and Rehfield-Ray, 2006a, b). 또한 대상작물체로서 사^■, 배, 복숭아, 망고및체리가CATTS 처리에 피해를 보이지 않아, 안전하게 본 기술이 적용될 수 있다. (Yahia, 2000; Neven 2005; Obenland et al.
제시하고 있다. 또한 열충격단백질의 일종인 hsp70이 CATTS 처리에 내성 인자로 작용할 수 있음을 보여 주었다 한편 CATTS 처리 노출시간을 줄이는 기술을 개발하여 작물체에 대한 열충격 효과를 최소화하는 방향으로 연구를 진행할 필요가 있다.
CATTS 처리초기에 내부온도를 46℃ 까지 올리는데 진행된 온도 증가속도는 CATTS 처리 효과에 크게 영향을 준다(Neven, 1998). 본 연구는 16℃/h의 온도 증가 속도로서 12℃~24℃ /h의 타 처리 속도에 비해(Neven et al., 2006) 빠른 편은 아니어서, 처리 온도를 보다 증가시키면서 노출시간을 최소화할 수 있는 기술이 개발될 수 있다.
이상의 결과는 CATTS 소독 처리 기술이 저장곡물을 가해하는 거짓쌀도둑거저리를 방제하기에 적용될 수 있음을 제시하고 있다. 또한 열충격단백질의 일종인 hsp70이 CATTS 처리에 내성 인자로 작용할 수 있음을 보여 주었다 한편 CATTS 처리 노출시간을 줄이는 기술을 개발하여 작물체에 대한 열충격 효과를 최소화하는 방향으로 연구를 진행할 필요가 있다.
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